乐胃煎对胃癌前病变大鼠胃粘膜上皮细胞动力学的影响★
作者：蔡淦 王松坡 窦丹波 林江
单位：蔡淦 窦丹波 林江(上海中医药大学附属曙光医院(200021))；王松坡(上海市第一人民医院(200080))
关键词：胃粘膜；病理学；＠乐胃煎；药效学；癌前病变；药物作用；细胞动力学▲
新中医000218摘 要：采用100g/L甲基硝基亚硝基胍饮用液自由饮用24周，建立大鼠胃癌前病变(GPL)模型。应用乐胃煎治疗12周，结果胃粘膜上皮细胞DNA含量和多倍体比率显著低于模型对照组(P<0.01)。与维甲酸比较，乐胃煎能更有效地降低胃粘膜细胞DNA含量。提示：乐胃煎可能通过影响胃粘膜上皮细胞动力学而阻断GPL的发展。
伴发于萎缩性胃炎基础上的异型增生(Dys)作为最直接的胃癌前病变(GPL)已得到公认。阻断GPL的发展，是目前降低胃癌发生率的有效措施之一。中医辨证与辨病相结合，在治疗GPL方面积累了不少经验并取得了一定的成果。乐胃煎具有健脾益气、化痰祛瘀、清热解毒作用，治疗GPL取得了较好疗效。本研究旨在验证乐胃煎治疗GPL的疗效并探讨其可能的作用机制。
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1 材料和方法
1.1 材料 纯系Wistar大鼠(上海医科大学实验动物中心提供)80只，雄性，10周龄；维甲酸(上海市第六制药厂，批号970101)；乐胃煎(由党参、白术、陈皮、半夏、莪术、黄连、白花蛇舌草等组成。每ml含生药2.13 g，上海中医药大学附属曙光医院提供)；KS400图像分析系统(德国远东ZWISS公司)。
1.2 方法
1.2.1 甲基硝基亚硝基胍(MNNG)的制备 参考朱正纲〔1〕等方法，略作改良。
1.2.2 大鼠腺胃癌前病变模型的建立及诊断标准 限期饮水给药造模法，将MNNG溶于双蒸水制成1 g/L的母液，密闭，4℃避光保存，使用时以自来水稀释成100mg/L的饮用液。储存液每周配制1次，饮用液每天新鲜配制，供模型组大鼠自由饮用，连续24周。正常对照组大鼠给予自来水。
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大鼠胃由前胃和腺胃组成，前胃被覆鳞状上皮细胞，可发生鳞状细胞癌。腺胃则主要由腺上皮细胞构成，与人类胃相似，可发生胃炎、癌前病变乃致癌变。因此，大鼠胃癌前病变主要是指大鼠腺胃而言。大鼠胃粘膜萎缩、肠化生、异型增生、腺癌参照全国胃癌防治研究协作组病理组制定的标准〔2〕进行诊断，各项病理改变均根据其程度分为轻、中、重3级。
1.2.3 动物分组及用药 正常对照组，12只，饲以普通颗粒饲料及自来水，不行造模。剩余大鼠均行造模，造模结束(24周)时随机抽检8只了解GPL发生情况。剩余存活大鼠即为有效动物，再随机分为下面3组：模型对照组，18只，造模结束后(25周起)，每天1次灌服自来水1 ml/0.1 kg体重，共12周；维甲酸对照组，16只，造模结束后，每天1次灌服维甲酸悬液，4 mg/1 ml/0.1 kg体重，共12周；乐胃煎治疗组，16只，造模结束后，每天1次灌服乐胃煎浓缩液，2.98 g/1 ml/0.1 kg体重，共12周，所有动物均36周末处死。
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1.2.4 观察指标及方法 实验结束，将各组大鼠于乙醚吸入麻醉下摘离全胃，迅速沿大弯侧剪开，冷生理盐水漂洗内容物后，置10%中性福尔马林液中，固定24小时后沿小弯方向剪成约2 mm的条状物，按顺序石蜡包埋，5 mm切片，行H.E、Feulgen等染色，备用。①大鼠一般情况：精神状态、活动度、进食饮水情况、毛发、大便性状、体重等。②常规病理：H.E、AB(pH 2.5)/PAS、HID/AB(pH 2.5)染色。③胃粘膜上皮细胞动力学指标：DNA含量及倍体分布，Feulgen染色切片测定。每组随机抽取12例(正常组全部)，在40×物镜下，将Feulgen染色切片典型视野(每个视野至少5个完整腺体)经摄像机输入图像终端，测得每个细胞核的光密度值(OD，入射光强度除以出射光强度，再取对数)，乘以被测细胞核的面积，得积分光密度(IOD)，此值即代表细胞核DNA的相对含量。同时测定20～30个间质淋巴细胞核含量作内参，以间质淋巴细胞核的2C细胞上限值(IOD值中位数的1.25倍〔3〕)为基准，计算出2C、3C～4C、5C及大于5C(计为非整倍体细胞)数及其占病变细胞群体的百分数，并作统计学处理。
