阳离子脂质体增加造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入
作者：朱元贵 卓光生 陈志哲 胡建达
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所，福州 350001
关键词：寡核苷酸类；反义；脂质体；阳离子；细胞系；白血病；淋巴瘤
福建医科大学学报000203
摘要:目的 观察阳离子脂质体DOSPER介导或Bcl-2反义寡核苷酸G3139直接作用时，造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入，为阳离子脂质体和反义寡核苷酸的进一步应用提供依据。方法 利用异硫氰酸荧光素标记的G3139，流式细胞仪(FCM)测定造血系统恶性肿瘤细胞株HL60、K562、U937、CA46和CEM细胞内的平均荧光强度。结果 G3139直接作用于细胞时，细胞内荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05)；DOSPER介导转染时，各细胞内的荧光强度均显著高于直接转染时(P<0.01)，而且当DOSPER/G3139(μg/μg)为2～3∶1时，转染效率最佳，但此时各细胞间细胞内平均平均荧光强度无明显的差别(P>0.05)。结论 不同造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入不同，阳离子脂质体DOSPER可普遍提高细胞对G3139的摄入。
, http://www.100md.com
中图分类号:R733.7;R977 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0100-03
Oligodeoxynucleotide Uptake in Human Hematopoietic Malignant Cell Lines Enhanced by Cationic Liposomes
ZHU Yuan-gui,ZHUO Guang-sheng,CHEN Zhi-zhe,et al
(The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Institute of Hematology of Fujian Province,Fuzhou 350001,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To investigate the different uptake of Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide(G3139) or cationic liposome-mediated G3139 in human hematopoietic malignant cell lines,including HL60,K562,U937,CEM and CA46 cells.Methods Flow cytometer(FCM) was used to detect mean fluorescence intensity of intracelullar fluorescein-labeled G3139.Results When used G3139 alone,there was a cell type-dependent manner with greatest uptake in promonocyte(U937),smallest uptake in T-lymphoblast(CEM),B-lymphoblast(CA46),and granulocyte-derived primary cell(HL60) in intermediate uptake.When DOSPER present,uptakes of G3139 into cells could be increased about 20 fold compared with application of G3139 alone.There were no significantly differences among cells on the uptake of G3139 when the ratio of DOSPER/G3139(μg/μg) was 2～3 fold.Conclution Uptake of G3139 in human hematopoietic malignant cell lines is different,and DOSPER can improve uptake of G3139 into these cells.
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KEY WORDS:oligonucleotide,antisense;liposome;cationic;cell line;leukemia;lymphoma
