牛磺酸对同型半胱氨酸致人血管内皮细胞损伤的拮抗作用
作者：徐雅琴 张钧华 柯杨 宁涛 曹静 赵春玉 李载权 唐朝枢
单位：徐雅琴 张钧华 曹静 赵春玉 李载权 唐朝枢(100034 北京医科大学第一医院心内科)；柯杨(北京市肿瘤研究所)；宁涛(北京市肿瘤研究所)
关键词：
中华医学杂志000230 牛磺酸(taurine)是组织内生成的一种含硫氨基酸，具有稳定细胞膜，维持细胞Ca2+稳态和调节渗透压等广泛的细胞保护作用[1]。我们在体外培养的人脐静脉内皮细胞上观察牛磺酸是否有抗同型半胱氨酸(Hcy)内皮细胞损伤作用，以探讨应用牛磺酸治疗高同型半胱氨酸血症细胞损伤的可行性。
一、材料和方法
1.材料：新生儿脐带由北京医科大学第一医院妇产科提供，RPMI-1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自华美公司，Hcy和牛磺酸购自Sigma公司，3H-TdR购自Amersham公司。
, 百拇医药
2.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养：原代细胞培养参照文献[2]所述方法，相差显微镜下内皮细胞长满后呈“鹅卵石”样排列，电镜下观察到呈颗粒状的vWF鉴定为人内皮细胞后进行传代培养，实验所用为第3代。
3.乳酸脱氢酶(LDH)活性测定：采用Wrablewski等报道的方法[3]。分别测培养液和细胞内的LDH活性，细胞死亡率=培养液LDH活性÷(细胞内LDH活性+培养液LDH活性)×100%。
4.3H-TdR掺入测定：指数生长期的HUVECs以每孔1×105接种于24孔培养板，无血清培养基孵育24 h，更换体积分数0.1的胎牛血清培养基，随机分组，实验组分别加Hcy(0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)，牛磺酸(5.0、10、20 mmol/L)及
Hcy 0.1 mmol/L与牛磺酸(5.0、10、20)共同孵育，孵育16 h后，每孔加2.7×109Bq3H-TdR,继续孵育6 h后，裂解细胞，收集细胞液于玻璃纤维纸上，抽干，加闪烁液，Beckman液闪计数器测定其放射性脉冲数(cpm/well)。
, 百拇医药
5.统计方法：SPSS/PC统计软件对资料进行方差分析和q检验，实验结果以均数±标准差表示。
二、结果
1.Hcy、牛磺酸对内皮细胞死亡率的影响：与对照组比Hcy呈浓度依赖地增加内皮细胞死亡率，而牛磺酸单独孵育不影响内皮细胞死亡率，不同浓度的牛磺酸与Hcy 1.0 mmol/L共同孵育呈现浓度依赖地抑制Hcy的致内皮细胞死亡作用(表1)。
表1 人脐静脉内皮细胞死亡率及3H-TdR掺入值(
±s) 组别
标本
内皮细胞
死亡率(%)
, 百拇医药
3H-TdR
掺入值(cpm)
对照组
5.05±
0.17
6 893±
1 338
Hcy(mmol/L)
6
0.1
5.02±
0.23
, 百拇医药 4 490±
1 151**
0.5
5.94±
0.42**
3 279±
661**
1.0
11.94±
1.88**
4 750±
678**
, 百拇医药
2.0
15.23±
2.33**
4 118±
852**
牛磺酸(mmol/L)
6
5.0
5.12±
0.29
8 346±
1 128
, 百拇医药
10
5.18±
0.35
7 299±
892
20
4.99±
0.31
8 314±
914*
Hcy(1.0 mmol/L)+Tau
6
, 百拇医药 5.0
9.73±
2.0*△
10
7.94±
2.03*△△
20
7.06±
1.70*△△
Hcy(0.1 mmol/L)+Tau
6
5.0
, 百拇医药
4 656±
1 254**
10
6 007±
851▲▲
20
6 818±
700▲▲
注：Hcy：同型半胱氨酸，与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与Hcy 1.0 mmol/L组比较△P<0.05，△△P<0.01；与Hcy 0.1 mmol/L组比较▲▲P<0.01
