耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA重复序列PCR的分型研究
作者：曾海涛 周钢 李洁
单位：曾海涛(湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078)；周钢(湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078)；李洁(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)
关键词：葡萄球菌，金黄色；细菌分型技术；聚合酶链反应
湖南医学000220【中图分类号】 R372 【文献标识码】 B 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0113-02
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)是一种重要的致病菌，具有多重耐药性,可导致严重的医院感染,故治疗比较困难。对MRSA进行分型研究，查明其传播途径, 是控制MRSA传播的环节之一。本文旨在建立一种简便、快速、可靠、分辨率好的分型方法。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①菌株：金黄色葡萄球菌来自1999年3月至1999年5月湖南医科大学附属湘雅医院烧伤科患者的烧伤创面。②试剂：鉴定MRSA的培养基购自浙江军分区后勤部卫生防疫检疫所。引物ERIC-25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[1]，由上海生工生物工程公司合成，Taq DNA聚合酶和dNTP购自Promega公司，溶葡萄球菌素购自Sigma公司。
1.2 方法 ①MRSA的鉴定：采用苯唑青霉素盐琼脂平板确定试验[2] 进行鉴定。②MRSA基因组DNA的制备[1]：将已分纯的菌落接种至2 ml Luria-Bertani培养基中，于37℃振荡培养至对数生长期。吸取1.0 ml 上述菌液至1.5 ml Eppendorf管中，于4 ℃以12 000 g离心2 min。 弃上清，加入500 μl GTE溶液(50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；10 mmol/L EDTA，pH 8.0)使细菌沉淀重悬，加入30 μl 浓度为 250 μg/ml的溶葡萄球菌素，加入1 μl浓度为10 mg/ml的RNA酶，置37 ℃水浴箱1 h。然后用苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，加50μl TE(pH 8.0)溶解DNA。用752紫外光栅分光光度计检测DNA的浓度和纯度，在0.8%琼脂糖凝胶中电泳, 检查DNA的质量。将符合实验要求的DNA稀释至1 ng/μl，-20 ℃贮存。③DNA重复序列PCR扩增：扩增反应总体积为50 μl, 其中无菌蒸馏水29 μl, 10×反应缓冲液5 μl, 2 mmol/L dNTP 5 μl, 10 μmol/L 引物5 μl, 1 ng/μl MRSA基因组DNA 5 μl, 0.2 U/μl Taq DNA聚合酶 1μl。混匀后加矿物油30 μl。PCR反应的步骤为
, 百拇医药
94 ℃预变性5 min；94 ℃1 min，64 ℃1 min，72 ℃2 min，40个循环, 循环完成后72 ℃5 min。④电泳：取10 μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml 溴乙锭)中电泳，电压为5 V/cm，紫外透射仪上观察，一次性成像系统照像。
2 结果
分离的26株MRSA均有扩增产物，电泳图谱中，可见扩增产物的长度为200～1500bp，可分辨区带的数目为3～6条，每株MRSA 均有一条长度为200bp左右的区带，大多数区带的长度在200～600bp 之间(见封四图1，图2)。根据区带数目和位置的不同, 26株MRSA可被分为22型(见附表)。其中A，M，N和O型菌株的百分比均为9%。
附表 26株MRSA分型结果 菌株编号
类型
, 百拇医药
菌株编号
类型
菌株编号
类型
1
A
10
I
19
O
2
A
11
J
, 百拇医药
20
P
3
B
12
K
21
Q
4
C
13
L
22
R
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5
D
14
M
23
S
6
E
15
M
24
T
7
F
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16
N
25
U
8
G
17
N
26
V
9
H
18
O
, 百拇医药
3 讨论
在细菌的分子流行病学研究中，脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)，随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)是常用的分型研究方法。 PFGE可靠性、分辨率和重复性好，但操作繁琐，费时间；RAPD虽操作简单，分辨率高，但重复性不理想。
