西洋参DNA导入大豆实现遗传转化的研究Ⅱ.导入后代异黄酮类成分的含量测定
作者：刘塔斯 麻浩 田森林 川村智子 田中俊弘
单位：刘塔斯(湖南中医学院中药系，长沙 410007)；麻浩 田森林(湖南农业大学植物科技学院)；川村智子(日本名城大学生药学教研室)；田中俊弘(日本岐阜药科大学药草园研究室)
关键词：西洋参DNA导入大豆后代；大豆苷；大豆黄素；染料木苷；染料木素；HPLC法
中草药000211 摘 要 用高效液相色谱法测定了西洋参DNA导入大豆后代的异黄酮类成分、大豆苷(daidzin)、大豆黄素(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)的含量，采用Unisil Q C18柱，4.6 mm×250 mm，流动相乙腈-0.003 mol/L磷酸氢二钠(17∶83)，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，结果表明，4种成分分离效果好，成分含量发生了广泛变异，从中可筛选出有效成分含量较高的新材料。
, 百拇医药
Genetic Transformation of Soybeans by Soaking Its Seeds with the Total DNA of American Ginseng (Panax quinquefolium) Ⅱ. Determination of Isoflavone Content by HPLC
Liu Tasi
(Department of Chinese Materia Medica, Hunan College of Traditional Chinese Medicine Changsha 410007)
Ma Hao and Tian Senlin
(College of Plant Science and Technology, Hunan Agriculture University)
, 百拇医药
Tomoko Kawamora
(Department of Pharmacognosy, Meijo University, Meijo, Japan)
Toshihiro Tanaka
(Gifu Pharmaceutical University, Japan)
Abstract A method for the determination of isoflavone content in the transformed progenies of soybean by HPLC was reported. Using unisil Q C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), with a mobile phase of CH3CN-0.003 mol/L Na2HPO4 (17∶83), a detecting wavelength at 254 nm, and flow rate of 1.0 mL/min,it was found that the contents of daidzein, genistein, daidzin and genistin in the transformed progenies of soybean changed greatly and could be separated effectively, which makes it possible to cultivate and develop the best progeny for further development.
, http://www.100md.com
Key words the transformed progenies of soybean with the total DNA of American Ginseng daidzin daidzein genistin genistein HPLC▲
我们已知道了将西洋参DNA导入大豆后代的形态性状变化[1]，本文主要讨论导入基因大豆后代的品质评价，首先报道对其4种有效成分：大豆苷、大豆黄素、染料木苷，染料木素的含量测定。大豆苷等成分具有降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管流量，缓解心绞痛，抗氧化[2]等药效作用，染料木苷类成分据日本癌学会和国内资料显示[3，4]，对前列腺癌等有一定的抑制作用，导入后代中异黄酮类成分含量如何，我们采用高效液相法测定了4种成分的含量，以期望培育出有一定药用价值或保健作用的栽培大豆新材料和新品系，以利开发应用。
, 百拇医药
1-大豆黄素 2-染料木素
3-大豆苷 4-染料木苷
图1 标准品色谱图
1-大豆黄素 2-染料木素
3-大豆苷 4-染料木苷
图2 Y10-12-2样品色谱图
1 仪器与试药
1.1 仪器：Unisil Q C18高效液相色谱仪，Water 510 泵，检测器：484可变波长紫外检测器；712自动注入装置。测试地点：日本名城大学生药学教研室。
, 百拇医药
1.2 试药：所有试剂为分析纯或色谱纯。对照品：大豆苷(daidzin)，大豆黄素(daidzein)，染料木苷(genistin)，染料木素(genistein)购于日本Funakoshi Co.,西洋参DNA导入大豆材料来自于湖南农业大学，由课题组麻浩提供。
以上4种保留时间：大豆黄素5.5 min，染料木素7.5 min，大豆苷9.8 min，染料木苷19.0 min，色谱图见图1～3。
1-大豆黄素 2-染料木素 3-大豆苷 4-染料木苷
图3 Y10-30-1样品色谱图
