L型抗酸菌感染的病理和PCR检测
作者：邹菊贤 刘树林 金发光
单位：第四军医大学唐都医院 西安 710038
关键词：抗酸菌L型 分子生物学 病理 检测
重庆医学000204摘要：目的 为了探讨抗酸菌L型感染的病理和分 子生物学检测意义。方法 我们采用改良抗酸染色法(IK)和聚合酶链 反应(PCR)法对30例病理学诊断为非特异性淋巴结炎和15例正常胎儿石蜡包埋组织重新切片 进行检测分析。结果 对30例非特异性淋巴结炎的IK检测，其中20例 显示抗酸菌L型感染阳性，PCR法检测18/30例抗酸菌L型感染阳性，两种方法间无显著差异( P>0.05)；正常胎儿组织均为阴性，两组间(淋巴结炎组和正常胎儿组)P<0.01，有 显著 性差异。结论 研究已证明，抗酸菌L型常发生病理学和形态学的改 变，而导致临床误诊和漏诊。但因该菌的遗传物质相对稳定，故使用IK染色法和PCR检测抗 酸菌L型对结核性淋巴结炎的诊断具有重要意义，可减少临床误诊和漏诊。
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The Pathological and PCR Detection in L-type Acid-fast Bac illus Infection
Zou Juxian Lin Shuin Jin Faguang
(Tangdu hospital,the Fourth Militar y Medical Uniuersity,Xi'an 710038)
Abstract：Objective:To study the significance of pathological an d molecula r biological detection on L-type acid-rast bacillus infection.Method: Paraf fin embeded tissue from 30 cases of pathologically diagnosed non-specific lympha de nitis and 15 normal embryo were resectioned and examined with both methods of IK and PC R.Results:20 among 30 cases of non-spcific lymphadcnitis were rediagn osed as L-t ype acid-fast bacillus positive tuberculous lymphadcnitis by the method of IK,an d 18 out of 30 by the method of PCR(P>0.05).No normal embryo tissue was foun d to be positive by these two methods,the difference between lymphadenitis group and normal embr yo was significant(P<0.01).Conclusion:Previous studies have confirmed t hat the L-type acid-fast b acillus may cause pathological and morphological changes which frequently lead to misdiagnosis of tuberculous lymphadcnitis.However the genetic material o f the bacillus is constant.Therefore IK and PCR detections are more important th a n traditional pathological and bacteriological analysis for tuberculous lymphadc itis
, 百拇医药
Key words：L-type acid-fast bacillus;Molecular biology;Pathology; Detection▲