近来，反义寡核苷酸作为基因治疗药物在实验研究和临床应用方面有了重大进展，一些新型的反义寡核苷酸，如硫代磷酸寡核苷酸已直接以造血细胞为靶细胞，治疗某些造血系统的恶性肿瘤或病毒感染性疾病[1]。但是，反义寡核苷酸在应用时仍存在细胞摄入率较低、易被核酸酶降解等不足。阳离子脂质体能与带负电荷的核酸物质形成复合物，可提高细胞对核酸物质的摄入，同时可在一定程度上降低核酸酶对核酸物质的降解，在基因治疗中有独特的应用价值[2]。G3139是针对Bcl-2的反义寡核苷酸，现已进入临床ⅡA期研究[3]。笔者于1999年7～8月，利用多阳离子脂质体DOSPER为载体，观察造血系统恶性肿瘤细胞对荧光素标记的G3139的摄入。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 细胞株HL60、K562、U937、CEM和CA46细胞均为造血系统恶性肿瘤细胞株，其中HL60细胞为急性粒系白血病细胞株，K562细胞为慢性粒系白血病细胞株，U937细胞为单核细胞白血病细胞株，CEM细胞为T淋巴细胞白血病细胞株，CA46细胞为伯基特淋巴瘤B淋巴细胞株，均由福建省血液病研究所提供。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640中，37℃、5%CO2条件中培养。
G3139的合成与标记 序列为5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'[4]，硫代磷酸化修饰,5'端异硫氰酸荧光素标记，由美国Genened Synthesis Inc合成、标记及纯化。
阳离子脂质体 DOSPER为四阳离子脂质体，购自德国宝灵曼公司。
1.2 方法 G3139处理细胞：于24孔培养板(Coster)中每孔种1×105个细胞1 ml，培养6 h后转染。转染复合物准备：适量DOSPER与G3139分别加到20 mmol/L的HEPES缓冲液50 μl中，轻轻混合两液，室温放置15 min，逐滴加到培养体系中，混匀。同时，另一组加入不含DOSPER的G3139，继续培养4 h。每孔做3个平行孔。G3139的浓度为0.6 μmol/L。
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流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)检测细胞内的平均荧光强度 培养细胞去上清，用预冷的含10%小牛白蛋白的1/15 mol/L的PBS洗涤2遍，再用酸盐法[5]洗脱结合在细胞膜上的G3139，即用预冷的醋酸-氯化钠溶液(0.2 mol/L醋酸,0.5 mol/L氯化钠,pH 2.5)，4℃下放置10 min后离心，PBS清洗后调成2×105 个细胞/ml浓度，每管加入终浓度为10 μg/ml PI(BD公司)，避光保存30 min后上机检测细胞内平均荧光强度(用平均值表示)。每份标本收集10000个细胞，根据活细胞数用Cell QuestTM软件处理数据。
1.3 统计学方法 所有数据统计均用SPSS 8.0统计软件包分析，数据以
±s表示，两均数比较用t检验，多均数比较用q检验。
2 结 果
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当G3139的浓度为0.6 μmol/L时，不同细胞株对G3139的摄入不同，各细胞内的平均荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05)。DOSPER介导转染时，各细胞内的平均荧光强度均显著高于G3139直接作用于细胞时(P<0.01),有的可达20倍，而且当DOSPER与G3139的质量比为2～3时，转染效率最高(P<0.05)，但此时各细胞间细胞内的平均荧光强度无明显的差别(附表)。
附表 DOSPER介导转染荧光素标记G3139时各细胞内平均荧光强度(n=3) 细胞株
DOSPER/G3139(μg/μg)
0Δ
1
2#
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3
4
5
HL60
56.1±9.1
261.9±18.8
534.0±28.5
510.1±25.0
190.6±19.2
263.2±15.2
K562
36.1±8.1
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240.1±17.1
510.1±25.1
280.1±12.4
180.3±16.1
170.1±16.3
U937
69.1±4.1
305.1±23.3
610.4±32.1
590.3±27.1
270.3±16.4
253.1±17.6
, 百拇医药
CEM
27.1±3.3
220.1±15.3
540.3±25.1
482.1±3.3
260.3±15.1
205.3±18.2
CA46
46.3±8.9
290.1±21.6
600.3±31.9
592.3±25.7
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230.1±16.7
215.3±15.3
DOSPER:四阳离子脂质体.未加DOSPER时各细胞株比较，*：P< 0.05；与其他加入DOSPE的比较， Δ：P< 0.01； 与同组其他比例的比较， #：P< 0.05.