, 百拇医药
2.Hcy、牛磺酸对内皮细胞3H-TdR掺入的影响：与对照组比Hcy使内皮细胞3H-TdR掺入减少，且随Hcy浓度升高抑制作用有增加趋势；低浓度牛磺酸对内皮细胞3H-TdR掺入无明显影响，浓度达20 mmol/L时增加3H-TdR掺入；同时给Hcy和牛磺酸孵育后，3H-TdR掺入同单独Hcy组相比明显增加(表1)。
三、讨论
近年来，认为高同型半胱氨酸血症是血管损伤性疾病的一个独立危险因子，应用叶酸、B12、B6降低血浆Hcy浓度成为防治动脉粥样硬化的一个新策略[4]。本结果表明，当给内皮细胞不同浓度的Hcy作用24小时后，内皮细胞LDH释放增加，LDH是存在于细胞内的酶，其释放增加表示细胞受损或死亡，说明Hcy可诱发人血管内皮细胞死亡；3H-TdR掺入是DNA合成、增殖的指标，3H-TdR掺入减少表示DNA合成减少，细胞生长、增殖受抑，本研究显示Hcy可显著抑制内皮细胞3H-TdR掺入，这与国外一些研究结果是一致的[1，5]，进一步肯定了Hcy对人血管内皮细胞的损伤作用。但Hcy的细胞损伤机制目前仅知高Hcy可使过氧化物及自由基产生增加[6]，可通过受体/载体使细胞内Ca2+转运增加，推测这可能是Hcy致内皮损伤的原因之一。
, http://www.100md.com
牛磺酸是一种β-氨基酸的亚磺酸类似物，长期被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物，后来研究发现其具有广泛的生物学效应，是一个广谱的细胞保护剂：(1)维持细胞内外渗透压平衡，(2)直接的膜稳定作用，(3)钙离子调节作用；(4)抗脂质过氧化损伤，清除氧自由基；(5)调节平衡内皮舒张因子、内皮素等血管活性物质合成释放的紊乱状态。本研究结果发现牛磺酸与Hcy共同孵育可显著抑制Hcy诱导的内皮细胞死亡，且呈剂量依赖效应；同时发现牛磺酸有拮抗Hcy对内皮细胞3H-TdR掺入的抑制，亦呈浓度依赖效应。说明牛磺酸有拮抗Hcy的内皮损伤作用，推测其抗Hcy细胞损伤机制除上述作用外，作为含硫氨基酸，在细胞膜上转运与Hcy竞争结合受体/载体，抑制了Hcy的损伤作用也可能是其机制之一[1]，其对防治高同型半胱氨酸血症的细胞损伤作用具有潜在的临床应用价值。
参考文献
[1]Huxtable RJ. Physiological Actions of Taurine. Physiol Rev, 1992,72:101-161.
, 百拇医药
[2]程娉，周玫，杨仕林.氧化修饰的低密度脂蛋白对培养的人脐静脉内皮细胞的影响.第一军医大学学报，1991，11：296-300.
[3]Wrablewski F, LaDue GS. Lactate dehydrogenase activity in blood. Proc Soc Exp Med，1955，90:210-217.
[4]Genest J JR, Lussier-Cacan S,Qiu S,et al. Homocysteine and coronary disease in French Canadians:relationship with vitamins B12,B6,pyridoral phosphate and folate. Can J Cardiol,1993,9:81E.
[5]Stampfer MT,Malinow MR,Willett WC,et al. A prospective study of plasma homocysteine and risk of myocardial infarction in US physicians. JAMA,1992,268:877-881.
[6]Jones BG,Rose FA,Tudball N. Lipid peroxidation and homocysteine induced toxicity. Atherosclerosis，1994,105:165-170.
