特异性鲎试剂对利巴韦林葡萄糖注射液的细菌内毒素检查法的研究
作者：钟劲松
单位：广东省珠海市人民医院药剂科 519000
关键词：内毒素，细菌；试剂，鲎；利巴韦林葡萄糖注射液
中国药师000217
摘 要 目的： 考察特异性鲎试剂对利巴韦林葡萄糖注射液的细菌内毒素检查法的可行性。方法： 采用干扰初筛实验、抑制增强实验， 并将细菌内毒素检查法与家兔法检查法检测结果作对比。结果： 利巴韦林葡萄糖注射液对特异性鲎试剂灵敏度无干扰。结论： 选用特异性鲎试剂， 可用鲎试剂法检查其热原。
Study on Bacterial Endotoxin Test for Ribavirin
Glucose Injection with Differential TAL
, 百拇医药
Zhong Jinsong
(The People Hospital of Zhuhai, Zhuhai 519000)
ABSTRACT Objective: To examine the feasibility of the bacterial endotoxin test in ribavirin glucose injection with differential TAL. Methods: The experiment was made by the interfere preliminary examination and inhibition or enhancement test. The detecting results of the rabit test was compared with that of the bacterial endotoxin test. Results: Ribavirin glucose injection had no influence on the sensitivity of the differential TAL. Conclusion: The results showed that the method was suitable for the determination of this injection.
, 百拇医药
KEY WORDS Bacterial endotoxin; differential TAL; Ribavirin glucose injection▲
利巴韦林葡萄糖注射液是我国首次批准用于广谱抗病毒感染的输液型药品。部颁标准是用家兔法检测其热原[1]。鲎试剂法检测热原已被我国95版药典收载。但在使用的过程中， 普通的鲎试剂有时会出现假阳性， 这是因为鲎试剂含有C，B，G因子、凝固酶原及凝固蛋白酶原， 其中G因子可被β-葡聚糖及其类似物激活， 活化的G因子单独使凝固酶原转化为凝固酶而出现假阳性。特异性鲎试剂是封闭了G因子的鲎试剂， 可消除由于β-葡聚糖及其类似物所引起的假阳性[2]。本文用特异性鲎试剂对利巴韦林葡萄糖注射液中细菌内毒素检查的可行性进行了研究。
1 实验材料
特异性鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂， 批号990320， 0.1 ml/支， 灵敏度标示值λb=0.5 EU.ml-1、)； 普通鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司， 批号990413， 0.1 ml/支， 灵敏度标示值λb=0.5 EU.ml-1)， 细菌内毒素工作标准品(厦门鲎试剂实验厂， 批号990420， 10 EU/支)； 鲎试剂溶解水(厦门鲎试剂实验厂， 批号990510， 内毒素含量<0.03 EU.ml-1)； 利巴韦林葡萄糖注射液(本院制剂室， 批号990518， 990604； 990617)。
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2 鲎试剂灵敏度复核实验
按中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定复核实验用的特异性鲎试剂及普通鲎试剂的灵敏度， 结果见表1。
表 1 鲎试剂灵敏度复核结果 鲎试剂批号
标示灵敏度
λb(EU.ml-1)
复核灵敏度
λc(EU.ml-1)
990320(特异性)
0.5
, 百拇医药
0.5
990413(普通)
0.5
0.5
3 干扰初筛实验
3.1 供试品内毒素限值(L)的确定 供试品为大输液， 兔剂量M=10 ml.kg-1， 而我国静脉用药细菌内毒素致热阀值K为5 EU.kg-1 [3]， L=K/M=0.5 EU.ml-1。
3.2 稀释细菌内毒素工作标准品 把细菌内毒素工作标准品稀释成1.0， 0.5， 0.25， 0.125， 0.06， 0.03 EU.ml-1的系列浓度备用。
, 百拇医药
3.3 稀释供试品 取0.5 EU.ml-1为计算供试品稀释倍数的基准灵敏度(记为λ0.5)， 计算出对应λ0.5的最大稀释倍数(MVD0.5)： MVD0.5=L/λ0.5=0.5/0.5=1(倍)(1倍稀释即原液， 无需稀释)， 类似可计算出供试品需稀释出的5个浓度： MVD：
MVD0.5
MVD0.25
MVD0.125
MVD0.06
MVD0.03
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供试品稀释倍数：
1
2
4
8
16
3.4 加样及反应 进行以下两个系列的反应。
供试品阴性对照系列： 取特异性鲎试剂(λb=0.5 EU*ml-1)10支， 分别各加0.1 ml上述稀释好的供试品， 再各加0.1 ml鲎试剂溶解水， 每一供试品浓度重复两反应管。
供试品阳性对照系列： 取特异性鲎试剂(λb=0.5 EU*ml-1)10支， 分别各加0.1 ml上述稀释好的供试品， 再各加0.1 ml已稀释好的2 λ浓度(1.0 EU*ml-1)的细菌内毒素工作标准品， 每一供试品浓度重复两反应管。
, 百拇医药
3.5 反应结果见表2表 2 供试品干扰初筛实验结果
(特异性鲎试剂批号990320 λb=0.5 EU.ml-1) 稀释倍数
对应MVD
反应结果
供试品阴性对照
供试品阳性对照
1
MVD0.5--
++
2
MVD0.25--
, 百拇医药
++
4
MVD0.125--
++
8
MVD0.06--
++
16
MVD0.03--
++
结果表明， 使用0.5～0.03 EU.ml-1灵敏度的特异性鲎试剂在对应的供试品浓度下作细菌内毒素检查， 没有干扰。
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4 供试品的干扰试验