3 讨 论
反义寡核苷酸是近年迅速发展起来的一种基因治疗药物。经过特异修饰的反义寡核苷酸，如硫代修饰、嘛啉(morpholino)修饰[6]等具有较强的抗核酸酶能力和膜通透性，可在一定程度上进入细胞内，从基因转录或翻译等多个环节特异性阻断目的基因的表达[7]。但是，不管是哪一种反义寡核苷酸，在应用时都存在细胞摄入率相对较低的问题，单纯增加反义寡核苷酸的量，不但增加了费用，而且增加了反义寡核苷酸的非特异性作用和毒副作用。因此，近年来在寻找更新型的反义寡核苷酸的同时，脂质体包裹反义寡核苷酸介导转染法是一种得到迅速应用的方法。笔者应用的阳离子脂质体DOSPER是1996年开发上市的高效转染试剂，带有四个阳离子，在血清存在的情况下仍有较高的转染效率，而且体外转染时无需中性脂DOPE或胆固醇，所以体外使用比目前广泛应用的阳离子脂质体LipofectinTM更方便。笔者的结果发现，DOSPER显著提高了HL60细胞对荧光素标记的寡核苷酸G3139的摄入，与文献报道[8]基本一致。
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造血系统恶性肿瘤和某些病毒感染性疾病反义治疗的靶细胞，其组分由于细胞表面标志和细胞活力的不同，对反义寡核苷酸的摄入可能不同。Zhou等人报道，白血病细胞对寡核苷酸的摄入比正常人外周血细胞多，而且与细胞种类和细胞活化状态有关，原因是不同的细胞和处于不同活化状态的细胞表面表达某些与核酸物质摄取有关的蛋白或“核酸受体”不同[9]。笔者进一步以造血系统恶性肿瘤细胞株作为研究对象，体外观察单核细胞、T和B淋巴细胞以及髓细胞来源的肿瘤细胞株对G3139的摄入，结果也发现单核细胞来源的U937细胞的摄入量最多，其次是髓细胞来源的HL60细胞和B淋巴细胞来源的CA46细胞，CEM细胞摄入最少，说明不同类型的造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入不同。但是在应用DOSPER介导转染时，各细胞的摄入无明显区别，与Kronenwett等报道[8]以DOTAP转染寡核苷酸进入白血病病人外周血细胞时，单核细胞的摄入量明显高于B和T淋巴细胞的结果不同，可能原因是所用的脂质体和细胞所处的活化状态不同。因此在选择脂质体时应尽可能考虑靶细胞的活化状态，尽可能只增加有一定增殖活性的靶细胞对寡核苷酸的摄入，以减少脂质体的毒副作用。
, 百拇医药
另外，由于异硫氰酸荧光素的荧光强度同pH值有明显的关系，细胞摄入寡核苷酸后细胞内pH值会降低[10]。因此利用FCM测定细胞内G3139的平均荧光强度时，可能会低估细胞内反义寡核苷酸真正的量，所以各细胞间只能作相对的比较。笔者认为，造血系统恶性肿瘤细胞对反义寡核苷酸的摄入不同，阳离子脂质体DOSPER可以普遍增加造血系统恶性肿瘤细胞对反义寡核苷酸的摄入，在应用上具有一定的意义。
作者简介:朱元贵(1973～),男，硕士研究生.
参考文献:
[1]Lisziewicz J,Sun D,Weichold PE,et al.Antisense oligodeoxy-nucleotide phosphorothioate complementary to Gag mRNA blocks replication of human immunodeficiency virus type I in human peripheral blood cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7942.
, 百拇医药
[2]Felgner JH,Kumar R,Sridhar CN,et al.Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations[J].Antisense J Biol Chem,1994,269:2550.
[3]Hogrefe RI.An antisense oligonucleotide primer[J].Antisens Nucleic Acid Drug Dev,1999,9:351.
[4]Raynaud FI,Orr RM,Goddard PM,et al.Pharmacokinetics of G3139,a phosphorothioate oligodeoxynucleotides antisense to bcl-2,aftter intravenous administration or continuous subcutaneous infusion to mice[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,281:420.
, 百拇医药
[5]Gao WY,Jaroszewski JW,Cohen JS,et al.Mechanisms of inhibition of herpes simples virus type-2 growth by 28 mer phophorothioate oligodeoxycytidine[J].J Biol Chem,1990,365:20172.
[6]Summerton J,Stein D,Huang SB,et al.Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems[J].Antisens Nucleic Acid Drug Dev,1997,7:63.
[7]Wielbo D,Sernio C,Gyurko R,et al.Antisense inhibition of hypertension in the spontaneously hypertensive rat[J].Hypertension,1995,25:314.
, 百拇医药
[8]Kronenwett R,Steidl U,Kirsch M,et al.Oligodeoxyribonu-cleotide uptake in primary human hematopoietic cells is enhanced by cationic lipids and depends on the hematopoietic cell subset[J].Blood,1998,91:852.
[9]Zhao Q,Song XX,Waldschmidt T,et al.Oligonucleotide uptake in human hematopoietic cells is increased in leukemia and is related to cellular activation[J].Blood,1996,88:1788.
[10]Tonkinson JL,Stein CA.Pattern of intracelullar compartmentalization trafficking and acidification of 5'-fluorescein labeled phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotide in HL60 cells[J].Nucleic Acid Res,1994,22:4268.