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1.2.5 统计方法 SPSS统计软件包，等级资料用Ridit分析，多样本均数用方差分析。
2 结果
造模结束时，抽检8只大鼠胃粘膜均见异型增生，其中轻度4只，中度3只，重度1只。统计学推断此时模型大鼠异型增生发生率95%可信区间为63%～100%，可以认为本实验GPL大鼠模型建立成功。
大鼠死亡情况：造模第7周、14周各死亡1只。第26周、30周，模型对照组、乐胃煎组各因灌胃死亡1只。所有大鼠均未见明显肿瘤发生。
2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠神态安逸，行动敏捷，被毛光泽贴身，食量较大且稳定，大便呈颗粒状，尾色淡红。模型组大鼠精神萎靡，懒于活动且迟钝，被毛松散不泽，食量较小，大便常干溏不调，尾色淡白或苍白。造模第1个月末，模型大鼠体重较正常为小，至造模结束时，体重差异明显(分别为292±27g、391±26 g，P<0.01)。经治疗12周，乐胃煎组大鼠体重(397±22g)较模型组(346±25g)明显增加(P<0.01)，而维甲酸组体重(342±29 g)与模型组差异无显著意义(P>0.05)。
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2.2 常规病理情况。见表1。
2.3 DNA含量及倍体分布情况。见表2。
表1
各组大鼠病理组织学情况 组 别
n
异型增生
肿 瘤 (%)
++
+++
合计(%)
模型组
17
, 百拇医药
5
3
8(47.06)※※
3(17.65)※※
维甲酸组
16
3
1
4(25.00)※△
1(6.25)※△
乐胃煎组
15
, 百拇医药
3
2
5(33.33)※△
0(0.00)※△
正常组
12
0
0
0(0.00)
0(0.00)
与正常组比较※P<0.05，※ ※P<0.01；与模型组比较△P<0.05
, 百拇医药
表2
DNA含量及倍体分析 组 别
DNA含量
2C(%)
3～4C(%)
5C(%)
>5C(%)
模型组
30.94±10.83※
17.99
61.51
16.32
, 百拇医药
4.18※
维甲酸组
24.30±8.02※＃
45.78
48.19
4.82
1.20※＃
乐胃煎组
21.92±7.45※＃△
54.32
41.98
, 百拇医药
2.06
1.65※＃
正常组
17.91±3.55
78.95
21.05
0
0
与正常组比较※P<0.01；与模型组比较＃P<0.01；与维甲酸组比较△P<0.01。
3 讨论
GPL病程迁延，多以脾胃虚弱为基础，病变逐步发展致气、痰、瘀交互为患，搏结胃络，积久不散，蕴热成毒，即可变生肠化、异型增生等有形之疾而成GPL。乐胃煎是在中医辨证的基础上，结合GPL的现代病理学特征，经过多年临床优化而成。方中党参、白术等益气健脾；陈皮、半夏等理气化痰；莪术等活血化瘀；黄连、白花蛇舌草等清热解毒。全方消补兼施，寒凉并用，辛开苦降，气血同调，施于临床，疗效满意。动物实验病理表明：乐胃煎组大鼠胃粘膜中、重度异型增生及癌变的发生明显低于未加治疗的模型对照组，而与维甲酸组差异无显著性意义。提示乐胃煎能在一定程度上阻断甚至逆转实验性大鼠GPL的发展，疗效与维甲酸相似。
, 百拇医药
