SW-480裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性
作者：张胜本 黄显凯 饶本强
单位：张胜本(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)；黄显凯(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)；饶本强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
关键词：结肠肿瘤；移植瘤；SW-480细胞
第三军医大学学报000203
提要 目的：建立生物学特性稳定的结肠高分化腺癌 裸小鼠移植瘤模型。方法：建立人结肠高分化腺癌 细胞株SW-480裸小鼠移植瘤模型，并确定移植瘤生长 情况、组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 。结果：移植瘤体内传代稳定，潜伏期7～8d；保留 了人结肠腺癌的组织学特征；细胞动力学检测显示 以四倍体细胞为主；移植瘤细胞具有分泌CEA的功能。 结论：本移植瘤模型是一个生物学特性较稳定的人 结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。
, http://www.100md.com
中图法分类号R73-354;R730.261;R735.35 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0109-03
Establishment of model of transplanted tumor of human highly differentiated colonic carcinoma cell line SW-480 in nude mice
ZHANG Sheng-ben, HUANG Xian-kai, RAO Ben-qiang
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
, http://www.100md.com
Abstract Objective: To establish a model of transplanted tumor of highly differentiated colonic carcinoma with stable biological features. Methods: The model of transplanted tumor of highly differentiated colonic carcinoma cell line SW-480 was established in nude mice. Then the growth and histological and cytodynamic changes of the transplanted tumor were observed. Results: The transplanted tumor delivered steadily and the incubation period was 7～8 d. Histological investigation revealed that the pathological characteristics of human highly differentiated colonic adenocarcinoma remained in the transplanted tumor. Cytodynamic detection showed that the tetraploid cells were the majority. The transplanted tumor cells secreted a great quantity of carcino- embryonic antigen. Conclusion: The model established in this study has stable biological features.
, http://www.100md.com
Key words colonic neoplasm; transplanted tumor; SW-480 cell
本实验建立人结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型， 并对移植瘤的生物学特性进行鉴定，旨在为大肠癌 肿瘤生物学特性的研究、抗肿瘤药物的筛选、导向 治疗及基因治疗等提供一个生物学特性较稳定的结 肠癌裸小鼠移植瘤模型。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由美国纪念斯隆- 凯特林癌症中心制备，重庆医科大学病理生理学教 研室提供。
1.2 动物和饲养环境
第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸 小鼠，鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘；饲养于净 化室内，饲料、饮水、笼具和操作器材及其它用品 均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。
, http://www.100md.com
1.3 移植瘤模型建立
初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调 整细胞浓度至4×105/ml，取0.2ml接种于裸小鼠腹部或颈 背部皮下，共3只。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择 接种成功的1只裸小鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体， 用含双抗的Hank's液洗2次，剪成1mm×1mm×1mm至2mm×2mm×2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传 代。如此传代6次，每次接种裸小鼠2～3只。每次将剩 余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
1.4 移植瘤生物学特性鉴定
1.4.1 移植瘤生长曲线 第6、7代移植瘤自接种日起，每周测量1次肿瘤长径(b)，短径(a)，按公式V=1/2a2b计算肿 瘤体积，共观察6周，绘制生长曲线图。
1.4.2 组织学观察 取1、3、5代移植瘤组织，10%福尔马 林固定，石蜡包埋，常规切片作HE染色，光镜下观察 。
, 百拇医药
1.4.3 超微结构观察 切取3～4块1mm×1mm×1mm大小的第5代 移植瘤组织，2.5%戊二醛和1%OsO4后固定，丙酮脱水 ，Epon-812包埋，超薄切片(500～700
)，铀-铅双染色， 在300X型透射电子显微镜(SEM)下观察。
1.4.4 细胞周期动力学检测[1] 单细胞悬液制备：获取 第6代肿瘤组织，Hank's液冲洗3次，清除血污、脂肪及 坏死组织，将肿瘤剪切成1mm×1mm×1mm碎块，Hank's液冲 洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C 恒温箱中消化20～30min。800r/min离心5～8min，Hank's液漂洗2～ 3min。加入RPMI1640培养液，300目钢筛网以除去未充分消 化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml， 4°C、70%乙醇固定。