收稿日期:2000-02-23, 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所，福州 350001
关键词：寡核苷酸类；反义；脂质体；阳离子；细胞系；白血病；淋巴瘤
福建医科大学学报000203
摘要:目的 观察阳离子脂质体DOSPER介导或Bcl-2反义寡核苷酸G3139直接作用时，造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入，为阳离子脂质体和反义寡核苷酸的进一步应用提供依据。方法 利用异硫氰酸荧光素标记的G3139，流式细胞仪(FCM)测定造血系统恶性肿瘤细胞株HL60、K562、U937、CA46和CEM细胞内的平均荧光强度。结果 G3139直接作用于细胞时，细胞内荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05)；DOSPER介导转染时，各细胞内的荧光强度均显著高于直接转染时(P<0.01)，而且当DOSPER/G3139(μg/μg)为2～3∶1时，转染效率最佳，但此时各细胞间细胞内平均平均荧光强度无明显的差别(P>0.05)。结论 不同造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入不同，阳离子脂质体DOSPER可普遍提高细胞对G3139的摄入。
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中图分类号:R733.7;R977 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0100-03
Oligodeoxynucleotide Uptake in Human Hematopoietic Malignant Cell Lines Enhanced by Cationic Liposomes
ZHU Yuan-gui,ZHUO Guang-sheng,CHEN Zhi-zhe,et al
(The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University,Institute of Hematology of Fujian Province,Fuzhou 350001,China)
, 百拇医药
ABSTRACT:Objective To investigate the different uptake of Bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide(G3139) or cationic liposome-mediated G3139 in human hematopoietic malignant cell lines,including HL60,K562,U937,CEM and CA46 cells.Methods Flow cytometer(FCM) was used to detect mean fluorescence intensity of intracelullar fluorescein-labeled G3139.Results When used G3139 alone,there was a cell type-dependent manner with greatest uptake in promonocyte(U937),smallest uptake in T-lymphoblast(CEM),B-lymphoblast(CA46),and granulocyte-derived primary cell(HL60) in intermediate uptake.When DOSPER present,uptakes of G3139 into cells could be increased about 20 fold compared with application of G3139 alone.There were no significantly differences among cells on the uptake of G3139 when the ratio of DOSPER/G3139(μg/μg) was 2～3 fold.Conclution Uptake of G3139 in human hematopoietic malignant cell lines is different,and DOSPER can improve uptake of G3139 into these cells.
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KEY WORDS:oligonucleotide,antisense;liposome;cationic;cell line;leukemia;lymphoma
