脊髓损伤与基因治疗
作者：汤宇 胥少汀
单位：汤宇(保定，解放军第二五二医院骨科 071000)；胥少汀(北京军区总医院骨科实验室)
关键词：
中华创伤杂志000230 随着分子生物学技术的日益成熟，不少学者在中枢神经系统(CNS)损伤方面进行了潜心研究，并取得一定成绩，为脊髓损伤后神经再生寻找到新的途径。
一、影响脊髓损伤后神经再生的因素
成熟神经元再生轴突的能力依赖于以下几个因素：(1)再表达生长相关基因的能力；(2)再生轴突能攀附及伸展的有效基质分子；(3)促进及引导轴突再生的有效神经营养因子；(4)是否存在损害轴突延伸的伴髓生长抑制因子[1]。脊髓组织作为成熟的中枢神经系统，其神经元已失去分裂和再生新神经元的能力，其髓鞘由少突胶质细胞而不是雪旺细胞组成，成熟的少突胶质细胞可以分泌某种抑制蛋白，使神经轴突的再生受到抑制[2]。而且在脊髓损伤后，缺少合适的再生轴突能攀附生长的基质分子，使再生的轴突被瘢痕组织阻挡。可见，由于脊髓损伤后缺乏轴突再生的合适的机械、化学微环境，从而影响了神经再生。
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二、脊髓损伤后基因治疗方法
基因治疗是指通过分子生物学技术和细胞转移技术，将特定的DNA片段转移至特定细胞，使DNA在这些细胞中得到表达，并合成蛋白[3]。通过基因转移的方法，可以为脊髓损伤后神经生长提供一个合适的微环境，从而使轴突再生成为可能。这是目前脊髓损伤后进行基因治疗实验研究的主要目的。现在有多种基因工程细胞，可以分泌多种可溶性因子，如神经生长因子(NGF)、睫状神经生长因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子、神经营养因子-3(NF-3)等[4]。这些特殊细胞，成为中枢神经系统损伤及多种神经病变实验研究中新的工具。基因治疗目前主要有两种方法：一是通过移植基因工程细胞或重组缺陷病毒的接种，实现间接的基因传递；二是不用任何细胞或病毒传递子，而是通过气溶胶、全身传递或组织注射，进行直接的基因介导。
(一)间接基因传递
1. 基因工程细胞的转移：(1)由于初级神经元细胞较难获取，以及不易在培养基中维持，并且这些细胞也不易用常用的方法进行基因转移，因此把它们作为基因转移载体的研究还不多。然而，通过用生长因子刺激培养的神经元前体细胞增生，就可以用传统的方法实现基因转移。使用基因工程神经元细胞的一个主要优势就在于这些神经元细胞可以与宿主组织建立起突触联系。通过这种方法，神经元可以提供所需的基因产品。此外，在一些最近的关于原始神经元培养的基因转移研究中，也包括了使用疱疹病毒和重组腺病毒[5]。目前研究的焦点还集中在作为基因转移候选者的神经元前体细胞的特性上。(2)非神经元细胞：①雪旺细胞：最近有人将雪旺细胞用于基因工程，使其产生人类NGF(hNGF)，并用多聚膜包裹，然后移植入穹窿伞缺损大鼠的脑前室，转移基因可以表达至少3周。使大多数轴突切断的多巴胺神经元被重组NGF所挽救[6]。②成纤维细胞：Gage用基因工程成纤维细胞作为“生物微泵”，在大鼠CNS中表达左旋多巴(L-DOPA)、多巴(DOPANM)、乙酰胆碱(ACH)、NGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)或NF-3等多种因子[4]。这种方法通过自体移植而避免了可能的排斥反应。在不同的动物神经病变或损伤模型中，使神经元存活或轴突再生[7]。Tuszynski等[8]1996年在培养的猴原始成纤维细胞中进行基因工程，可以产生hNGF，在体外达13.2×10-6 ng/h。在成年猴进行穹窿部半横切，导致前脑基底胆碱能神经元退变，将能分泌NGF的细胞直接注射到前脑基底部位，1个月后可以观察到92%的退变神经元得到保护。Mark等于1996年通过后病毒传递子将hNGF基因传递至Fisch 344大鼠的原始成纤维细胞中，可以获得稳定及高浓度的hNGF表达(46×10-6 ng/d)。此细胞植入大鼠胸段脊髓损伤模型中，可以观察到脊髓运动、感觉和去甲肾上腺素能轴突的再生。Tuszynski等[8]将能分泌NGF并被遗传修饰的成纤维细胞(在体外平均可以分泌15×10-6 ng/h)移植到受损脊髓，可以同时促进运动和感觉轴突的再生。表明在损伤后，运动神经元也可以表达对神经营养因子的反应性。成年感觉神经元在其周围神经组织移植入经过修饰的能产生NF-3、bFGF的成纤维细胞后，也能出芽生长。③成肌细胞：原始肌细胞也被成功地作为载体应用于基因转移中。其主要优点在于成肌细胞可以从个体中获取，并重新植入，实现自体移植。此外，这种非神经元细胞的基因载体，可以通过化学或病毒方法被有效广泛地转染。