γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究
作者：周伟强 宋今丹
单位：周伟强(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)；宋今丹(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
关键词：γ-干扰素；诱导作用；电镜
中国医科大学学报000208 摘要 目的：探讨γ-干扰素对人大肠癌细胞系肿瘤相关抗原 LEA表达的诱导作用。方法：将γ-干扰素与人大肠癌CCL229细胞共育培养，通过免疫铁蛋白电镜观察γ-干扰素对人大肠癌细胞系CCL229诱导作用的超微结构变化。结果：电镜观察发现，γ-干扰素诱导后，CCL229细胞表面皱褶增多，形成大量不规则突起，并且CCL229细胞针状伪足萎缩，微绒毛大多呈球状分布于胞体四周。结论：电镜超微结构的变化与γ-干扰素诱导后 LEA抗原表达量增加有关，并且γ-干扰素可能有抑制肿瘤细胞游走性、降低肿瘤细胞转移性的作用。
, http://www.100md.com
Effect of Interferon-γ on Inducing the Expression of the Large
External Antigen Immunoelectronscope
Zhou Weiqiang, Song Jindan
(Department of Cell Biology, College of Basic Medical Siences, China Medical University, Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To verify interferon-γ's inducing effect on the expression of large external antigen(LEA) tumor related gene. Methods::We cultured interferon-γ together with CCL229 cell, then used electron microscope to observe the ultrastructur changes at CCL229 cell. Results: After the inducing effect of interferon-γ CCL229 cell surfaces are more wrinkled than not induced which implicated that this phenomenum is possible related with the high expression of LEA antigen. CCL229 cell had less pseudopodium after the induction. Pseudopodium even vanished in some cells. Conclusion:Interferon-γ could inhibit the invasiveness and metastasis of tumor cells.
, 百拇医药
KEY WORDS interferon-γ； inducing effection; electron microscope
γ-干扰素作为一种可促进人主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex , MHC)抗原表达的细胞因子，通过上调MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达进而影响肿瘤细胞相关抗原的表达。γ-干扰素对大肠癌细胞超微结构的变化，国内外文献未见报道。本文通过γ-干扰素诱导下人大肠癌细胞系CCL229电镜超微结构的变化来说明γ-干扰素诱导作用的本质，为将γ-干扰素用于大肠癌肿瘤疫苗的制备及基因治疗提供重要的实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人大肠癌CCL229细胞由美国哈佛大学医学院Dana-Farber肿瘤研究所惠赠，复苏后于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在5% CO2、100%湿度、37℃条件下培养，取对数生长期细胞进行实验研究。
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1.2 试剂
γ-干扰素，北京邦定生物医学公司1996年产品(100万u/ml)，纯度99%；戊二醛，北京华美生物制品公司1997年产品；锇酸，美国Serva公司1997年产品。
1.3 γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究
1.3.1 常规扫描电镜观察：将CCL229细胞盖玻片培养，γ-干扰素以500 u/ml的作用浓度与CCL229细胞共育培养24 h，以 PBS作对照。培养相应时间后，取出盖玻片戊二醛—锇酸双重固定，系列脱水，临界点干燥，金属镀膜后于S450扫描电镜下观察。
1.3.2 免疫铁蛋白电镜观察：将γ-干扰素诱导的CCL229细胞经2.5%戊二醛原位固定后，刮取细胞， 1 000 r/min离心10 min，使其形成细胞团块。细胞团在4%甲醛溶液内，0℃固定2 h，并用四氧化锇后固定2 h。将细胞团浸于ND-1单克隆抗体液中，室温作用30～60 min。以大量冷缓冲液充分洗涤3次，每次30 min。然后浸入铁蛋白标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体液中(制备方法详见文献[1])，室温作用30 min。充分洗涤后，捞取细胞团。四氧化锇固定30 min。常规系列乙醇—丙酮脱水，Epon 812树脂包埋，LKB超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅复染，H 600透射电镜观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 扫描电镜下观察结果
未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，细胞表面不光滑，放射状分布大量微绒毛，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列(图1)。而经γ-干扰素诱导的 CCL229细胞形态不一，有的呈梭形，有的为圆形或椭圆形。细胞表面皱褶较多，形成大量不规则突起，针状伪足不如γ-干扰素诱导前的发达，大多萎缩。而微绒毛则呈球状分布于胞体四周(图2)。
图1 未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列 SEM ×2 700