由于临床症状的不典型，则往往使临床上难以及时作出正确的诊断及治疗。 随着现代生物技术的迅速发展，对细菌L型的研究也不断深入[1]。为此，为提高临 床的正确诊断及治疗，本文对病理确诊为非特异性淋巴结炎组织(简称淋巴结炎组)标本和确 诊为正常胎儿淋巴组织(简称正常胎儿组)的石蜡包埋组织重新切片，以IK(Intensifed Kiny oun)和PCR(Polymerase Chain Reaction)同时进行检测分析，以探讨其生物学和形态学变化 ，更好地为临床提供可靠的科学诊断依据。
1 材料与方法
1.1 病例选择 取自1990～1994年间石蜡包埋组织45例，由南京空军医院 、西安空军医院和本院病理科分别提供。以上均经病理证实为非特异性淋巴结炎30例，正常 胎儿组15例。病例组30例在临床上除有不同程度的局部或全身性浅表淋巴结肿大外，部分病 例尚有其他临床症状和体征，临床上均怀凝为淋巴结核。
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1.2 方法 IK法和PCR法
1.2.1 IK法[2] 将石蜡切片组织经脱蜡、水洗、置石碳酸品红液 中(临用前加吐温80 0.1ml)浸泡24小时，水洗后用0.5%盐酸酒精退色，水洗，lg/ L美蓝液复 染30秒，水洗、脱水、透明，中性树胶封片。结果判断：抗酸菌L型呈多形性，有原生小体( 直径约0.05～0.5μm)，圆球体(直径约1μm左右)，巨形体(直径1.5～50μm)及长丝体(长短 差异较大)等，以抗酸染色亮红色或紫红色判为阳性或阴性。
1.2.2 PCR法 (1)引物设计：扩增的靶DNA为MPB64蛋白编码基因片段，引 物Ⅰ5′-GCT CTGGAGTCTAGGCCA-3′和引物Ⅱ5′-TCTGCT GCCAGTCG TCTTCC-3′(由上海复旦 大学遗传所合成)。(2)组织中DNA提取：结核菌(Tubercullosis,TB)DNA的提取：参考林万明 [3]略加改进，全程均以无菌操作取5～10张5μm厚的石蜡切片置Eppendorf管内， 加入1ml二甲苯溶液混匀，加盖室温30分钟，以13000g离心5分钟，除去上清，重复两次。沉 淀加入0.5ml无水乙醇(AR)翻转混匀，以15000g同上离心，重复两次。于沉淀中加入3滴丙酮 (AR)，50℃水浴敞盖蒸发干燥。加入消化酶缓冲液100～200μl，置55℃3小时。再以13000g 短时离心。置97℃煮沸8～10分钟，取上清液5μl特PCR扩增。(3)PCR扩增分析：用1109型基 因扩增仪进行PCR扩增。25μl反应体系中含4×dNTP、10×Buffer、引物、结核菌DNA模板5 μl。95℃5分钟，80℃加入Taq-DNA聚合酶1.5U，以40μl石蜡油封面，加盖，72℃预置2分 钟，置扩增仪上扩增。条件：93℃30秒，55℃60秒，72℃60秒，35个循环后，72℃延伸300 秒。取15μl扩增产物，与溴酚兰为指示剂混匀，在2%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)60v电压 电泳20分钟，置反射透射紫外灯下观察结果，在阳性对照240bp处溴酚兰指示剂后出现荧光 区带者为阳性。每次实验均设有阳性对照和无菌双蒸水和试剂空白做阴性对照。(4)重复性 测定：对15份组织标本，以同上方法进行重复检测，其中10份为阳性，5份为阴性；重复检 测后与已知结果完全符合。
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2 结 果
IK法和PCR法检测结果见表1。
表1 45例淋巴结炎组与正常胎儿组IK法和PCR法检测结果
n(例数)
IK
(%)
PCR
(%)
两法同时
阳性率(%)
淋巴结炎组
30
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20(66.7)△
18(60.0)△
18(60.0)
正常胎儿组
15
0(0.0)*
0(0.0)*
0(0.0)
注χ2检验：两法间P>0.05，无显著性差异：△，两组间P<0.01，有显著差异。
IK染色法对30例淋巴结炎检测结果20例均为抗酸菌L型，无1例抗酸杆菌型，其检出率为 66.7%(20/30)，可以看出L型菌多处于巨噬细胞浆内，常集聚成堆，也有呈散在性分布。而 正常胎儿组无1例阳性。
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PCR检测30例淋巴结炎组织中TB-DNA阳性者18例，其检出率为60.0%(18/30)，而正常胎儿组 均为阴性。PCR法检测TB-DNA结果见图1。