取λ=0.5 EU.ml-1的特异性鲎试剂及λ=0.5 EU.ml-1的普通鲎试剂作干扰试验， 样品取3批(本院制剂室生产， 批号990518， 990604， 990617)， 不用稀释， 直接用利巴韦林葡萄糖注射液原液， 按《中国药典》1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的供试品干扰试验作实验。结果见表3。
结果表明， 选用特异性鲎试剂， Es=Et=0.5 EU.ml-1， 按照中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 判断供试品在该浓度下对细菌内毒素检查无干扰； 而选用普通鲎试剂， Es=0.5 EU.ml-1， Et=0.125 EU.ml-1， 按照中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 判断供试品在该浓度下对细菌内毒素检查有干扰。
, 百拇医药
表 3 供试品的干扰试验结果 鲎试剂
批号
内毒素水溶液系列(EU.ml-1)
内毒素样品溶液系列(EU.ml-1)
1.0
0.5
0.25
0.125
NC
1.0
0.5
, http://www.100md.com
0.25
0.125
NC
990320
990518
++++
++++----------
++++
++++----------
λb=0.5
990604
++++
, 百拇医药
++++----------
++++
++++----------
(特异性)
990617
++++
++++----------
++++
++++----------
Es=0.5
Et=0.5
, http://www.100md.com
990413
990518
++++
++++----------
++++
++++
++++
++++--
λb=0.5
990604
++++
++++----------
, 百拇医药
++++
++++
++++
++++--
(普通性)
990617
++++
++++----------
++++
++++
++++
++++--
Es=0.5
, http://www.100md.com
Et=0.125
NC为阴性对照， Es为用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值， Et为用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值。5 产品的细菌内毒素检查结果
取利巴韦林葡萄糖注射液3批， 按中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 选用特异性鲎试剂进行检测结果见表4。
表 4 3批产品的细菌内毒素检测结果
(特异性鲎试剂批号990320 λb=0.5 EU.ml-1) 样品批号
管号
阴性对照
, 百拇医药
阳性对照
产品阳性对照
1
2
990518
-
-
-
+
+
990604
-
-
-
, http://www.100md.com
+
+
990617
-
-
-
+
+
6 产品的家兔法热原检查
按中国药典1995版二部1998年增补本“热原检查法”的规定进行检测， 结果上述3批产品热原检查结果均符合规定。
7 讨论
7.1 从本实验可以看出， 应用特异性鲎试剂， 利巴韦林葡萄糖注射液对细菌内毒素检查的相容性很好， 不用稀释， 直接用原液， 对细菌内毒素实验无干扰， 同时按中国药典1995版二部1998年增补本的规定进行热原检测， 其检测结果一致， 且临床应用无热原反应， 表明选用特异性鲎试剂细菌内毒素检查法适用于该注射液的检测。此法较家兔法快速、灵敏、方便。而选用普通鲎试剂， 直接用样品检测时有干扰， 不宜直接检测， 样品经稀释后能否用细菌内毒素检查法， 有待进一步验证。
, 百拇医药
7.2 通过干扰初筛实验， 我们可以判断样品对细菌内毒素检查的相容性， 即干扰程度的评价； 确定干扰的性质， 是抑制或增强； 确定样品对细菌内毒素检查无干扰的有效浓度范围； 确定检查用鲎试剂的灵敏度范围， 从而减少实验的盲目性。■
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部标准(试行). WS-320(X-251)-98(2)
[2]金于兰， 张亚达， 尹行， 等. 一种检测药品致热物质的特异性鲎试剂. 中国临床药学杂志， 1997， 6(2)：87
[3]夏振明. 药品细菌内毒素检查的限值. 药物分析， 1995， 15(3)： 54
收稿日期：1999-09-20
修稿日期：2000-03-10, 百拇医药
单位：广东省珠海市人民医院药剂科 519000
关键词：内毒素，细菌；试剂，鲎；利巴韦林葡萄糖注射液
中国药师000217
摘 要 目的： 考察特异性鲎试剂对利巴韦林葡萄糖注射液的细菌内毒素检查法的可行性。方法： 采用干扰初筛实验、抑制增强实验， 并将细菌内毒素检查法与家兔法检查法检测结果作对比。结果： 利巴韦林葡萄糖注射液对特异性鲎试剂灵敏度无干扰。结论： 选用特异性鲎试剂， 可用鲎试剂法检查其热原。
Study on Bacterial Endotoxin Test for Ribavirin
Glucose Injection with Differential TAL
, 百拇医药
Zhong Jinsong
(The People Hospital of Zhuhai, Zhuhai 519000)
ABSTRACT Objective: To examine the feasibility of the bacterial endotoxin test in ribavirin glucose injection with differential TAL. Methods: The experiment was made by the interfere preliminary examination and inhibition or enhancement test. The detecting results of the rabit test was compared with that of the bacterial endotoxin test. Results: Ribavirin glucose injection had no influence on the sensitivity of the differential TAL. Conclusion: The results showed that the method was suitable for the determination of this injection.