Figure 1 Under scanning electron microscope, more CCL229 cells assumed the shuttle shape to grow without interferon-γ, the spreading out condition was good,and the pointed end stretched out many needle pseudopodium, assumed
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the net form range. SEM ×2 700
图2 经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起，针状伪足多萎缩 SEM ×2 200
Figure 2 With interferon-γ inducing, the surperficial fold of cells formed more rumples and irregular protuberances,and needle pseudo-podium mostly withered SEM ×2 200
2.2 铁蛋白标记抗体免疫电镜观察结果
经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面有许多不规则的绒毛状突起，在突起与凹陷部位可观察到铁蛋白颗粒，其大小均匀，反差强，不难与其它细胞颗粒成分区分。而在细胞内部未发现铁蛋白颗粒，说明铁蛋白标记抗体没能穿透细胞膜进入胞内(图3)。
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图3 经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面可观察到大量铁蛋白颗粒，大小均匀，反差强 ×12 000
Figure 3 With interferon-γ inducing,the CCL229 cells' surface can be observed many ferritin granules whose dimension was even and the contrast was strong, and would not hard to distinguish with other ×12 000
3 讨论
常规扫描电镜下观察到γ-干扰素诱导的CCL229细胞形态不一，细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起。这些突起的性质尚不清楚，估计是由于γ-干扰素诱导使CCL229细胞膜折叠作用加强，膜表面积增大，使原本存在于细胞内部的抗原决定簇暴露在细胞膜表面，而使膜抗原LEA的表达量增加。针状伪足经γ-干扰素诱导后大多萎缩，而微绒毛也缩为球状分布于胞体四周。目前普遍认为，肿瘤细胞的伪足、微绒毛与侵袭力密切相关。恶性肿瘤细胞在侵袭过程中，首先伸出伪足再定向运动至靶部位，并与靶部位基膜接触、粘附，进而释放各种降解酶类破坏基膜成分而逐渐定位[2]。因此，γ-干扰素可能通过降低肿瘤细胞的游动性，影响其侵袭力而使肿瘤细胞转移性降低。
参考文献
1，周伟强，宋今丹. 铁蛋白标记抗体的制备及其在免疫电镜中的应用. 中国医科大学学报，1999,28(4)：256～260
2，孙宝栋，宋今丹.不同人大肠癌细胞的体外侵袭力及相关生物学特性的比较研究.细胞生物学杂志,1996,18(4):185～187
(1999-01-22收稿), http://www.100md.com
单位：周伟强(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)；宋今丹(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，沈阳 110001)
关键词：γ-干扰素；诱导作用；电镜
中国医科大学学报000208 摘要 目的：探讨γ-干扰素对人大肠癌细胞系肿瘤相关抗原 LEA表达的诱导作用。方法：将γ-干扰素与人大肠癌CCL229细胞共育培养，通过免疫铁蛋白电镜观察γ-干扰素对人大肠癌细胞系CCL229诱导作用的超微结构变化。结果：电镜观察发现，γ-干扰素诱导后，CCL229细胞表面皱褶增多，形成大量不规则突起，并且CCL229细胞针状伪足萎缩，微绒毛大多呈球状分布于胞体四周。结论：电镜超微结构的变化与γ-干扰素诱导后 LEA抗原表达量增加有关，并且γ-干扰素可能有抑制肿瘤细胞游走性、降低肿瘤细胞转移性的作用。
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Effect of Interferon-γ on Inducing the Expression of the Large
External Antigen Immunoelectronscope
Zhou Weiqiang, Song Jindan
(Department of Cell Biology, College of Basic Medical Siences, China Medical University, Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To verify interferon-γ's inducing effect on the expression of large external antigen(LEA) tumor related gene. Methods::We cultured interferon-γ together with CCL229 cell, then used electron microscope to observe the ultrastructur changes at CCL229 cell. Results: After the inducing effect of interferon-γ CCL229 cell surfaces are more wrinkled than not induced which implicated that this phenomenum is possible related with the high expression of LEA antigen. CCL229 cell had less pseudopodium after the induction. Pseudopodium even vanished in some cells. Conclusion:Interferon-γ could inhibit the invasiveness and metastasis of tumor cells.