, 百拇医药 染色：选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，取浓度为1×105/ml的 单细胞悬液，加入PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30min，上机分析。
流式细胞仪测定：仪器为FACSstarplus型号流式细胞仪 ，测定前调整仪器变异系数(CV)在3%以下。测定时以 70mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm。测 定物质(DNA，蛋白质)的荧光强度后，HP900/340型计算机工 作站收集样本的10000个细胞数据进行分析和处理，然 后以频道数直方图和数字显示结果，并自动绘图。
采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞 分为3部分：G0/G1期、S期、G2/M期细胞。以正常组织对照 按公式计算DNA指数(DNAindex,DI)：
DI反映DNA的“倍性(Ploidy)”关系，正常组织细胞DI=1.0， 为二倍体；DI=0.5为单倍体，DI=2.0为四倍体。
, 百拇医药
1.4.5 CEA测定 第2、4、6代荷瘤裸小鼠处死时眼球放血，分离血清，用放射-免疫法(CEA-RIA法)测定血清CEA含量 并与正常小鼠血清对比；同时将移植瘤剥离称重后 充分剪碎，加入定量PBS液，反复冻融3次，离心取上 清测定肿瘤组织CEA含量。
1.5 统计学处理
数据以
±s表示，统计学处理采用本校数学教研室 编制的SPMR程序包，进行t检验。
2 结果
2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第2代以后接种成功率10% ，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第2周 末长径可达0.5～0.6cm，第3周肿瘤生长加快，至第5周末 长径平均可达1.9～2.2cm，此时表面呈结节状，个别肿 瘤表面有破溃及出血。
, http://www.100md.com
2.2 移植瘤组织学变化
1、3、5代移植瘤形态相似。瘤细胞呈巢状分布有腺 腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相 多见，可见癌细胞向细胞外分泌粘液，符合结肠高 分化腺癌的特点，见图1。
图1 第5代移植瘤组织，瘤细胞呈巢状分布，有腺腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相多见，可见瘤细胞向细胞外分泌粘液(HE×400)
Fig1 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells distributed like nest,with column shape,inconsistent size and glandular cavity structure,and secreted mucus.Nuclear fission was common (HE×400)
, 百拇医药
2.3 移植瘤超微结构变化
第5代移植瘤，细胞外形不规则，少数呈椭圆形及 梭形，细胞表面有许多胞浆突起及微绒毛，细胞核 不规则，核膜凹陷明显，核大而清晰，以常染色质 为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网、多聚 核糖体。部分癌细胞近腔面胞浆内见大量分泌泡， 泡内有较多的粘液物质，常见泡内内容物向腺腔分 泌。细胞之间可见紧密连接，见图2。
图2 第5代移植瘤细胞，细胞核不规则，核大而清晰，以常染色质为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网和分泌泡，细胞之间可见紧密连接(SEM×5000)
, http://www.100md.com
Fig2 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells linked closely,with large clear and irregular nuclei,and abundant mitochodria,rough surfaced endoplasmic reticulum and secrete bubbles near cavosurface (SEM×5000)
2.4 移植瘤的细胞动力学改变
第6代移植瘤第6周末G0/G1、S、G2/M期细胞分别占66.9%、16.7%、16.4%。以四倍体细胞为主。
2.5 移植瘤及裸小鼠血清CEA含量变化
CEA-RIA法测定正常裸小鼠及荷瘤裸小鼠血清及癌组 织内CEA含量见表1。正常裸小鼠血清CEA含量为2.2μg/L， 荷瘤裸小鼠血清CEA含量三代平均15.2μg/L，移植瘤组织 内含量三代平均10.7μg/L,3次测定结果，均有随代数增 加而升高趋势。
, http://www.100md.com
表1 荷瘤小鼠血清和移植瘤组织中CEA含量(ρBμg.L-1)
Tab1 CEA level in xenografted tumor and serum of nude mice(ρBμg.L-1)
Generation
Serum
Tumor
2
10.2±0.32#
7.1±0.42#
, 百拇医药
4
16.3±0.46#
11.4±0.53#
5
19.1±1.22#
13.6±0.62#
Normal
2.2±0.31
——
#:P<0.01 vs normal
3 讨论
人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型具有可连续传代、代间差异小及能长期保持原始肿瘤特征等优点，是目 前较为理想的人结肠腺癌异种移植模型。但人结肠 高分化腺癌是较难移植成功的恶性肿瘤之一。国内 目前仅有结肠中分化、低分化腺癌裸小鼠移植瘤模 型成功建立的报道[2]。本研究采用培养的人结肠高分化腺癌细胞株SW-480细胞皮下接种传代、接种实验成 功率高，第2代以后皆为100%，而且潜伏期短，肿瘤 生长速度稳定。为实验提供了实用、可行的移植瘤 动物模型。
, http://www.100md.com
能否保持肿瘤的原有特征是移植瘤模型成功的关键。Blum等[3]观察到人肺癌裸小鼠移植瘤在传代过程中生 物学特征不稳定，在移植过程中原有标志物丢失，或产生了新的标记物，所以寻找和建立生物学特性 稳定的裸小鼠移植瘤，对开展人类肿瘤的研究十分重要。本实验所建立的人结肠高分化腺癌裸小鼠移 植瘤除在组织学、超微结构、倍性分析上与结肠高 分化腺癌一致外，并且始终保持了产生CEA的功能。由此，可以认为是一个生物学特征较稳定的人结肠高 分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。对于肿瘤生物学特性的研究，抗肿瘤药物的筛选，导向治疗、基因治疗的研究具有一定的意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
作者简介：张胜本(1933.4)，男，四川省富顺县人，主任医师，教授，主要从事肛肠疾病方面的研究，发表论文56篇。电话：(023)68757298
参考文献
, http://www.100md.com
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性 [M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2]郑杰.免疫缺陷型动物实验研究的现状和展望[J].上 海实验动物科学，1989，9(1)：87-89.