收稿日期：1999-02-05, http://www.100md.com
单位：徐雅琴 张钧华 曹静 赵春玉 李载权 唐朝枢(100034 北京医科大学第一医院心内科)；柯杨(北京市肿瘤研究所)；宁涛(北京市肿瘤研究所)
关键词：
中华医学杂志000230 牛磺酸(taurine)是组织内生成的一种含硫氨基酸，具有稳定细胞膜，维持细胞Ca2+稳态和调节渗透压等广泛的细胞保护作用[1]。我们在体外培养的人脐静脉内皮细胞上观察牛磺酸是否有抗同型半胱氨酸(Hcy)内皮细胞损伤作用，以探讨应用牛磺酸治疗高同型半胱氨酸血症细胞损伤的可行性。
一、材料和方法
1.材料：新生儿脐带由北京医科大学第一医院妇产科提供，RPMI-1640购自美国Gibco公司，胎牛血清购自华美公司，Hcy和牛磺酸购自Sigma公司，3H-TdR购自Amersham公司。
, 百拇医药
2.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养：原代细胞培养参照文献[2]所述方法，相差显微镜下内皮细胞长满后呈“鹅卵石”样排列，电镜下观察到呈颗粒状的vWF鉴定为人内皮细胞后进行传代培养，实验所用为第3代。
3.乳酸脱氢酶(LDH)活性测定：采用Wrablewski等报道的方法[3]。分别测培养液和细胞内的LDH活性，细胞死亡率=培养液LDH活性÷(细胞内LDH活性+培养液LDH活性)×100%。
4.3H-TdR掺入测定：指数生长期的HUVECs以每孔1×105接种于24孔培养板，无血清培养基孵育24 h，更换体积分数0.1的胎牛血清培养基，随机分组，实验组分别加Hcy(0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)，牛磺酸(5.0、10、20 mmol/L)及
Hcy 0.1 mmol/L与牛磺酸(5.0、10、20)共同孵育，孵育16 h后，每孔加2.7×109Bq3H-TdR,继续孵育6 h后，裂解细胞，收集细胞液于玻璃纤维纸上，抽干，加闪烁液，Beckman液闪计数器测定其放射性脉冲数(cpm/well)。
, 百拇医药
5.统计方法：SPSS/PC统计软件对资料进行方差分析和q检验，实验结果以均数±标准差表示。
二、结果
1.Hcy、牛磺酸对内皮细胞死亡率的影响：与对照组比Hcy呈浓度依赖地增加内皮细胞死亡率，而牛磺酸单独孵育不影响内皮细胞死亡率，不同浓度的牛磺酸与Hcy 1.0 mmol/L共同孵育呈现浓度依赖地抑制Hcy的致内皮细胞死亡作用(表1)。
表1 人脐静脉内皮细胞死亡率及3H-TdR掺入值(
±s) 组别标本
内皮细胞
死亡率(%)
, 百拇医药
3H-TdR
掺入值(cpm)
对照组
5.05±
0.17
6 893±
1 338
Hcy(mmol/L)
6
0.1
5.02±
0.23
, 百拇医药 4 490±
1 151**
0.5
5.94±
0.42**
3 279±
661**
1.0
11.94±
1.88**
4 750±
678**
, 百拇医药
2.0
15.23±
2.33**
4 118±
852**
牛磺酸(mmol/L)
6
5.0
5.12±
0.29
8 346±
1 128
, 百拇医药
10
5.18±
0.35
7 299±
892
20
4.99±
0.31
8 314±
914*
Hcy(1.0 mmol/L)+Tau
6
, 百拇医药 5.0
9.73±
2.0*△
10
7.94±
2.03*△△
20
7.06±
1.70*△△
Hcy(0.1 mmol/L)+Tau
6
5.0
, 百拇医药
4 656±
1 254**
10
6 007±
851▲▲
20
6 818±
700▲▲
注：Hcy：同型半胱氨酸，与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与Hcy 1.0 mmol/L组比较△P<0.05，△△P<0.01；与Hcy 0.1 mmol/L组比较▲▲P<0.01