细菌基因组中有许多重复序列，每种细菌重复序列的种类、位置和数目不完全一样，故选择其中高度保守的序列作为引物，以细菌基因组DNA为模板PCR扩增后，各种细菌扩增产物的长度也不完全一样，根据其电泳图谱的不同，即可对细菌进行分型或同源性检测。这种PCR称为重复序列PCR(rep-PCR)。rep-PCR被用于多种细菌的分型研究中[4,5]。本研究所采用的引物ERIC-2 序列是首先在肠杆菌中发现的重复序列中高度保守的序列[3]。 1993年Van Belkum将该引物用于MRSA的分型研究[1]。Van Belkum在实验中所采用的退火温度是25 ℃。作者在实验中发现用ERIC-2引物, 25 ℃退火进行PCR扩增,扩增产物的特异性不理想,重复性较差。因此,将退火温度提高至64 ℃,PCR扩增后,电泳结果较理想, 表明rep-PCR是一种简便、快速、可靠、分辨率好的分型方法。
, 百拇医药
【作者简介】 曾海涛(1963～)，男，湖南邵阳县人，助理研究员，硕士，主要从事基因表达调控研究。
【参 考 文 献】
[1] van Belkum A,Bax R,Perrbooms P,et al.Comparison of phage typing and DNA fingerprinting by polymerase chain reaction for discrimination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1993,31:798-803
[2] 过祥豹.耐甲氧苯青霉素葡萄球菌的筛选及其意义.见:徐秀华,主编. 临床医院感染学[M]. 湖南:湖南科学技术出版社，1998.425-426
, http://www.100md.com
[3] Sharples GJ,Lloyd RG.A novel repeated DNA sequencelocated in the intergenic regions of bacterial chromosomes.[J]Nucleic Acids Res,1990,18:6503-6508
[4] Beyer W, Mukendi FM,Kimmig P,et al.Suitability of repetitive- DNA- sequence- based PCR fingerprinting for characterizing epidemic isolates of Salmonella entericaserovar saintpaul[J]. J Clin Microbiol,1998,36:1549-1554
[5] Jersek B, Gilot P, Gubina M, et al.Typing of Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence- based PCR[J]. J Clin Microbiol,1999,37:103-109
【收稿日期】 2000-01-07, http://www.100md.com
单位：曾海涛(湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078)；周钢(湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078)；李洁(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)
关键词：葡萄球菌，金黄色；细菌分型技术；聚合酶链反应
湖南医学000220【中图分类号】 R372 【文献标识码】 B 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0113-02
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)是一种重要的致病菌，具有多重耐药性,可导致严重的医院感染,故治疗比较困难。对MRSA进行分型研究，查明其传播途径, 是控制MRSA传播的环节之一。本文旨在建立一种简便、快速、可靠、分辨率好的分型方法。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料 ①菌株：金黄色葡萄球菌来自1999年3月至1999年5月湖南医科大学附属湘雅医院烧伤科患者的烧伤创面。②试剂：鉴定MRSA的培养基购自浙江军分区后勤部卫生防疫检疫所。引物ERIC-25′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[1]，由上海生工生物工程公司合成，Taq DNA聚合酶和dNTP购自Promega公司，溶葡萄球菌素购自Sigma公司。
1.2 方法 ①MRSA的鉴定：采用苯唑青霉素盐琼脂平板确定试验[2] 进行鉴定。②MRSA基因组DNA的制备[1]：将已分纯的菌落接种至2 ml Luria-Bertani培养基中，于37℃振荡培养至对数生长期。吸取1.0 ml 上述菌液至1.5 ml Eppendorf管中，于4 ℃以12 000 g离心2 min。 弃上清，加入500 μl GTE溶液(50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；10 mmol/L EDTA，pH 8.0)使细菌沉淀重悬，加入30 μl 浓度为 250 μg/ml的溶葡萄球菌素，加入1 μl浓度为10 mg/ml的RNA酶，置37 ℃水浴箱1 h。然后用苯酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，加50μl TE(pH 8.0)溶解DNA。用752紫外光栅分光光度计检测DNA的浓度和纯度，在0.8%琼脂糖凝胶中电泳, 检查DNA的质量。将符合实验要求的DNA稀释至1 ng/μl，-20 ℃贮存。③DNA重复序列PCR扩增：扩增反应总体积为50 μl, 其中无菌蒸馏水29 μl, 10×反应缓冲液5 μl, 2 mmol/L dNTP 5 μl, 10 μmol/L 引物5 μl, 1 ng/μl MRSA基因组DNA 5 μl, 0.2 U/μl Taq DNA聚合酶 1μl。混匀后加矿物油30 μl。PCR反应的步骤为