经修饰后的成肌细胞，可以移植入CNS中存活，并实现转移基因的长期表达。但其稳定性和潜在的致癌性还需研究。Walff证实，经肌间注射外源性质粒DNA，能在骨骼肌细胞中生存并持续表达至少19个月；质粒携带的氯霉素乙酰基转移酶(Lac Z)基因也被介导，并在肌肉中表达1年，只是效率还比较低。将基因用腺病毒介导转移至肌细胞是效率更高的方法。在肌肉中表达的营养因子同时可以直接作用于肌细胞，或逆行转运到感觉或运动神经元细胞体。Deglon[9]用多聚膜包裹的小鼠C2C12肌细胞表达重组睫状营养因子。C2C12由人类CNTF基因的pNUT表达传递子(pNUT expression vector)转染。1个克隆的C2C12细胞可以分泌200 ng×10-6/d。这种细胞可以快速分裂增殖，进行稳定的基因转移。但在低血清介质中可以静止成为非分裂细胞，从而避免在多聚膜内细胞无限繁殖，争夺空间和营养，最终导致细胞死亡。可渗透的多聚膜允许小分子物质如营养因子进出，但是阻止与宿主免疫系统接触。因此，可以移植异体基因而不激惹宿主免疫系统。由于pNUT表达传递子上携带单纯疱疹胸腺激酶基因，若膜破裂后移植细胞则被免疫系统清除。这种方法可以持续产生hCNTF达3个月以后。(3)其他类型的细胞：上述细胞都是非中枢神经系统的基因载体。最近Bohn将星形胶质细胞进行基因工程，使之分泌NGF或BDNF。在体外，基因工程星形胶质细胞可以表达高水平的生物活性NGF或BDNF。在Parkinson病大鼠模型中，通过基因工程修饰的星形细胞，表达NGF，促进了同期移植的肾上腺嗜铬细胞的存活和功能恢复[10]。因此，基因工程星形胶质细胞也成为CNS基因治疗中大有希望的转基因载体。
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2.缺陷病毒的接种：病毒携带上目的基因，则成为基因传递子。后病毒、疱疹病毒、腺病毒、伴腺病毒(AAV)均能进行有效的基因传递。(1)后病毒在CNS损伤的基因治疗中存在明显缺陷,目前使用受到限制。此外，它在体内的翻译效率也有限。其优点在于：细胞可以在正常的生理状态下被转染，而且可以将基因组单一精确地复制到神经元前体细胞，基因组可以被子代细胞完整继承[11]。(2)腺病毒：重组腺病毒可以在神经元和胶质细胞中表达外来转移基因。经用重组腺病毒转染后的人类原始培养新生儿神经元细胞能健康生长，并持续表达Lac Z基因至少3个月。在神经元内重组腺病毒还可以逆行运输。在肌肉注射重组复制缺陷病毒，使Lac Z基因表达，可以在注射肌肉产生运动和感觉神经元的神经支配[12]。将人类神经元前体细胞先通过腺病毒传递子进行基因工程，再移植入大鼠纹状体成为CNS基因治疗的一种可靠方法[5]。同时，这种技术显示了转染的高效价，以产生高滴度的重组病毒。但是，由于重组腺病毒可以在宿主诱发免疫反应，因此，对基因表达的稳定性和长期安全性还了解较少。现在有人正致力于改变病毒的抗原性位点。(3)伴腺病毒：能整合进非复制细胞，因此，在CNS基因治疗中完全可以占有一席之地。Kaplitt在1994年用重组AAV在去纹状体的6-羟多巴胺缺陷大鼠中表达酪氨酸羟基激酶或Lac Z基因。在注射后3个月，仍有转移基因在神经元和胶质细胞中持续表达。作者也报告了在治疗动物中有行为恢复。这种安全、稳定的脑内基因转移方法，成为Parkinski病及其他病变潜在的基因治疗方法之一。然而，这种方法也有缺陷：AAV病毒无天然的嗜神经元性，基因转染率低，这种病毒和腺病毒组合在一起，还未经过完全检测。 (4)疱疹病毒：有嗜神经元性及基因转染高效能，是CNS基因治疗的潜在工具。
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(二)直接基因传递
可以用在组织中直接注射含有DNA的脂质体的方法，实现直接的基因传递。阳离子脂质体是在各种神经元或非神经元培养细胞中传递DNA、mRNA或蛋白质的最有效方法之一。用磷酸钙盐-沉淀质粒DNA，包含半乳糖苷酶(β-CAT)基因注射入幼龄大鼠的大脑，初步证明一些神经元和胶质细胞已在原位转染。Berger用包含有腺苷激酶基因的DOTAP阳离子脂质体，在大鼠脑肿瘤模型的肿瘤旁注射，可以观察到明显的肿瘤退化，在邻近组织不造成任何组织损害。可见用阳离子脂质体作为转基因的载体，治疗神经元性病变是可行的。
三、存在问题
在CNS中进行基因转移，用基因工程细胞在体外动物模型中已被证明为有效的方法。但随着时间推移，转移基因表达会逐渐减少；还可能因野型菌株重组缺陷病毒而产生毒性更强的新菌株，并由此带来相应的免疫系统反应等问题。因此，基因治疗应用于临床还需要做大量工作。
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参考文献：