1.3 色谱条件：Unisil Q C18色谱柱4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相：乙腈-0.003 mol/L磷酸氢二钠(17∶83)，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，检测波长254 nm，灵敏度0.020 AUFS，进样量10 μL。
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2 方法与结果[5]
2.1 线性实验：精密称取以上4种对照品，用甲醇溶解，制成浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的标准溶液。吸取溶液各10 μL分别进样，测定峰面积，并以峰面积(y)对样品浓度(x)进行线性回归分析，分别得回归方程为：
大豆苷：y=6.249 5×105x-188.055，r=0.999 9，在2.588 0～33.000 0 μg/mL间呈线性关系。
大豆黄素：y=3.461 2×106x-105.476 7，r=0.999 9，在6.438 0～38.627 0 μg/mL间呈线性关系。
染料木苷：y=3.479 3×106x-320.547 6，r=0.999 8，在3.255 0～41.500 0 μg/mL间呈线性关系。
, http://www.100md.com
染料木素：y=2.389 1×106x-911.285 9，r=0.999 9，在2.011 0～17.091 0 μg/mL间呈线性关系。
2.2 稳定性实验：准确分别吸取4种对照品溶液10 μL,分别于30，60，120 min进样测定，考察其稳定性，结果表明1 h内峰面积积分值稳定。
2.3 回收率及精密度实验：精密吸取4种对照品溶液，在上述色谱条件下，直接测得其峰面积，重复测定4次，并计算回收率，测得结果见表1。
2.4 样品测定：取大豆研磨粉碎，约200 mg，精密称定，置具塞锥瓶中，加入甲醇2 mL密封，35 ℃超声处理30 min，取出，静置10 min，取上清液；残渣加入甲醇2 mL，照上法重复处理，合并滤液至刻度，测试，进样量各为10 μL,分析结果见表2。
表1 回收率实验结果 样 品
, http://www.100md.com
进样浓度
(mg/mL)
峰面积
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD(%)
(n=4)
大豆苷
0.038 6
23 894
23 869
, 百拇医药
23 919
23 892
99.74
0.085 5
大豆黄素
0.016 5
56 530
57 006
57 489
57 008
100.01
0.686 8
, http://www.100md.com 染料木苷
0.017 1
58 682
59 732
59 137
59 184
100.08
100.05
0.726 4
染料木素
0.041 5
98 595
98 465
, 百拇医药
98 724
98 593
100.36
0.107 2
表2 导入基因大豆后代的异黄酮的含量(mg/100 mg) 样品
大豆黄素
染料木素
大豆苷
染料木苷
Y10-10-3
0.000 5
0.001 3
, 百拇医药
0.009 5
0.017 6
Y10-12-1
0.001 2
0.001 5
0.011 7
0.010 4
Y10-12-2
0.010 2
0.012 5
0.057 3
0.056 8
, http://www.100md.com
Y10-15-3
0.001 2
0.001 9
0.007 2
0.012 0
Y10-15-13
0.001 1
0.002 0
0.018 3
0.028 7
Y10-30-1
, 百拇医药
0.005 7
0.008 4
0.027 9
0.030 1
Y10-30-2
0.004 8
0.005 6
0.018 8
0.020 8
Y10-30-3
0.002 0
0.003 8
, 百拇医药
0.019 8
0.032 4
Y10-42-1
0.000 8
0.001 2
0.011 1
0.015 2
Y10-43-2
0.001 5
0.002 4
0.021 5
0.031 4
, 百拇医药
Y10-53-1
0.001 0
0.002 3
0.011 5
0.021 1
湘春豆10号
0.001 2
0.001 7
0.015 3
0.018 5
3 小结
3.1 对12批样品4种异黄酮类成分含量测定结果表明，导入西洋参DNA基因后的大豆异黄酮类含量发生了广泛的变异，与样本湘春豆10号比较，就大豆黄素成分而言，高于受体亲本的样品数有5个；染料木素成分，有8个样品明显高于亲本，大豆苷成分，有6个样品；染料木苷成分，有7个样品。其中Y10-30-2，Y10-30-3，Y10-12-2，Y10-30-1样品的4种成分含量大大的高于亲本湘春豆10号。此结果也表明，西洋参DNA导入大豆后，提高了大豆的有效成分含量，从中可望筛选出有效成分含量较高的株系进一步栽培，培育出大豆新的种资源。
, 百拇医药
3.2 经反复实验，此HPLC法能同时测定大豆中的4种异黄酮类成分的含量，分离良好，方法比较简便，快速。
参考文献
1，麻 浩，等.中草药，2000，(1)：51
2，郭建平，等.中草药，1995，26(3)：163，(6)：298
3，白井智之，等.第57回日本癌学会总会，横滨，1998，92
4，国家医药管理局中草药情报中心站编.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社，1986：493
5，早川顺子，等.药学杂志，1984：104(1)：50