, 百拇医药
KEY WORDS Bacterial endotoxin; differential TAL; Ribavirin glucose injection▲
利巴韦林葡萄糖注射液是我国首次批准用于广谱抗病毒感染的输液型药品。部颁标准是用家兔法检测其热原[1]。鲎试剂法检测热原已被我国95版药典收载。但在使用的过程中， 普通的鲎试剂有时会出现假阳性， 这是因为鲎试剂含有C，B，G因子、凝固酶原及凝固蛋白酶原， 其中G因子可被β-葡聚糖及其类似物激活， 活化的G因子单独使凝固酶原转化为凝固酶而出现假阳性。特异性鲎试剂是封闭了G因子的鲎试剂， 可消除由于β-葡聚糖及其类似物所引起的假阳性[2]。本文用特异性鲎试剂对利巴韦林葡萄糖注射液中细菌内毒素检查的可行性进行了研究。
1 实验材料
特异性鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂， 批号990320， 0.1 ml/支， 灵敏度标示值λb=0.5 EU.ml-1、)； 普通鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司， 批号990413， 0.1 ml/支， 灵敏度标示值λb=0.5 EU.ml-1)， 细菌内毒素工作标准品(厦门鲎试剂实验厂， 批号990420， 10 EU/支)； 鲎试剂溶解水(厦门鲎试剂实验厂， 批号990510， 内毒素含量<0.03 EU.ml-1)； 利巴韦林葡萄糖注射液(本院制剂室， 批号990518， 990604； 990617)。
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2 鲎试剂灵敏度复核实验
按中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定复核实验用的特异性鲎试剂及普通鲎试剂的灵敏度， 结果见表1。
表 1 鲎试剂灵敏度复核结果 鲎试剂批号
标示灵敏度
λb(EU.ml-1)
复核灵敏度
λc(EU.ml-1)
990320(特异性)
0.5
, 百拇医药
0.5
990413(普通)
0.5
0.5
3 干扰初筛实验
3.1 供试品内毒素限值(L)的确定 供试品为大输液， 兔剂量M=10 ml.kg-1， 而我国静脉用药细菌内毒素致热阀值K为5 EU.kg-1 [3]， L=K/M=0.5 EU.ml-1。
3.2 稀释细菌内毒素工作标准品 把细菌内毒素工作标准品稀释成1.0， 0.5， 0.25， 0.125， 0.06， 0.03 EU.ml-1的系列浓度备用。
, 百拇医药
3.3 稀释供试品 取0.5 EU.ml-1为计算供试品稀释倍数的基准灵敏度(记为λ0.5)， 计算出对应λ0.5的最大稀释倍数(MVD0.5)： MVD0.5=L/λ0.5=0.5/0.5=1(倍)(1倍稀释即原液， 无需稀释)， 类似可计算出供试品需稀释出的5个浓度： MVD：
MVD0.5
MVD0.25
MVD0.125
MVD0.06
MVD0.03
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供试品稀释倍数：
1
2
4
8
16
3.4 加样及反应 进行以下两个系列的反应。
供试品阴性对照系列： 取特异性鲎试剂(λb=0.5 EU*ml-1)10支， 分别各加0.1 ml上述稀释好的供试品， 再各加0.1 ml鲎试剂溶解水， 每一供试品浓度重复两反应管。
供试品阳性对照系列： 取特异性鲎试剂(λb=0.5 EU*ml-1)10支， 分别各加0.1 ml上述稀释好的供试品， 再各加0.1 ml已稀释好的2 λ浓度(1.0 EU*ml-1)的细菌内毒素工作标准品， 每一供试品浓度重复两反应管。
, 百拇医药
3.5 反应结果见表2表 2 供试品干扰初筛实验结果
(特异性鲎试剂批号990320 λb=0.5 EU.ml-1) 稀释倍数
对应MVD
反应结果
供试品阴性对照
供试品阳性对照
1
MVD0.5--
++
2
MVD0.25--
, 百拇医药
++
4
MVD0.125--
++
8
MVD0.06--
++
16
MVD0.03--
++
结果表明， 使用0.5～0.03 EU.ml-1灵敏度的特异性鲎试剂在对应的供试品浓度下作细菌内毒素检查， 没有干扰。
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4 供试品的干扰试验
取λ=0.5 EU.ml-1的特异性鲎试剂及λ=0.5 EU.ml-1的普通鲎试剂作干扰试验， 样品取3批(本院制剂室生产， 批号990518， 990604， 990617)， 不用稀释， 直接用利巴韦林葡萄糖注射液原液， 按《中国药典》1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的供试品干扰试验作实验。结果见表3。