[1]Tuszynki MH, Gage FH. Maintaining the neuronal phenotype after injury in the adult CNS.Mol Neurobiol, 1995, 10:151-167.
[2]Tuszynski MH,Gabriel K,Gage FH.NGF delivery by gene transfer induces differential outgrowth of sensory, motor and noradrenergic neurites after adult spinal cord injury. Exp Neurol, 1996, 137:157-173.
[3]Saleh M.Gene therapy for plastic and reconstructive surgery. Clin Plast Surg, 1996, 23:157-171.
, 百拇医药
[4]Giuliana Ferrari. Report on the second meeting of the European Working Group on human gene transfer and therapy. Hum Gene Ther, 1995, 6:787-790.
[5]Sabate O,Herellou P,Vigne E,et al.Transplantation to the rat brain of human neural progenitors which were genetically modified using adenovirus.Nature, 1995, 9:256-260.
[6]Schinstine M,Fiore DM,Winn SR,et al.Polymer encapsulated Schwannoma cells expressing human NGF promote the survival of cholinergic neurons after a fimbria-fornix transection.Cell Transplant, 1995, 4:93-102.
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[7]Tuszynski MH,Gage FH.Somatic gene transfer to the adult primate CNS:in vitro and in vivo characterization of cells genetically modified to secrete NGF.Neurobiol Dis, 1994, 1:67-78.
[8]Tuszynski MH,Roberts J,Senut MC,et al.Gene therapy in the adult primate brain:interparenchymal grafts of cells genetically modified to produce NGF preventing cholinergic neuronal degeneration.Gene Ther, 1996, 3:305-314.
[9]Deglon N.CNS delivery of recombinant ciliary neutrophic factor by polymer encapsulated differentiated C2C12 myoblast.Hum Gene Ther, 1996, 7:2135-2146.
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[10]Cunningham LA,Short MP,Breakefield XD,et al.NGF released by transgenic astrocytes enhances the function of adrenal chromaffin cell grafts in a rat model of Parkinson's disease.Brain Res, 1994, 658:219-231.
[11]Gorden EM.Gene therapy using retrovival vector.Curr Opin Biotechnol, 1994, 5:611-616.
[12]Trapnell BC,Gorziglia M.Gene therapy using retrovival vector.Curr Opin Biotechnol, 1994, 5:617-625.