(1999-02-09 收稿), http://www.100md.com
单位：刘塔斯(湖南中医学院中药系，长沙 410007)；麻浩 田森林(湖南农业大学植物科技学院)；川村智子(日本名城大学生药学教研室)；田中俊弘(日本岐阜药科大学药草园研究室)
关键词：西洋参DNA导入大豆后代；大豆苷；大豆黄素；染料木苷；染料木素；HPLC法
中草药000211 摘 要 用高效液相色谱法测定了西洋参DNA导入大豆后代的异黄酮类成分、大豆苷(daidzin)、大豆黄素(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)的含量，采用Unisil Q C18柱，4.6 mm×250 mm，流动相乙腈-0.003 mol/L磷酸氢二钠(17∶83)，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，结果表明，4种成分分离效果好，成分含量发生了广泛变异，从中可筛选出有效成分含量较高的新材料。
, 百拇医药
Genetic Transformation of Soybeans by Soaking Its Seeds with the Total DNA of American Ginseng (Panax quinquefolium) Ⅱ. Determination of Isoflavone Content by HPLC
Liu Tasi
(Department of Chinese Materia Medica, Hunan College of Traditional Chinese Medicine Changsha 410007)
Ma Hao and Tian Senlin
(College of Plant Science and Technology, Hunan Agriculture University)
, 百拇医药
Tomoko Kawamora
(Department of Pharmacognosy, Meijo University, Meijo, Japan)
Toshihiro Tanaka
(Gifu Pharmaceutical University, Japan)
Abstract A method for the determination of isoflavone content in the transformed progenies of soybean by HPLC was reported. Using unisil Q C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), with a mobile phase of CH3CN-0.003 mol/L Na2HPO4 (17∶83), a detecting wavelength at 254 nm, and flow rate of 1.0 mL/min,it was found that the contents of daidzein, genistein, daidzin and genistin in the transformed progenies of soybean changed greatly and could be separated effectively, which makes it possible to cultivate and develop the best progeny for further development.
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Key words the transformed progenies of soybean with the total DNA of American Ginseng daidzin daidzein genistin genistein HPLC▲
我们已知道了将西洋参DNA导入大豆后代的形态性状变化[1]，本文主要讨论导入基因大豆后代的品质评价，首先报道对其4种有效成分：大豆苷、大豆黄素、染料木苷，染料木素的含量测定。大豆苷等成分具有降低心肌耗氧量，增加冠脉、脑血管流量，缓解心绞痛，抗氧化[2]等药效作用，染料木苷类成分据日本癌学会和国内资料显示[3，4]，对前列腺癌等有一定的抑制作用，导入后代中异黄酮类成分含量如何，我们采用高效液相法测定了4种成分的含量，以期望培育出有一定药用价值或保健作用的栽培大豆新材料和新品系，以利开发应用。
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1-大豆黄素 2-染料木素
3-大豆苷 4-染料木苷
图1 标准品色谱图
1-大豆黄素 2-染料木素
3-大豆苷 4-染料木苷
图2 Y10-12-2样品色谱图
1 仪器与试药
1.1 仪器：Unisil Q C18高效液相色谱仪，Water 510 泵，检测器：484可变波长紫外检测器；712自动注入装置。测试地点：日本名城大学生药学教研室。
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1.2 试药：所有试剂为分析纯或色谱纯。对照品：大豆苷(daidzin)，大豆黄素(daidzein)，染料木苷(genistin)，染料木素(genistein)购于日本Funakoshi Co.,西洋参DNA导入大豆材料来自于湖南农业大学，由课题组麻浩提供。
以上4种保留时间：大豆黄素5.5 min，染料木素7.5 min，大豆苷9.8 min，染料木苷19.0 min，色谱图见图1～3。
1-大豆黄素 2-染料木素 3-大豆苷 4-染料木苷