M：PCR Marker；1、2：抗酸菌L型TB-DNA阳性患者 ；3：阳性对照；4、5：阴性对照(未加模板的试剂空白和加入双蒸水的试剂空白)
3 讨 论
IK法在淋巴结炎组织中的检测意义：30例淋巴结炎病理均诊断为非特异性淋巴结炎，而临床上大多怀疑为结核性淋巴结炎。有学者认为[4]由于抗结核药物、机体免疫等作用，结核分支杆菌细胞壁部分或完全缺失而变异为L型。其生物学特性与原菌有明显差异，使许多常规检测方法不能检出。而在IK法中，缺乏细胞壁所含的结核菌染色呈抗酸性的物质，普通的抗酸染色却不能检出L型菌。但在体内长期存在，并在一定条件下恢复为原菌，而导致结核病的发生[5]。并指出，结核菌L型可引起淋巴结炎[5]。在此，本研究30例非特异性淋巴结炎病例经检测，即有66.7%(20/30)的病例为结核性淋巴结炎而误诊为非特异性淋巴结炎，而病理感染诊断只有43.3%的正确率。然而，对于此种病人，临床上应以IK法或培养法作为诊断结核的首选方法，其次才是病理或两者同时检测，以免漏诊或误诊。故有人建议[6]把多次检出L型作为结核病活动的判断标准之一。
, 百拇医药
PCR法在淋巴结炎组织中的检测意义：在IK染色或培养确定为抗酸菌L型或L型菌之后，目前还没有一个标准的确诊方法。由于抗酸菌L型的病理学和形态学改变，在一定程度上不能改变其分子生物学的遗传基因DNA。我们试图用PCR这个90年代新兴的分子生物学手段证实它，因为结核菌L型感染淋巴结炎通常失去原菌的典型病理特征，仅表现为非特异性淋巴结炎，而导致临床和病理学的漏诊和误诊[2]。但它并未改变其分子结构，本研究中，PCR法具有体外克隆的特点，它具有快速、特异之优点，对抗酸菌L型检出率达60.0%(18/30)，使其诊断水平达到了分子水平，弥补了细菌培养不能鉴别结核菌L型之缺点。研究中30例淋巴结炎有一半多(60.0%)组织中检出了TB-DNA，在临床上大多数怀疑淋巴结核而组织病理检查诊断为非特异性淋巴结炎，但未行PCR检测而误诊。可见PCR不但对组织中的结核DNA有较好的诊断价值，并且对结核菌L型也行之有效。
IK染色法和PCR法相比，无显著性差异，P>0.05，两法同时检出阳性率为60.0%(18/30)。研究证明，对于临床上怀疑为淋巴结核的病人，不但应做病理检查，IK法和PCR法的联合测定不妨是一种检测、鉴定抗酸菌L型的行之有效的可靠方法，并且此种方法在结核性淋巴结炎的细菌学诊断上具有重要意义，从而达到减少临床和病理学误诊和漏诊之目的。
, 百拇医药
参考文献：
[1]倪语星，殷常红，蓝鸿泰综述. 细菌L型研究的某些进展.中华医学检测杂志，1994，17(5)：305
[2]张世馥，姚敏，洪先知，等.抗酸菌L型感染病理和临床误诊的研究.中华结核 和呼吸杂志，1994，17(3)：159
[3]林万明主编.PCR技术和应用指南.第1版，北京：人民军医出版社，1993：37
[4]谢家政，王安潮.肺结核患者结核分支杆菌L型的检测及临床意义.中华结核和 呼吸杂志，1999，22(3)：190
[5]黄谷良，林特夫，郭秉兰，等编著.细菌L型与疾病.第1版，北京：学苑出版社 ，1991：343, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院 西安 710038
关键词：抗酸菌L型 分子生物学 病理 检测
重庆医学000204摘要：目的 为了探讨抗酸菌L型感染的病理和分 子生物学检测意义。方法 我们采用改良抗酸染色法(IK)和聚合酶链 反应(PCR)法对30例病理学诊断为非特异性淋巴结炎和15例正常胎儿石蜡包埋组织重新切片 进行检测分析。结果 对30例非特异性淋巴结炎的IK检测，其中20例 显示抗酸菌L型感染阳性，PCR法检测18/30例抗酸菌L型感染阳性，两种方法间无显著差异( P>0.05)；正常胎儿组织均为阴性，两组间(淋巴结炎组和正常胎儿组)P<0.01，有 显著 性差异。结论 研究已证明，抗酸菌L型常发生病理学和形态学的改 变，而导致临床误诊和漏诊。但因该菌的遗传物质相对稳定，故使用IK染色法和PCR检测抗 酸菌L型对结核性淋巴结炎的诊断具有重要意义，可减少临床误诊和漏诊。
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The Pathological and PCR Detection in L-type Acid-fast Bac illus Infection
Zou Juxian Lin Shuin Jin Faguang