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94 ℃预变性5 min；94 ℃1 min，64 ℃1 min，72 ℃2 min，40个循环, 循环完成后72 ℃5 min。④电泳：取10 μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml 溴乙锭)中电泳，电压为5 V/cm，紫外透射仪上观察，一次性成像系统照像。
2 结果
分离的26株MRSA均有扩增产物，电泳图谱中，可见扩增产物的长度为200～1500bp，可分辨区带的数目为3～6条，每株MRSA 均有一条长度为200bp左右的区带，大多数区带的长度在200～600bp 之间(见封四图1，图2)。根据区带数目和位置的不同, 26株MRSA可被分为22型(见附表)。其中A，M，N和O型菌株的百分比均为9%。
附表 26株MRSA分型结果 菌株编号
类型
, 百拇医药
菌株编号
类型
菌株编号
类型
1
A
10
I
19
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2
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3 讨论
在细菌的分子流行病学研究中，脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)，随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)是常用的分型研究方法。 PFGE可靠性、分辨率和重复性好，但操作繁琐，费时间；RAPD虽操作简单，分辨率高，但重复性不理想。
细菌基因组中有许多重复序列，每种细菌重复序列的种类、位置和数目不完全一样，故选择其中高度保守的序列作为引物，以细菌基因组DNA为模板PCR扩增后，各种细菌扩增产物的长度也不完全一样，根据其电泳图谱的不同，即可对细菌进行分型或同源性检测。这种PCR称为重复序列PCR(rep-PCR)。rep-PCR被用于多种细菌的分型研究中[4,5]。本研究所采用的引物ERIC-2 序列是首先在肠杆菌中发现的重复序列中高度保守的序列[3]。 1993年Van Belkum将该引物用于MRSA的分型研究[1]。Van Belkum在实验中所采用的退火温度是25 ℃。作者在实验中发现用ERIC-2引物, 25 ℃退火进行PCR扩增,扩增产物的特异性不理想,重复性较差。因此,将退火温度提高至64 ℃,PCR扩增后,电泳结果较理想, 表明rep-PCR是一种简便、快速、可靠、分辨率好的分型方法。
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【作者简介】 曾海涛(1963～)，男，湖南邵阳县人，助理研究员，硕士，主要从事基因表达调控研究。
【参 考 文 献】
[1] van Belkum A,Bax R,Perrbooms P,et al.Comparison of phage typing and DNA fingerprinting by polymerase chain reaction for discrimination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains[J].J Clin Microbiol,1993,31:798-803
[2] 过祥豹.耐甲氧苯青霉素葡萄球菌的筛选及其意义.见:徐秀华,主编. 临床医院感染学[M]. 湖南:湖南科学技术出版社，1998.425-426
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[3] Sharples GJ,Lloyd RG.A novel repeated DNA sequencelocated in the intergenic regions of bacterial chromosomes.[J]Nucleic Acids Res,1990,18:6503-6508
[4] Beyer W, Mukendi FM,Kimmig P,et al.Suitability of repetitive- DNA- sequence- based PCR fingerprinting for characterizing epidemic isolates of Salmonella entericaserovar saintpaul[J]. J Clin Microbiol,1998,36:1549-1554
[5] Jersek B, Gilot P, Gubina M, et al.Typing of Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence- based PCR[J]. J Clin Microbiol,1999,37:103-109
【收稿日期】 2000-01-07, http://www.100md.com