通过对细胞周期不同阶段DNA含量变化的测定，业已证实G1/G0(DNA合成前期)期细胞呈2C分布；G2+M(DNA合成后期+分裂期)期细胞呈4C分布；S(DNA合成期)期细胞为3C～4C分布。当胃粘膜处于癌前病变或癌变时，细胞增殖活跃逐渐增高，DNA含量增加，S期细胞比例增加，并出现非整倍体(aneuploidy)〔4〕。本实验发现模型对照组大鼠胃粘膜DNA含量明显高于正常组大鼠，近2/3的细胞为3C～4C，并有较多5C及超5C细胞，而正常对照组绝大部分细胞为二倍体，无5C及超5C细胞，2组差异有显著性意义，表明癌前病变大鼠胃粘膜具有比正常更高的增殖活性。乐胃煎治疗组DNA含量显著低于模型对照组，1/2以上的细胞为二倍体，3C～4C、5C及超5C细胞比率亦低于模型对照组，表明乐胃煎能明显抑制大鼠GPL胃粘膜细胞的增殖活性。乐胃煎组与维甲酸组比较，倍体分布有降低的趋势，而DNA含量则明显降低，说明乐胃煎降低DNA含量的作用较维甲酸更为明显。乐胃煎能显著降低GPL细胞DNA含量，改善倍体分布，提示乐胃煎可通过抑制GPL大鼠胃粘膜的增殖活性，阻断GPL的发展。■
, 百拇医药
★国家中医药管理局资助课题(95L010)
参考文献：
[1]朱正纲，燕 敏，尹浩然，等.甲基硝基亚硝基胍诱发大鼠胃癌的实验研究.上海第二医科大学学报，1992，12(2)∶121
[2]全国胃癌防治研究协作组病理组.胃及十二指肠粘膜活检病理.沈阳：辽宁人民出版社，1981.28
[3]Erhardt K，Auer G，Bjorkholm E，et al. Prognostic significance of muclear DNA content in serous tumors.Cancer Res.1984，44(5)∶2198
[4]Miracco C，Spina D，Vindigni C，et al.. Cell proliferation patterns and P53 expression in gastric dysplasia.Int J Cancer.1995，62(2)∶149
修回日期：1999-10-05, 百拇医药
单位：蔡淦 窦丹波 林江(上海中医药大学附属曙光医院(200021))；王松坡(上海市第一人民医院(200080))
关键词：胃粘膜；病理学；＠乐胃煎；药效学；癌前病变；药物作用；细胞动力学▲
新中医000218摘 要：采用100g/L甲基硝基亚硝基胍饮用液自由饮用24周，建立大鼠胃癌前病变(GPL)模型。应用乐胃煎治疗12周，结果胃粘膜上皮细胞DNA含量和多倍体比率显著低于模型对照组(P<0.01)。与维甲酸比较，乐胃煎能更有效地降低胃粘膜细胞DNA含量。提示：乐胃煎可能通过影响胃粘膜上皮细胞动力学而阻断GPL的发展。
伴发于萎缩性胃炎基础上的异型增生(Dys)作为最直接的胃癌前病变(GPL)已得到公认。阻断GPL的发展，是目前降低胃癌发生率的有效措施之一。中医辨证与辨病相结合，在治疗GPL方面积累了不少经验并取得了一定的成果。乐胃煎具有健脾益气、化痰祛瘀、清热解毒作用，治疗GPL取得了较好疗效。本研究旨在验证乐胃煎治疗GPL的疗效并探讨其可能的作用机制。
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1 材料和方法
1.1 材料 纯系Wistar大鼠(上海医科大学实验动物中心提供)80只，雄性，10周龄；维甲酸(上海市第六制药厂，批号970101)；乐胃煎(由党参、白术、陈皮、半夏、莪术、黄连、白花蛇舌草等组成。每ml含生药2.13 g，上海中医药大学附属曙光医院提供)；KS400图像分析系统(德国远东ZWISS公司)。
1.2 方法
1.2.1 甲基硝基亚硝基胍(MNNG)的制备 参考朱正纲〔1〕等方法，略作改良。
1.2.2 大鼠腺胃癌前病变模型的建立及诊断标准 限期饮水给药造模法，将MNNG溶于双蒸水制成1 g/L的母液，密闭，4℃避光保存，使用时以自来水稀释成100mg/L的饮用液。储存液每周配制1次，饮用液每天新鲜配制，供模型组大鼠自由饮用，连续24周。正常对照组大鼠给予自来水。
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大鼠胃由前胃和腺胃组成，前胃被覆鳞状上皮细胞，可发生鳞状细胞癌。腺胃则主要由腺上皮细胞构成，与人类胃相似，可发生胃炎、癌前病变乃致癌变。因此，大鼠胃癌前病变主要是指大鼠腺胃而言。大鼠胃粘膜萎缩、肠化生、异型增生、腺癌参照全国胃癌防治研究协作组病理组制定的标准〔2〕进行诊断，各项病理改变均根据其程度分为轻、中、重3级。