近来，反义寡核苷酸作为基因治疗药物在实验研究和临床应用方面有了重大进展，一些新型的反义寡核苷酸，如硫代磷酸寡核苷酸已直接以造血细胞为靶细胞，治疗某些造血系统的恶性肿瘤或病毒感染性疾病[1]。但是，反义寡核苷酸在应用时仍存在细胞摄入率较低、易被核酸酶降解等不足。阳离子脂质体能与带负电荷的核酸物质形成复合物，可提高细胞对核酸物质的摄入，同时可在一定程度上降低核酸酶对核酸物质的降解，在基因治疗中有独特的应用价值[2]。G3139是针对Bcl-2的反义寡核苷酸，现已进入临床ⅡA期研究[3]。笔者于1999年7～8月，利用多阳离子脂质体DOSPER为载体，观察造血系统恶性肿瘤细胞对荧光素标记的G3139的摄入。
1 材料与方法
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1.1 材料 细胞株HL60、K562、U937、CEM和CA46细胞均为造血系统恶性肿瘤细胞株，其中HL60细胞为急性粒系白血病细胞株，K562细胞为慢性粒系白血病细胞株，U937细胞为单核细胞白血病细胞株，CEM细胞为T淋巴细胞白血病细胞株，CA46细胞为伯基特淋巴瘤B淋巴细胞株，均由福建省血液病研究所提供。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640中，37℃、5%CO2条件中培养。
G3139的合成与标记 序列为5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'[4]，硫代磷酸化修饰,5'端异硫氰酸荧光素标记，由美国Genened Synthesis Inc合成、标记及纯化。
阳离子脂质体 DOSPER为四阳离子脂质体，购自德国宝灵曼公司。
1.2 方法 G3139处理细胞：于24孔培养板(Coster)中每孔种1×105个细胞1 ml，培养6 h后转染。转染复合物准备：适量DOSPER与G3139分别加到20 mmol/L的HEPES缓冲液50 μl中，轻轻混合两液，室温放置15 min，逐滴加到培养体系中，混匀。同时，另一组加入不含DOSPER的G3139，继续培养4 h。每孔做3个平行孔。G3139的浓度为0.6 μmol/L。
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流式细胞仪(FACScan，美国BD公司)检测细胞内的平均荧光强度 培养细胞去上清，用预冷的含10%小牛白蛋白的1/15 mol/L的PBS洗涤2遍，再用酸盐法[5]洗脱结合在细胞膜上的G3139，即用预冷的醋酸-氯化钠溶液(0.2 mol/L醋酸,0.5 mol/L氯化钠,pH 2.5)，4℃下放置10 min后离心，PBS清洗后调成2×105 个细胞/ml浓度，每管加入终浓度为10 μg/ml PI(BD公司)，避光保存30 min后上机检测细胞内平均荧光强度(用平均值表示)。每份标本收集10000个细胞，根据活细胞数用Cell QuestTM软件处理数据。
1.3 统计学方法 所有数据统计均用SPSS 8.0统计软件包分析，数据以
±s表示，两均数比较用t检验，多均数比较用q检验。2 结 果
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当G3139的浓度为0.6 μmol/L时，不同细胞株对G3139的摄入不同，各细胞内的平均荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05)。DOSPER介导转染时，各细胞内的平均荧光强度均显著高于G3139直接作用于细胞时(P<0.01),有的可达20倍，而且当DOSPER与G3139的质量比为2～3时，转染效率最高(P<0.05)，但此时各细胞间细胞内的平均荧光强度无明显的差别(附表)。
附表 DOSPER介导转染荧光素标记G3139时各细胞内平均荧光强度(n=3) 细胞株
DOSPER/G3139(μg/μg)
0Δ
1
2#
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3
4
5
HL60
56.1±9.1
261.9±18.8
534.0±28.5
510.1±25.0
190.6±19.2
263.2±15.2
K562
36.1±8.1
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240.1±17.1
510.1±25.1
280.1±12.4
180.3±16.1
170.1±16.3
U937
69.1±4.1
305.1±23.3
610.4±32.1
590.3±27.1
270.3±16.4
253.1±17.6
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CEM
27.1±3.3
220.1±15.3
540.3±25.1
482.1±3.3
260.3±15.1
205.3±18.2
CA46
46.3±8.9
290.1±21.6
600.3±31.9
592.3±25.7
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230.1±16.7
215.3±15.3
DOSPER:四阳离子脂质体.未加DOSPER时各细胞株比较，*：P< 0.05；与其他加入DOSPE的比较， Δ：P< 0.01； 与同组其他比例的比较， #：P< 0.05.