(Tangdu hospital,the Fourth Militar y Medical Uniuersity,Xi'an 710038)
Abstract：Objective:To study the significance of pathological an d molecula r biological detection on L-type acid-rast bacillus infection.Method: Paraf fin embeded tissue from 30 cases of pathologically diagnosed non-specific lympha de nitis and 15 normal embryo were resectioned and examined with both methods of IK and PC R.Results:20 among 30 cases of non-spcific lymphadcnitis were rediagn osed as L-t ype acid-fast bacillus positive tuberculous lymphadcnitis by the method of IK,an d 18 out of 30 by the method of PCR(P>0.05).No normal embryo tissue was foun d to be positive by these two methods,the difference between lymphadenitis group and normal embr yo was significant(P<0.01).Conclusion:Previous studies have confirmed t hat the L-type acid-fast b acillus may cause pathological and morphological changes which frequently lead to misdiagnosis of tuberculous lymphadcnitis.However the genetic material o f the bacillus is constant.Therefore IK and PCR detections are more important th a n traditional pathological and bacteriological analysis for tuberculous lymphadc itis
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Key words：L-type acid-fast bacillus;Molecular biology;Pathology; Detection▲
由于临床症状的不典型，则往往使临床上难以及时作出正确的诊断及治疗。 随着现代生物技术的迅速发展，对细菌L型的研究也不断深入[1]。为此，为提高临 床的正确诊断及治疗，本文对病理确诊为非特异性淋巴结炎组织(简称淋巴结炎组)标本和确 诊为正常胎儿淋巴组织(简称正常胎儿组)的石蜡包埋组织重新切片，以IK(Intensifed Kiny oun)和PCR(Polymerase Chain Reaction)同时进行检测分析，以探讨其生物学和形态学变化 ，更好地为临床提供可靠的科学诊断依据。
1 材料与方法
1.1 病例选择 取自1990～1994年间石蜡包埋组织45例，由南京空军医院 、西安空军医院和本院病理科分别提供。以上均经病理证实为非特异性淋巴结炎30例，正常 胎儿组15例。病例组30例在临床上除有不同程度的局部或全身性浅表淋巴结肿大外，部分病 例尚有其他临床症状和体征，临床上均怀凝为淋巴结核。
, 百拇医药
1.2 方法 IK法和PCR法
1.2.1 IK法[2] 将石蜡切片组织经脱蜡、水洗、置石碳酸品红液 中(临用前加吐温80 0.1ml)浸泡24小时，水洗后用0.5%盐酸酒精退色，水洗，lg/ L美蓝液复 染30秒，水洗、脱水、透明，中性树胶封片。结果判断：抗酸菌L型呈多形性，有原生小体( 直径约0.05～0.5μm)，圆球体(直径约1μm左右)，巨形体(直径1.5～50μm)及长丝体(长短 差异较大)等，以抗酸染色亮红色或紫红色判为阳性或阴性。