1.2.3 动物分组及用药 正常对照组，12只，饲以普通颗粒饲料及自来水，不行造模。剩余大鼠均行造模，造模结束(24周)时随机抽检8只了解GPL发生情况。剩余存活大鼠即为有效动物，再随机分为下面3组：模型对照组，18只，造模结束后(25周起)，每天1次灌服自来水1 ml/0.1 kg体重，共12周；维甲酸对照组，16只，造模结束后，每天1次灌服维甲酸悬液，4 mg/1 ml/0.1 kg体重，共12周；乐胃煎治疗组，16只，造模结束后，每天1次灌服乐胃煎浓缩液，2.98 g/1 ml/0.1 kg体重，共12周，所有动物均36周末处死。
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1.2.4 观察指标及方法 实验结束，将各组大鼠于乙醚吸入麻醉下摘离全胃，迅速沿大弯侧剪开，冷生理盐水漂洗内容物后，置10%中性福尔马林液中，固定24小时后沿小弯方向剪成约2 mm的条状物，按顺序石蜡包埋，5 mm切片，行H.E、Feulgen等染色，备用。①大鼠一般情况：精神状态、活动度、进食饮水情况、毛发、大便性状、体重等。②常规病理：H.E、AB(pH 2.5)/PAS、HID/AB(pH 2.5)染色。③胃粘膜上皮细胞动力学指标：DNA含量及倍体分布，Feulgen染色切片测定。每组随机抽取12例(正常组全部)，在40×物镜下，将Feulgen染色切片典型视野(每个视野至少5个完整腺体)经摄像机输入图像终端，测得每个细胞核的光密度值(OD，入射光强度除以出射光强度，再取对数)，乘以被测细胞核的面积，得积分光密度(IOD)，此值即代表细胞核DNA的相对含量。同时测定20～30个间质淋巴细胞核含量作内参，以间质淋巴细胞核的2C细胞上限值(IOD值中位数的1.25倍〔3〕)为基准，计算出2C、3C～4C、5C及大于5C(计为非整倍体细胞)数及其占病变细胞群体的百分数，并作统计学处理。
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1.2.5 统计方法 SPSS统计软件包，等级资料用Ridit分析，多样本均数用方差分析。
2 结果
造模结束时，抽检8只大鼠胃粘膜均见异型增生，其中轻度4只，中度3只，重度1只。统计学推断此时模型大鼠异型增生发生率95%可信区间为63%～100%，可以认为本实验GPL大鼠模型建立成功。
大鼠死亡情况：造模第7周、14周各死亡1只。第26周、30周，模型对照组、乐胃煎组各因灌胃死亡1只。所有大鼠均未见明显肿瘤发生。
2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠神态安逸，行动敏捷，被毛光泽贴身，食量较大且稳定，大便呈颗粒状，尾色淡红。模型组大鼠精神萎靡，懒于活动且迟钝，被毛松散不泽，食量较小，大便常干溏不调，尾色淡白或苍白。造模第1个月末，模型大鼠体重较正常为小，至造模结束时，体重差异明显(分别为292±27g、391±26 g，P<0.01)。经治疗12周，乐胃煎组大鼠体重(397±22g)较模型组(346±25g)明显增加(P<0.01)，而维甲酸组体重(342±29 g)与模型组差异无显著意义(P>0.05)。
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2.2 常规病理情况。见表1。
2.3 DNA含量及倍体分布情况。见表2。
表1
各组大鼠病理组织学情况 组 别
n
异型增生
肿 瘤 (%)
++
+++
合计(%)
模型组
17
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5
3
8(47.06)※※
3(17.65)※※
维甲酸组
16
3
1
4(25.00)※△
1(6.25)※△
乐胃煎组
15
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3
2