3 讨 论
反义寡核苷酸是近年迅速发展起来的一种基因治疗药物。经过特异修饰的反义寡核苷酸，如硫代修饰、嘛啉(morpholino)修饰[6]等具有较强的抗核酸酶能力和膜通透性，可在一定程度上进入细胞内，从基因转录或翻译等多个环节特异性阻断目的基因的表达[7]。但是，不管是哪一种反义寡核苷酸，在应用时都存在细胞摄入率相对较低的问题，单纯增加反义寡核苷酸的量，不但增加了费用，而且增加了反义寡核苷酸的非特异性作用和毒副作用。因此，近年来在寻找更新型的反义寡核苷酸的同时，脂质体包裹反义寡核苷酸介导转染法是一种得到迅速应用的方法。笔者应用的阳离子脂质体DOSPER是1996年开发上市的高效转染试剂，带有四个阳离子，在血清存在的情况下仍有较高的转染效率，而且体外转染时无需中性脂DOPE或胆固醇，所以体外使用比目前广泛应用的阳离子脂质体LipofectinTM更方便。笔者的结果发现，DOSPER显著提高了HL60细胞对荧光素标记的寡核苷酸G3139的摄入，与文献报道[8]基本一致。
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造血系统恶性肿瘤和某些病毒感染性疾病反义治疗的靶细胞，其组分由于细胞表面标志和细胞活力的不同，对反义寡核苷酸的摄入可能不同。Zhou等人报道，白血病细胞对寡核苷酸的摄入比正常人外周血细胞多，而且与细胞种类和细胞活化状态有关，原因是不同的细胞和处于不同活化状态的细胞表面表达某些与核酸物质摄取有关的蛋白或“核酸受体”不同[9]。笔者进一步以造血系统恶性肿瘤细胞株作为研究对象，体外观察单核细胞、T和B淋巴细胞以及髓细胞来源的肿瘤细胞株对G3139的摄入，结果也发现单核细胞来源的U937细胞的摄入量最多，其次是髓细胞来源的HL60细胞和B淋巴细胞来源的CA46细胞，CEM细胞摄入最少，说明不同类型的造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入不同。但是在应用DOSPER介导转染时，各细胞的摄入无明显区别，与Kronenwett等报道[8]以DOTAP转染寡核苷酸进入白血病病人外周血细胞时，单核细胞的摄入量明显高于B和T淋巴细胞的结果不同，可能原因是所用的脂质体和细胞所处的活化状态不同。因此在选择脂质体时应尽可能考虑靶细胞的活化状态，尽可能只增加有一定增殖活性的靶细胞对寡核苷酸的摄入，以减少脂质体的毒副作用。
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另外，由于异硫氰酸荧光素的荧光强度同pH值有明显的关系，细胞摄入寡核苷酸后细胞内pH值会降低[10]。因此利用FCM测定细胞内G3139的平均荧光强度时，可能会低估细胞内反义寡核苷酸真正的量，所以各细胞间只能作相对的比较。笔者认为，造血系统恶性肿瘤细胞对反义寡核苷酸的摄入不同，阳离子脂质体DOSPER可以普遍增加造血系统恶性肿瘤细胞对反义寡核苷酸的摄入，在应用上具有一定的意义。
作者简介:朱元贵(1973～),男，硕士研究生.
参考文献:
[1]Lisziewicz J,Sun D,Weichold PE,et al.Antisense oligodeoxy-nucleotide phosphorothioate complementary to Gag mRNA blocks replication of human immunodeficiency virus type I in human peripheral blood cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7942.
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[2]Felgner JH,Kumar R,Sridhar CN,et al.Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations[J].Antisense J Biol Chem,1994,269:2550.
[3]Hogrefe RI.An antisense oligonucleotide primer[J].Antisens Nucleic Acid Drug Dev,1999,9:351.
[4]Raynaud FI,Orr RM,Goddard PM,et al.Pharmacokinetics of G3139,a phosphorothioate oligodeoxynucleotides antisense to bcl-2,aftter intravenous administration or continuous subcutaneous infusion to mice[J].J Pharmacol Exp Ther,1997,281:420.
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[5]Gao WY,Jaroszewski JW,Cohen JS,et al.Mechanisms of inhibition of herpes simples virus type-2 growth by 28 mer phophorothioate oligodeoxycytidine[J].J Biol Chem,1990,365:20172.
[6]Summerton J,Stein D,Huang SB,et al.Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems[J].Antisens Nucleic Acid Drug Dev,1997,7:63.
[7]Wielbo D,Sernio C,Gyurko R,et al.Antisense inhibition of hypertension in the spontaneously hypertensive rat[J].Hypertension,1995,25:314.
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[8]Kronenwett R,Steidl U,Kirsch M,et al.Oligodeoxyribonu-cleotide uptake in primary human hematopoietic cells is enhanced by cationic lipids and depends on the hematopoietic cell subset[J].Blood,1998,91:852.
[9]Zhao Q,Song XX,Waldschmidt T,et al.Oligonucleotide uptake in human hematopoietic cells is increased in leukemia and is related to cellular activation[J].Blood,1996,88:1788.
[10]Tonkinson JL,Stein CA.Pattern of intracelullar compartmentalization trafficking and acidification of 5'-fluorescein labeled phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxynucleotide in HL60 cells[J].Nucleic Acid Res,1994,22:4268.
收稿日期:2000-02-23, 百拇医药