[3] Blum U. Immunohistochemical detection of tumor markers in lung carcinomas: change of markers after heterotransplantation of the carcinomas in thymus aplastic mice[J]. Int J Immunopharmacol, 1995,17(2):257-259.
收稿日期：1999-03-02；修回日期：1999-10-12, 百拇医药
单位：张胜本(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)；黄显凯(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)；饶本强(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所普通 外科，重庆400042)
关键词：结肠肿瘤；移植瘤；SW-480细胞
第三军医大学学报000203
提要 目的：建立生物学特性稳定的结肠高分化腺癌 裸小鼠移植瘤模型。方法：建立人结肠高分化腺癌 细胞株SW-480裸小鼠移植瘤模型，并确定移植瘤生长 情况、组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性 。结果：移植瘤体内传代稳定，潜伏期7～8d；保留 了人结肠腺癌的组织学特征；细胞动力学检测显示 以四倍体细胞为主；移植瘤细胞具有分泌CEA的功能。 结论：本移植瘤模型是一个生物学特性较稳定的人 结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。
, http://www.100md.com
中图法分类号R73-354;R730.261;R735.35 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0109-03
Establishment of model of transplanted tumor of human highly differentiated colonic carcinoma cell line SW-480 in nude mice
ZHANG Sheng-ben, HUANG Xian-kai, RAO Ben-qiang
(Department of General Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
, http://www.100md.com
Abstract Objective: To establish a model of transplanted tumor of highly differentiated colonic carcinoma with stable biological features. Methods: The model of transplanted tumor of highly differentiated colonic carcinoma cell line SW-480 was established in nude mice. Then the growth and histological and cytodynamic changes of the transplanted tumor were observed. Results: The transplanted tumor delivered steadily and the incubation period was 7～8 d. Histological investigation revealed that the pathological characteristics of human highly differentiated colonic adenocarcinoma remained in the transplanted tumor. Cytodynamic detection showed that the tetraploid cells were the majority. The transplanted tumor cells secreted a great quantity of carcino- embryonic antigen. Conclusion: The model established in this study has stable biological features.