结果表明， 选用特异性鲎试剂， Es=Et=0.5 EU.ml-1， 按照中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 判断供试品在该浓度下对细菌内毒素检查无干扰； 而选用普通鲎试剂， Es=0.5 EU.ml-1， Et=0.125 EU.ml-1， 按照中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 判断供试品在该浓度下对细菌内毒素检查有干扰。
, 百拇医药
表 3 供试品的干扰试验结果 鲎试剂
批号
内毒素水溶液系列(EU.ml-1)
内毒素样品溶液系列(EU.ml-1)
1.0
0.5
0.25
0.125
NC
1.0
0.5
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0.25
0.125
NC
990320
990518
++++
++++----------
++++
++++----------
λb=0.5
990604
++++
, 百拇医药
++++----------
++++
++++----------
(特异性)
990617
++++
++++----------
++++
++++----------
Es=0.5
Et=0.5
, http://www.100md.com
990413
990518
++++
++++----------
++++
++++
++++
++++--
λb=0.5
990604
++++
++++----------
, 百拇医药
++++
++++
++++
++++--
(普通性)
990617
++++
++++----------
++++
++++
++++
++++--
Es=0.5
, http://www.100md.com
Et=0.125
NC为阴性对照， Es为用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值， Et为用供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值。5 产品的细菌内毒素检查结果
取利巴韦林葡萄糖注射液3批， 按中国药典1995版二部1998年增补本“细菌内毒素检查法”的规定， 选用特异性鲎试剂进行检测结果见表4。
表 4 3批产品的细菌内毒素检测结果
(特异性鲎试剂批号990320 λb=0.5 EU.ml-1) 样品批号
管号
阴性对照
, 百拇医药
阳性对照
产品阳性对照
1
2
990518
-
-
-
+
+
990604
-
-
-
, http://www.100md.com
+
+
990617
-
-
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6 产品的家兔法热原检查
按中国药典1995版二部1998年增补本“热原检查法”的规定进行检测， 结果上述3批产品热原检查结果均符合规定。
7 讨论
7.1 从本实验可以看出， 应用特异性鲎试剂， 利巴韦林葡萄糖注射液对细菌内毒素检查的相容性很好， 不用稀释， 直接用原液， 对细菌内毒素实验无干扰， 同时按中国药典1995版二部1998年增补本的规定进行热原检测， 其检测结果一致， 且临床应用无热原反应， 表明选用特异性鲎试剂细菌内毒素检查法适用于该注射液的检测。此法较家兔法快速、灵敏、方便。而选用普通鲎试剂， 直接用样品检测时有干扰， 不宜直接检测， 样品经稀释后能否用细菌内毒素检查法， 有待进一步验证。
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7.2 通过干扰初筛实验， 我们可以判断样品对细菌内毒素检查的相容性， 即干扰程度的评价； 确定干扰的性质， 是抑制或增强； 确定样品对细菌内毒素检查无干扰的有效浓度范围； 确定检查用鲎试剂的灵敏度范围， 从而减少实验的盲目性。■
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部标准(试行). WS-320(X-251)-98(2)
[2]金于兰， 张亚达， 尹行， 等. 一种检测药品致热物质的特异性鲎试剂. 中国临床药学杂志， 1997， 6(2)：87
[3]夏振明. 药品细菌内毒素检查的限值. 药物分析， 1995， 15(3)： 54
收稿日期：1999-09-20
修稿日期：2000-03-10, 百拇医药