收稿日期：1998-11-30, http://www.100md.com
单位：汤宇(保定，解放军第二五二医院骨科 071000)；胥少汀(北京军区总医院骨科实验室)
关键词：
中华创伤杂志000230 随着分子生物学技术的日益成熟，不少学者在中枢神经系统(CNS)损伤方面进行了潜心研究，并取得一定成绩，为脊髓损伤后神经再生寻找到新的途径。
一、影响脊髓损伤后神经再生的因素
成熟神经元再生轴突的能力依赖于以下几个因素：(1)再表达生长相关基因的能力；(2)再生轴突能攀附及伸展的有效基质分子；(3)促进及引导轴突再生的有效神经营养因子；(4)是否存在损害轴突延伸的伴髓生长抑制因子[1]。脊髓组织作为成熟的中枢神经系统，其神经元已失去分裂和再生新神经元的能力，其髓鞘由少突胶质细胞而不是雪旺细胞组成，成熟的少突胶质细胞可以分泌某种抑制蛋白，使神经轴突的再生受到抑制[2]。而且在脊髓损伤后，缺少合适的再生轴突能攀附生长的基质分子，使再生的轴突被瘢痕组织阻挡。可见，由于脊髓损伤后缺乏轴突再生的合适的机械、化学微环境，从而影响了神经再生。
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二、脊髓损伤后基因治疗方法
基因治疗是指通过分子生物学技术和细胞转移技术，将特定的DNA片段转移至特定细胞，使DNA在这些细胞中得到表达，并合成蛋白[3]。通过基因转移的方法，可以为脊髓损伤后神经生长提供一个合适的微环境，从而使轴突再生成为可能。这是目前脊髓损伤后进行基因治疗实验研究的主要目的。现在有多种基因工程细胞，可以分泌多种可溶性因子，如神经生长因子(NGF)、睫状神经生长因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子、神经营养因子-3(NF-3)等[4]。这些特殊细胞，成为中枢神经系统损伤及多种神经病变实验研究中新的工具。基因治疗目前主要有两种方法：一是通过移植基因工程细胞或重组缺陷病毒的接种，实现间接的基因传递；二是不用任何细胞或病毒传递子，而是通过气溶胶、全身传递或组织注射，进行直接的基因介导。
(一)间接基因传递
1. 基因工程细胞的转移：(1)由于初级神经元细胞较难获取，以及不易在培养基中维持，并且这些细胞也不易用常用的方法进行基因转移，因此把它们作为基因转移载体的研究还不多。然而，通过用生长因子刺激培养的神经元前体细胞增生，就可以用传统的方法实现基因转移。使用基因工程神经元细胞的一个主要优势就在于这些神经元细胞可以与宿主组织建立起突触联系。通过这种方法，神经元可以提供所需的基因产品。此外，在一些最近的关于原始神经元培养的基因转移研究中，也包括了使用疱疹病毒和重组腺病毒[5]。目前研究的焦点还集中在作为基因转移候选者的神经元前体细胞的特性上。(2)非神经元细胞：①雪旺细胞：最近有人将雪旺细胞用于基因工程，使其产生人类NGF(hNGF)，并用多聚膜包裹，然后移植入穹窿伞缺损大鼠的脑前室，转移基因可以表达至少3周。使大多数轴突切断的多巴胺神经元被重组NGF所挽救[6]。②成纤维细胞：Gage用基因工程成纤维细胞作为“生物微泵”，在大鼠CNS中表达左旋多巴(L-DOPA)、多巴(DOPANM)、乙酰胆碱(ACH)、NGF、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)或NF-3等多种因子[4]。这种方法通过自体移植而避免了可能的排斥反应。在不同的动物神经病变或损伤模型中，使神经元存活或轴突再生[7]。Tuszynski等[8]1996年在培养的猴原始成纤维细胞中进行基因工程，可以产生hNGF，在体外达13.2×10-6 ng/h。在成年猴进行穹窿部半横切，导致前脑基底胆碱能神经元退变，将能分泌NGF的细胞直接注射到前脑基底部位，1个月后可以观察到92%的退变神经元得到保护。Mark等于1996年通过后病毒传递子将hNGF基因传递至Fisch 344大鼠的原始成纤维细胞中，可以获得稳定及高浓度的hNGF表达(46×10-6 ng/d)。此细胞植入大鼠胸段脊髓损伤模型中，可以观察到脊髓运动、感觉和去甲肾上腺素能轴突的再生。Tuszynski等[8]将能分泌NGF并被遗传修饰的成纤维细胞(在体外平均可以分泌15×10-6 ng/h)移植到受损脊髓，可以同时促进运动和感觉轴突的再生。表明在损伤后，运动神经元也可以表达对神经营养因子的反应性。成年感觉神经元在其周围神经组织移植入经过修饰的能产生NF-3、bFGF的成纤维细胞后，也能出芽生长。③成肌细胞：原始肌细胞也被成功地作为载体应用于基因转移中。其主要优点在于成肌细胞可以从个体中获取，并重新植入，实现自体移植。此外，这种非神经元细胞的基因载体，可以通过化学或病毒方法被有效广泛地转染。经修饰后的成肌细胞，可以移植入CNS中存活，并实现转移基因的长期表达。