, http://www.100md.com
Key words colonic neoplasm; transplanted tumor; SW-480 cell
本实验建立人结肠高分化腺癌裸小鼠移植瘤模型， 并对移植瘤的生物学特性进行鉴定，旨在为大肠癌 肿瘤生物学特性的研究、抗肿瘤药物的筛选、导向 治疗及基因治疗等提供一个生物学特性较稳定的结 肠癌裸小鼠移植瘤模型。
1 材料与方法
1.1 肿瘤细胞株
人结肠高分化腺癌细胞株SW-480由美国纪念斯隆- 凯特林癌症中心制备，重庆医科大学病理生理学教 研室提供。
1.2 动物和饲养环境
第三军医大学实验动物中心提供BALB/c-nu/nu无胸腺裸 小鼠，鼠龄5～7周，体重(20±2)g，雌雄不拘；饲养于净 化室内，饲料、饮水、笼具和操作器材及其它用品 均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。
, http://www.100md.com
1.3 移植瘤模型建立
初代移植瘤采用对数生长期SW-480细胞消化后，调 整细胞浓度至4×105/ml，取0.2ml接种于裸小鼠腹部或颈 背部皮下，共3只。初代肿瘤长至1cm×1cm×1cm时，选择 接种成功的1只裸小鼠拉颈椎处死，无菌剥离瘤体， 用含双抗的Hank's液洗2次，剪成1mm×1mm×1mm至2mm×2mm×2 mm大小瘤块，经套管针接种于裸小鼠上述部位进行传 代。如此传代6次，每次接种裸小鼠2～3只。每次将剩 余肿瘤组织按常规处理后冻存于液氮中。
1.4 移植瘤生物学特性鉴定
1.4.1 移植瘤生长曲线 第6、7代移植瘤自接种日起，每周测量1次肿瘤长径(b)，短径(a)，按公式V=1/2a2b计算肿 瘤体积，共观察6周，绘制生长曲线图。
1.4.2 组织学观察 取1、3、5代移植瘤组织，10%福尔马 林固定，石蜡包埋，常规切片作HE染色，光镜下观察 。
, 百拇医药
1.4.3 超微结构观察 切取3～4块1mm×1mm×1mm大小的第5代 移植瘤组织，2.5%戊二醛和1%OsO4后固定，丙酮脱水 ，Epon-812包埋，超薄切片(500～700
)，铀-铅双染色， 在300X型透射电子显微镜(SEM)下观察。1.4.4 细胞周期动力学检测[1] 单细胞悬液制备：获取 第6代肿瘤组织，Hank's液冲洗3次，清除血污、脂肪及 坏死组织，将肿瘤剪切成1mm×1mm×1mm碎块，Hank's液冲 洗2次，消化液(0.25%胰蛋白酶与0.05%胶原酶1∶1)37°C 恒温箱中消化20～30min。800r/min离心5～8min，Hank's液漂洗2～ 3min。加入RPMI1640培养液，300目钢筛网以除去未充分消 化的组织，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至1×105/ml， 4°C、70%乙醇固定。
, 百拇医药 染色：选用碘化丙啶(PI)DNA染色法，取浓度为1×105/ml的 单细胞悬液，加入PBS液洗去固定液，加入PI一步染液1 ml，室温放置30min，上机分析。
流式细胞仪测定：仪器为FACSstarplus型号流式细胞仪 ，测定前调整仪器变异系数(CV)在3%以下。测定时以 70mV的氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm。测 定物质(DNA，蛋白质)的荧光强度后，HP900/340型计算机工 作站收集样本的10000个细胞数据进行分析和处理，然 后以频道数直方图和数字显示结果，并自动绘图。
采用Barlogie细胞同期分析法，将处于不同时期的细胞 分为3部分：G0/G1期、S期、G2/M期细胞。以正常组织对照 按公式计算DNA指数(DNAindex,DI)：
DI反映DNA的“倍性(Ploidy)”关系，正常组织细胞DI=1.0， 为二倍体；DI=0.5为单倍体，DI=2.0为四倍体。
, 百拇医药
1.4.5 CEA测定 第2、4、6代荷瘤裸小鼠处死时眼球放血，分离血清，用放射-免疫法(CEA-RIA法)测定血清CEA含量 并与正常小鼠血清对比；同时将移植瘤剥离称重后 充分剪碎，加入定量PBS液，反复冻融3次，离心取上 清测定肿瘤组织CEA含量。
1.5 统计学处理
数据以
±s表示，统计学处理采用本校数学教研室 编制的SPMR程序包，进行t检验。2 结果
2.1 移植瘤生长情况
初代移植瘤接种成功2只，第2代以后接种成功率10% ，至第6代以后肿瘤生长速度稳定。潜伏期7～8d，第2周 末长径可达0.5～0.6cm，第3周肿瘤生长加快，至第5周末 长径平均可达1.9～2.2cm，此时表面呈结节状，个别肿 瘤表面有破溃及出血。
, http://www.100md.com
2.2 移植瘤组织学变化
1、3、5代移植瘤形态相似。瘤细胞呈巢状分布有腺 腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相 多见，可见癌细胞向细胞外分泌粘液，符合结肠高 分化腺癌的特点，见图1。
图1 第5代移植瘤组织，瘤细胞呈巢状分布，有腺腔样结构，瘤细胞大小不等，多为柱状，核分裂相多见，可见瘤细胞向细胞外分泌粘液(HE×400)