5(33.33)※△
0(0.00)※△
正常组
12
0
0
0(0.00)
0(0.00)
与正常组比较※P<0.05，※ ※P<0.01；与模型组比较△P<0.05
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表2
DNA含量及倍体分析 组 别
DNA含量
2C(%)
3～4C(%)
5C(%)
>5C(%)
模型组
30.94±10.83※
17.99
61.51
16.32
, 百拇医药
4.18※
维甲酸组
24.30±8.02※＃
45.78
48.19
4.82
1.20※＃
乐胃煎组
21.92±7.45※＃△
54.32
41.98
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2.06
1.65※＃
正常组
17.91±3.55
78.95
21.05
0
0
与正常组比较※P<0.01；与模型组比较＃P<0.01；与维甲酸组比较△P<0.01。
3 讨论
GPL病程迁延，多以脾胃虚弱为基础，病变逐步发展致气、痰、瘀交互为患，搏结胃络，积久不散，蕴热成毒，即可变生肠化、异型增生等有形之疾而成GPL。乐胃煎是在中医辨证的基础上，结合GPL的现代病理学特征，经过多年临床优化而成。方中党参、白术等益气健脾；陈皮、半夏等理气化痰；莪术等活血化瘀；黄连、白花蛇舌草等清热解毒。全方消补兼施，寒凉并用，辛开苦降，气血同调，施于临床，疗效满意。动物实验病理表明：乐胃煎组大鼠胃粘膜中、重度异型增生及癌变的发生明显低于未加治疗的模型对照组，而与维甲酸组差异无显著性意义。提示乐胃煎能在一定程度上阻断甚至逆转实验性大鼠GPL的发展，疗效与维甲酸相似。
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通过对细胞周期不同阶段DNA含量变化的测定，业已证实G1/G0(DNA合成前期)期细胞呈2C分布；G2+M(DNA合成后期+分裂期)期细胞呈4C分布；S(DNA合成期)期细胞为3C～4C分布。当胃粘膜处于癌前病变或癌变时，细胞增殖活跃逐渐增高，DNA含量增加，S期细胞比例增加，并出现非整倍体(aneuploidy)〔4〕。本实验发现模型对照组大鼠胃粘膜DNA含量明显高于正常组大鼠，近2/3的细胞为3C～4C，并有较多5C及超5C细胞，而正常对照组绝大部分细胞为二倍体，无5C及超5C细胞，2组差异有显著性意义，表明癌前病变大鼠胃粘膜具有比正常更高的增殖活性。乐胃煎治疗组DNA含量显著低于模型对照组，1/2以上的细胞为二倍体，3C～4C、5C及超5C细胞比率亦低于模型对照组，表明乐胃煎能明显抑制大鼠GPL胃粘膜细胞的增殖活性。乐胃煎组与维甲酸组比较，倍体分布有降低的趋势，而DNA含量则明显降低，说明乐胃煎降低DNA含量的作用较维甲酸更为明显。乐胃煎能显著降低GPL细胞DNA含量，改善倍体分布，提示乐胃煎可通过抑制GPL大鼠胃粘膜的增殖活性，阻断GPL的发展。■
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★国家中医药管理局资助课题(95L010)
参考文献：
[1]朱正纲，燕 敏，尹浩然，等.甲基硝基亚硝基胍诱发大鼠胃癌的实验研究.上海第二医科大学学报，1992，12(2)∶121
[2]全国胃癌防治研究协作组病理组.胃及十二指肠粘膜活检病理.沈阳：辽宁人民出版社，1981.28
[3]Erhardt K，Auer G，Bjorkholm E，et al. Prognostic significance of muclear DNA content in serous tumors.Cancer Res.1984，44(5)∶2198
[4]Miracco C，Spina D，Vindigni C，et al.. Cell proliferation patterns and P53 expression in gastric dysplasia.Int J Cancer.1995，62(2)∶149
修回日期：1999-10-05, 百拇医药