, 百拇医药
KEY WORDS interferon-γ； inducing effection; electron microscope
γ-干扰素作为一种可促进人主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex , MHC)抗原表达的细胞因子，通过上调MHCⅠ、Ⅱ类分子的表达进而影响肿瘤细胞相关抗原的表达。γ-干扰素对大肠癌细胞超微结构的变化，国内外文献未见报道。本文通过γ-干扰素诱导下人大肠癌细胞系CCL229电镜超微结构的变化来说明γ-干扰素诱导作用的本质，为将γ-干扰素用于大肠癌肿瘤疫苗的制备及基因治疗提供重要的实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人大肠癌CCL229细胞由美国哈佛大学医学院Dana-Farber肿瘤研究所惠赠，复苏后于含10%小牛血清的DMEM培养液中，在5% CO2、100%湿度、37℃条件下培养，取对数生长期细胞进行实验研究。
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1.2 试剂
γ-干扰素，北京邦定生物医学公司1996年产品(100万u/ml)，纯度99%；戊二醛，北京华美生物制品公司1997年产品；锇酸，美国Serva公司1997年产品。
1.3 γ-干扰素诱导大肠癌CCL229细胞表达LEA抗原的电镜研究
1.3.1 常规扫描电镜观察：将CCL229细胞盖玻片培养，γ-干扰素以500 u/ml的作用浓度与CCL229细胞共育培养24 h，以 PBS作对照。培养相应时间后，取出盖玻片戊二醛—锇酸双重固定，系列脱水，临界点干燥，金属镀膜后于S450扫描电镜下观察。
1.3.2 免疫铁蛋白电镜观察：将γ-干扰素诱导的CCL229细胞经2.5%戊二醛原位固定后，刮取细胞， 1 000 r/min离心10 min，使其形成细胞团块。细胞团在4%甲醛溶液内，0℃固定2 h，并用四氧化锇后固定2 h。将细胞团浸于ND-1单克隆抗体液中，室温作用30～60 min。以大量冷缓冲液充分洗涤3次，每次30 min。然后浸入铁蛋白标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体液中(制备方法详见文献[1])，室温作用30 min。充分洗涤后，捞取细胞团。四氧化锇固定30 min。常规系列乙醇—丙酮脱水，Epon 812树脂包埋，LKB超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅复染，H 600透射电镜观察。
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2 结果
2.1 扫描电镜下观察结果
未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，细胞表面不光滑，放射状分布大量微绒毛，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列(图1)。而经γ-干扰素诱导的 CCL229细胞形态不一，有的呈梭形，有的为圆形或椭圆形。细胞表面皱褶较多，形成大量不规则突起，针状伪足不如γ-干扰素诱导前的发达，大多萎缩。而微绒毛则呈球状分布于胞体四周(图2)。
图1 未经γ-干扰素诱导的CCL229细胞多呈梭形生长，铺展状况良好，梭形尖端伸出许多针状伪足，呈网状排列 SEM ×2 700
Figure 1 Under scanning electron microscope, more CCL229 cells assumed the shuttle shape to grow without interferon-γ, the spreading out condition was good,and the pointed end stretched out many needle pseudopodium, assumed
, http://www.100md.com
the net form range. SEM ×2 700
图2 经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起，针状伪足多萎缩 SEM ×2 200
Figure 2 With interferon-γ inducing, the surperficial fold of cells formed more rumples and irregular protuberances,and needle pseudo-podium mostly withered SEM ×2 200
2.2 铁蛋白标记抗体免疫电镜观察结果
经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面有许多不规则的绒毛状突起，在突起与凹陷部位可观察到铁蛋白颗粒，其大小均匀，反差强，不难与其它细胞颗粒成分区分。而在细胞内部未发现铁蛋白颗粒，说明铁蛋白标记抗体没能穿透细胞膜进入胞内(图3)。
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图3 经γ-干扰素诱导的CCL229细胞表面可观察到大量铁蛋白颗粒，大小均匀，反差强 ×12 000
Figure 3 With interferon-γ inducing,the CCL229 cells' surface can be observed many ferritin granules whose dimension was even and the contrast was strong, and would not hard to distinguish with other ×12 000
3 讨论
常规扫描电镜下观察到γ-干扰素诱导的CCL229细胞形态不一，细胞表面皱褶较多，形成许多不规则突起。这些突起的性质尚不清楚，估计是由于γ-干扰素诱导使CCL229细胞膜折叠作用加强，膜表面积增大，使原本存在于细胞内部的抗原决定簇暴露在细胞膜表面，而使膜抗原LEA的表达量增加。针状伪足经γ-干扰素诱导后大多萎缩，而微绒毛也缩为球状分布于胞体四周。目前普遍认为，肿瘤细胞的伪足、微绒毛与侵袭力密切相关。恶性肿瘤细胞在侵袭过程中，首先伸出伪足再定向运动至靶部位，并与靶部位基膜接触、粘附，进而释放各种降解酶类破坏基膜成分而逐渐定位[2]。因此，γ-干扰素可能通过降低肿瘤细胞的游动性，影响其侵袭力而使肿瘤细胞转移性降低。
参考文献
1，周伟强，宋今丹. 铁蛋白标记抗体的制备及其在免疫电镜中的应用. 中国医科大学学报，1999,28(4)：256～260
2，孙宝栋，宋今丹.不同人大肠癌细胞的体外侵袭力及相关生物学特性的比较研究.细胞生物学杂志,1996,18(4):185～187
(1999-01-22收稿), http://www.100md.com