, 百拇医药
2.Hcy、牛磺酸对内皮细胞3H-TdR掺入的影响：与对照组比Hcy使内皮细胞3H-TdR掺入减少，且随Hcy浓度升高抑制作用有增加趋势；低浓度牛磺酸对内皮细胞3H-TdR掺入无明显影响，浓度达20 mmol/L时增加3H-TdR掺入；同时给Hcy和牛磺酸孵育后，3H-TdR掺入同单独Hcy组相比明显增加(表1)。
三、讨论
近年来，认为高同型半胱氨酸血症是血管损伤性疾病的一个独立危险因子，应用叶酸、B12、B6降低血浆Hcy浓度成为防治动脉粥样硬化的一个新策略[4]。本结果表明，当给内皮细胞不同浓度的Hcy作用24小时后，内皮细胞LDH释放增加，LDH是存在于细胞内的酶，其释放增加表示细胞受损或死亡，说明Hcy可诱发人血管内皮细胞死亡；3H-TdR掺入是DNA合成、增殖的指标，3H-TdR掺入减少表示DNA合成减少，细胞生长、增殖受抑，本研究显示Hcy可显著抑制内皮细胞3H-TdR掺入，这与国外一些研究结果是一致的[1，5]，进一步肯定了Hcy对人血管内皮细胞的损伤作用。但Hcy的细胞损伤机制目前仅知高Hcy可使过氧化物及自由基产生增加[6]，可通过受体/载体使细胞内Ca2+转运增加，推测这可能是Hcy致内皮损伤的原因之一。
, http://www.100md.com
牛磺酸是一种β-氨基酸的亚磺酸类似物，长期被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物，后来研究发现其具有广泛的生物学效应，是一个广谱的细胞保护剂：(1)维持细胞内外渗透压平衡，(2)直接的膜稳定作用，(3)钙离子调节作用；(4)抗脂质过氧化损伤，清除氧自由基；(5)调节平衡内皮舒张因子、内皮素等血管活性物质合成释放的紊乱状态。本研究结果发现牛磺酸与Hcy共同孵育可显著抑制Hcy诱导的内皮细胞死亡，且呈剂量依赖效应；同时发现牛磺酸有拮抗Hcy对内皮细胞3H-TdR掺入的抑制，亦呈浓度依赖效应。说明牛磺酸有拮抗Hcy的内皮损伤作用，推测其抗Hcy细胞损伤机制除上述作用外，作为含硫氨基酸，在细胞膜上转运与Hcy竞争结合受体/载体，抑制了Hcy的损伤作用也可能是其机制之一[1]，其对防治高同型半胱氨酸血症的细胞损伤作用具有潜在的临床应用价值。
参考文献
[1]Huxtable RJ. Physiological Actions of Taurine. Physiol Rev, 1992,72:101-161.
, 百拇医药
[2]程娉，周玫，杨仕林.氧化修饰的低密度脂蛋白对培养的人脐静脉内皮细胞的影响.第一军医大学学报，1991，11：296-300.
[3]Wrablewski F, LaDue GS. Lactate dehydrogenase activity in blood. Proc Soc Exp Med，1955，90:210-217.
[4]Genest J JR, Lussier-Cacan S,Qiu S,et al. Homocysteine and coronary disease in French Canadians:relationship with vitamins B12,B6,pyridoral phosphate and folate. Can J Cardiol,1993,9:81E.
[5]Stampfer MT,Malinow MR,Willett WC,et al. A prospective study of plasma homocysteine and risk of myocardial infarction in US physicians. JAMA,1992,268:877-881.
[6]Jones BG,Rose FA,Tudball N. Lipid peroxidation and homocysteine induced toxicity. Atherosclerosis，1994,105:165-170.
收稿日期：1999-02-05, http://www.100md.com