但其稳定性和潜在的致癌性还需研究。Walff证实，经肌间注射外源性质粒DNA，能在骨骼肌细胞中生存并持续表达至少19个月；质粒携带的氯霉素乙酰基转移酶(Lac Z)基因也被介导，并在肌肉中表达1年，只是效率还比较低。将基因用腺病毒介导转移至肌细胞是效率更高的方法。在肌肉中表达的营养因子同时可以直接作用于肌细胞，或逆行转运到感觉或运动神经元细胞体。Deglon[9]用多聚膜包裹的小鼠C2C12肌细胞表达重组睫状营养因子。C2C12由人类CNTF基因的pNUT表达传递子(pNUT expression vector)转染。1个克隆的C2C12细胞可以分泌200 ng×10-6/d。这种细胞可以快速分裂增殖，进行稳定的基因转移。但在低血清介质中可以静止成为非分裂细胞，从而避免在多聚膜内细胞无限繁殖，争夺空间和营养，最终导致细胞死亡。可渗透的多聚膜允许小分子物质如营养因子进出，但是阻止与宿主免疫系统接触。因此，可以移植异体基因而不激惹宿主免疫系统。由于pNUT表达传递子上携带单纯疱疹胸腺激酶基因，若膜破裂后移植细胞则被免疫系统清除。这种方法可以持续产生hCNTF达3个月以后。(3)其他类型的细胞：上述细胞都是非中枢神经系统的基因载体。最近Bohn将星形胶质细胞进行基因工程，使之分泌NGF或BDNF。在体外，基因工程星形胶质细胞可以表达高水平的生物活性NGF或BDNF。在Parkinson病大鼠模型中，通过基因工程修饰的星形细胞，表达NGF，促进了同期移植的肾上腺嗜铬细胞的存活和功能恢复[10]。因此，基因工程星形胶质细胞也成为CNS基因治疗中大有希望的转基因载体。
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2.缺陷病毒的接种：病毒携带上目的基因，则成为基因传递子。后病毒、疱疹病毒、腺病毒、伴腺病毒(AAV)均能进行有效的基因传递。(1)后病毒在CNS损伤的基因治疗中存在明显缺陷,目前使用受到限制。此外，它在体内的翻译效率也有限。其优点在于：细胞可以在正常的生理状态下被转染，而且可以将基因组单一精确地复制到神经元前体细胞，基因组可以被子代细胞完整继承[11]。(2)腺病毒：重组腺病毒可以在神经元和胶质细胞中表达外来转移基因。经用重组腺病毒转染后的人类原始培养新生儿神经元细胞能健康生长，并持续表达Lac Z基因至少3个月。在神经元内重组腺病毒还可以逆行运输。在肌肉注射重组复制缺陷病毒，使Lac Z基因表达，可以在注射肌肉产生运动和感觉神经元的神经支配[12]。将人类神经元前体细胞先通过腺病毒传递子进行基因工程，再移植入大鼠纹状体成为CNS基因治疗的一种可靠方法[5]。同时，这种技术显示了转染的高效价，以产生高滴度的重组病毒。但是，由于重组腺病毒可以在宿主诱发免疫反应，因此，对基因表达的稳定性和长期安全性还了解较少。现在有人正致力于改变病毒的抗原性位点。(3)伴腺病毒：能整合进非复制细胞，因此，在CNS基因治疗中完全可以占有一席之地。Kaplitt在1994年用重组AAV在去纹状体的6-羟多巴胺缺陷大鼠中表达酪氨酸羟基激酶或Lac Z基因。在注射后3个月，仍有转移基因在神经元和胶质细胞中持续表达。作者也报告了在治疗动物中有行为恢复。这种安全、稳定的脑内基因转移方法，成为Parkinski病及其他病变潜在的基因治疗方法之一。然而，这种方法也有缺陷：AAV病毒无天然的嗜神经元性，基因转染率低，这种病毒和腺病毒组合在一起，还未经过完全检测。 (4)疱疹病毒：有嗜神经元性及基因转染高效能，是CNS基因治疗的潜在工具。
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(二)直接基因传递
可以用在组织中直接注射含有DNA的脂质体的方法，实现直接的基因传递。阳离子脂质体是在各种神经元或非神经元培养细胞中传递DNA、mRNA或蛋白质的最有效方法之一。用磷酸钙盐-沉淀质粒DNA，包含半乳糖苷酶(β-CAT)基因注射入幼龄大鼠的大脑，初步证明一些神经元和胶质细胞已在原位转染。Berger用包含有腺苷激酶基因的DOTAP阳离子脂质体，在大鼠脑肿瘤模型的肿瘤旁注射，可以观察到明显的肿瘤退化，在邻近组织不造成任何组织损害。可见用阳离子脂质体作为转基因的载体，治疗神经元性病变是可行的。
三、存在问题
在CNS中进行基因转移，用基因工程细胞在体外动物模型中已被证明为有效的方法。但随着时间推移，转移基因表达会逐渐减少；还可能因野型菌株重组缺陷病毒而产生毒性更强的新菌株，并由此带来相应的免疫系统反应等问题。因此，基因治疗应用于临床还需要做大量工作。
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参考文献：