图3 Y10-30-1样品色谱图
1.3 色谱条件：Unisil Q C18色谱柱4.6 mm×250 mm，5 μm，流动相：乙腈-0.003 mol/L磷酸氢二钠(17∶83)，流速1.0 ml/min，柱温35 ℃，检测波长254 nm，灵敏度0.020 AUFS，进样量10 μL。
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2 方法与结果[5]
2.1 线性实验：精密称取以上4种对照品，用甲醇溶解，制成浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的标准溶液。吸取溶液各10 μL分别进样，测定峰面积，并以峰面积(y)对样品浓度(x)进行线性回归分析，分别得回归方程为：
大豆苷：y=6.249 5×105x-188.055，r=0.999 9，在2.588 0～33.000 0 μg/mL间呈线性关系。
大豆黄素：y=3.461 2×106x-105.476 7，r=0.999 9，在6.438 0～38.627 0 μg/mL间呈线性关系。
染料木苷：y=3.479 3×106x-320.547 6，r=0.999 8，在3.255 0～41.500 0 μg/mL间呈线性关系。
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染料木素：y=2.389 1×106x-911.285 9，r=0.999 9，在2.011 0～17.091 0 μg/mL间呈线性关系。
2.2 稳定性实验：准确分别吸取4种对照品溶液10 μL,分别于30，60，120 min进样测定，考察其稳定性，结果表明1 h内峰面积积分值稳定。
2.3 回收率及精密度实验：精密吸取4种对照品溶液，在上述色谱条件下，直接测得其峰面积，重复测定4次，并计算回收率，测得结果见表1。
2.4 样品测定：取大豆研磨粉碎，约200 mg，精密称定，置具塞锥瓶中，加入甲醇2 mL密封，35 ℃超声处理30 min，取出，静置10 min，取上清液；残渣加入甲醇2 mL，照上法重复处理，合并滤液至刻度，测试，进样量各为10 μL,分析结果见表2。
表1 回收率实验结果 样 品
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进样浓度
(mg/mL)
峰面积
回收率
(%)
平均值
(%)
RSD(%)
(n=4)
大豆苷
0.038 6
23 894
23 869
, 百拇医药
23 919
23 892
99.74
0.085 5
大豆黄素
0.016 5
56 530
57 006
57 489
57 008
100.01
0.686 8
, http://www.100md.com 染料木苷
0.017 1
58 682
59 732
59 137
59 184
100.08
100.05
0.726 4
染料木素
0.041 5
98 595
98 465
, 百拇医药
98 724
98 593
100.36
0.107 2
表2 导入基因大豆后代的异黄酮的含量(mg/100 mg) 样品
大豆黄素
染料木素
大豆苷
染料木苷
Y10-10-3
0.000 5
0.001 3
, 百拇医药
0.009 5
0.017 6
Y10-12-1
0.001 2
0.001 5
0.011 7
0.010 4
Y10-12-2
0.010 2
0.012 5
0.057 3
0.056 8
, http://www.100md.com
Y10-15-3
0.001 2
0.001 9
0.007 2
0.012 0
Y10-15-13
0.001 1
0.002 0
0.018 3
0.028 7
Y10-30-1
, 百拇医药
0.005 7
0.008 4
0.027 9
0.030 1
Y10-30-2
0.004 8
0.005 6
0.018 8
0.020 8
Y10-30-3
0.002 0
0.003 8
, 百拇医药
0.019 8
0.032 4
Y10-42-1
0.000 8
0.001 2
0.011 1
0.015 2
Y10-43-2
0.001 5
0.002 4
0.021 5
0.031 4
, 百拇医药
Y10-53-1
0.001 0
0.002 3
0.011 5
0.021 1
湘春豆10号
0.001 2
0.001 7
0.015 3
0.018 5
3 小结
3.1 对12批样品4种异黄酮类成分含量测定结果表明，导入西洋参DNA基因后的大豆异黄酮类含量发生了广泛的变异，与样本湘春豆10号比较，就大豆黄素成分而言，高于受体亲本的样品数有5个；染料木素成分，有8个样品明显高于亲本，大豆苷成分，有6个样品；染料木苷成分，有7个样品。其中Y10-30-2，Y10-30-3，Y10-12-2，Y10-30-1样品的4种成分含量大大的高于亲本湘春豆10号。此结果也表明，西洋参DNA导入大豆后，提高了大豆的有效成分含量，从中可望筛选出有效成分含量较高的株系进一步栽培，培育出大豆新的种资源。
, 百拇医药
3.2 经反复实验，此HPLC法能同时测定大豆中的4种异黄酮类成分的含量，分离良好，方法比较简便，快速。
参考文献
1，麻 浩，等.中草药，2000，(1)：51
2，郭建平，等.中草药，1995，26(3)：163，(6)：298
3，白井智之，等.第57回日本癌学会总会，横滨，1998，92
4，国家医药管理局中草药情报中心站编.植物药有效成分手册.北京：人民卫生出版社，1986：493
5，早川顺子，等.药学杂志，1984：104(1)：50
(1999-02-09 收稿), http://www.100md.com