Fig1 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells distributed like nest,with column shape,inconsistent size and glandular cavity structure,and secreted mucus.Nuclear fission was common (HE×400)
, 百拇医药
2.3 移植瘤超微结构变化
第5代移植瘤，细胞外形不规则，少数呈椭圆形及 梭形，细胞表面有许多胞浆突起及微绒毛，细胞核 不规则，核膜凹陷明显，核大而清晰，以常染色质 为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网、多聚 核糖体。部分癌细胞近腔面胞浆内见大量分泌泡， 泡内有较多的粘液物质，常见泡内内容物向腺腔分 泌。细胞之间可见紧密连接，见图2。
图2 第5代移植瘤细胞，细胞核不规则，核大而清晰，以常染色质为主，近腔面有丰富的线粒体、粗面内质网和分泌泡，细胞之间可见紧密连接(SEM×5000)
, http://www.100md.com
Fig2 The fifth generation of xenografted tumor.The tumorous cells linked closely,with large clear and irregular nuclei,and abundant mitochodria,rough surfaced endoplasmic reticulum and secrete bubbles near cavosurface (SEM×5000)
2.4 移植瘤的细胞动力学改变
第6代移植瘤第6周末G0/G1、S、G2/M期细胞分别占66.9%、16.7%、16.4%。以四倍体细胞为主。
2.5 移植瘤及裸小鼠血清CEA含量变化
CEA-RIA法测定正常裸小鼠及荷瘤裸小鼠血清及癌组 织内CEA含量见表1。正常裸小鼠血清CEA含量为2.2μg/L， 荷瘤裸小鼠血清CEA含量三代平均15.2μg/L，移植瘤组织 内含量三代平均10.7μg/L,3次测定结果，均有随代数增 加而升高趋势。
, http://www.100md.com
表1 荷瘤小鼠血清和移植瘤组织中CEA含量(ρBμg.L-1)
Tab1 CEA level in xenografted tumor and serum of nude mice(ρBμg.L-1)
Generation
Serum
Tumor
2
10.2±0.32#
7.1±0.42#
, 百拇医药
4
16.3±0.46#
11.4±0.53#
5
19.1±1.22#
13.6±0.62#
Normal
2.2±0.31
——
#:P<0.01 vs normal
3 讨论
人结肠腺癌裸小鼠移植瘤模型具有可连续传代、代间差异小及能长期保持原始肿瘤特征等优点，是目 前较为理想的人结肠腺癌异种移植模型。但人结肠 高分化腺癌是较难移植成功的恶性肿瘤之一。国内 目前仅有结肠中分化、低分化腺癌裸小鼠移植瘤模 型成功建立的报道[2]。本研究采用培养的人结肠高分化腺癌细胞株SW-480细胞皮下接种传代、接种实验成 功率高，第2代以后皆为100%，而且潜伏期短，肿瘤 生长速度稳定。为实验提供了实用、可行的移植瘤 动物模型。
, http://www.100md.com
能否保持肿瘤的原有特征是移植瘤模型成功的关键。Blum等[3]观察到人肺癌裸小鼠移植瘤在传代过程中生 物学特征不稳定，在移植过程中原有标志物丢失，或产生了新的标记物，所以寻找和建立生物学特性 稳定的裸小鼠移植瘤，对开展人类肿瘤的研究十分重要。本实验所建立的人结肠高分化腺癌裸小鼠移 植瘤除在组织学、超微结构、倍性分析上与结肠高 分化腺癌一致外，并且始终保持了产生CEA的功能。由此，可以认为是一个生物学特征较稳定的人结肠高 分化腺癌裸小鼠移植瘤模型。对于肿瘤生物学特性的研究，抗肿瘤药物的筛选，导向治疗、基因治疗的研究具有一定的意义。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270656)
作者简介：张胜本(1933.4)，男，四川省富顺县人，主任医师，教授，主要从事肛肠疾病方面的研究，发表论文56篇。电话：(023)68757298
参考文献
, http://www.100md.com
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性 [M].成都：四川科学技术出版社，1995.91-95.
[2]郑杰.免疫缺陷型动物实验研究的现状和展望[J].上 海实验动物科学，1989，9(1)：87-89.
[3] Blum U. Immunohistochemical detection of tumor markers in lung carcinomas: change of markers after heterotransplantation of the carcinomas in thymus aplastic mice[J]. Int J Immunopharmacol, 1995,17(2):257-259.
收稿日期：1999-03-02；修回日期：1999-10-12, 百拇医药