[1]Tuszynki MH, Gage FH. Maintaining the neuronal phenotype after injury in the adult CNS.Mol Neurobiol, 1995, 10:151-167.
[2]Tuszynski MH,Gabriel K,Gage FH.NGF delivery by gene transfer induces differential outgrowth of sensory, motor and noradrenergic neurites after adult spinal cord injury. Exp Neurol, 1996, 137:157-173.
[3]Saleh M.Gene therapy for plastic and reconstructive surgery. Clin Plast Surg, 1996, 23:157-171.
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[4]Giuliana Ferrari. Report on the second meeting of the European Working Group on human gene transfer and therapy. Hum Gene Ther, 1995, 6:787-790.
[5]Sabate O,Herellou P,Vigne E,et al.Transplantation to the rat brain of human neural progenitors which were genetically modified using adenovirus.Nature, 1995, 9:256-260.
[6]Schinstine M,Fiore DM,Winn SR,et al.Polymer encapsulated Schwannoma cells expressing human NGF promote the survival of cholinergic neurons after a fimbria-fornix transection.Cell Transplant, 1995, 4:93-102.
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[7]Tuszynski MH,Gage FH.Somatic gene transfer to the adult primate CNS:in vitro and in vivo characterization of cells genetically modified to secrete NGF.Neurobiol Dis, 1994, 1:67-78.
[8]Tuszynski MH,Roberts J,Senut MC,et al.Gene therapy in the adult primate brain:interparenchymal grafts of cells genetically modified to produce NGF preventing cholinergic neuronal degeneration.Gene Ther, 1996, 3:305-314.
[9]Deglon N.CNS delivery of recombinant ciliary neutrophic factor by polymer encapsulated differentiated C2C12 myoblast.Hum Gene Ther, 1996, 7:2135-2146.
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[10]Cunningham LA,Short MP,Breakefield XD,et al.NGF released by transgenic astrocytes enhances the function of adrenal chromaffin cell grafts in a rat model of Parkinson's disease.Brain Res, 1994, 658:219-231.
[11]Gorden EM.Gene therapy using retrovival vector.Curr Opin Biotechnol, 1994, 5:611-616.
[12]Trapnell BC,Gorziglia M.Gene therapy using retrovival vector.Curr Opin Biotechnol, 1994, 5:617-625.
收稿日期：1998-11-30, http://www.100md.com