1.2.2 PCR法 (1)引物设计：扩增的靶DNA为MPB64蛋白编码基因片段，引 物Ⅰ5′-GCT CTGGAGTCTAGGCCA-3′和引物Ⅱ5′-TCTGCT GCCAGTCG TCTTCC-3′(由上海复旦 大学遗传所合成)。(2)组织中DNA提取：结核菌(Tubercullosis,TB)DNA的提取：参考林万明 [3]略加改进，全程均以无菌操作取5～10张5μm厚的石蜡切片置Eppendorf管内， 加入1ml二甲苯溶液混匀，加盖室温30分钟，以13000g离心5分钟，除去上清，重复两次。沉 淀加入0.5ml无水乙醇(AR)翻转混匀，以15000g同上离心，重复两次。于沉淀中加入3滴丙酮 (AR)，50℃水浴敞盖蒸发干燥。加入消化酶缓冲液100～200μl，置55℃3小时。再以13000g 短时离心。置97℃煮沸8～10分钟，取上清液5μl特PCR扩增。(3)PCR扩增分析：用1109型基 因扩增仪进行PCR扩增。25μl反应体系中含4×dNTP、10×Buffer、引物、结核菌DNA模板5 μl。95℃5分钟，80℃加入Taq-DNA聚合酶1.5U，以40μl石蜡油封面，加盖，72℃预置2分 钟，置扩增仪上扩增。条件：93℃30秒，55℃60秒，72℃60秒，35个循环后，72℃延伸300 秒。取15μl扩增产物，与溴酚兰为指示剂混匀，在2%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)60v电压 电泳20分钟，置反射透射紫外灯下观察结果，在阳性对照240bp处溴酚兰指示剂后出现荧光 区带者为阳性。每次实验均设有阳性对照和无菌双蒸水和试剂空白做阴性对照。(4)重复性 测定：对15份组织标本，以同上方法进行重复检测，其中10份为阳性，5份为阴性；重复检 测后与已知结果完全符合。
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2 结 果
IK法和PCR法检测结果见表1。
表1 45例淋巴结炎组与正常胎儿组IK法和PCR法检测结果
n(例数)
IK
(%)
PCR
(%)
两法同时
阳性率(%)
淋巴结炎组
30
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20(66.7)△
18(60.0)△
18(60.0)
正常胎儿组
15
0(0.0)*
0(0.0)*
0(0.0)
注χ2检验：两法间P>0.05，无显著性差异：△，两组间P<0.01，有显著差异。
IK染色法对30例淋巴结炎检测结果20例均为抗酸菌L型，无1例抗酸杆菌型，其检出率为 66.7%(20/30)，可以看出L型菌多处于巨噬细胞浆内，常集聚成堆，也有呈散在性分布。而 正常胎儿组无1例阳性。
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PCR检测30例淋巴结炎组织中TB-DNA阳性者18例，其检出率为60.0%(18/30)，而正常胎儿组 均为阴性。PCR法检测TB-DNA结果见图1。
M：PCR Marker；1、2：抗酸菌L型TB-DNA阳性患者 ；3：阳性对照；4、5：阴性对照(未加模板的试剂空白和加入双蒸水的试剂空白)
3 讨 论
IK法在淋巴结炎组织中的检测意义：30例淋巴结炎病理均诊断为非特异性淋巴结炎，而临床上大多怀疑为结核性淋巴结炎。有学者认为[4]由于抗结核药物、机体免疫等作用，结核分支杆菌细胞壁部分或完全缺失而变异为L型。其生物学特性与原菌有明显差异，使许多常规检测方法不能检出。而在IK法中，缺乏细胞壁所含的结核菌染色呈抗酸性的物质，普通的抗酸染色却不能检出L型菌。但在体内长期存在，并在一定条件下恢复为原菌，而导致结核病的发生[5]。并指出，结核菌L型可引起淋巴结炎[5]。在此，本研究30例非特异性淋巴结炎病例经检测，即有66.7%(20/30)的病例为结核性淋巴结炎而误诊为非特异性淋巴结炎，而病理感染诊断只有43.3%的正确率。然而，对于此种病人，临床上应以IK法或培养法作为诊断结核的首选方法，其次才是病理或两者同时检测，以免漏诊或误诊。故有人建议[6]把多次检出L型作为结核病活动的判断标准之一。
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PCR法在淋巴结炎组织中的检测意义：在IK染色或培养确定为抗酸菌L型或L型菌之后，目前还没有一个标准的确诊方法。由于抗酸菌L型的病理学和形态学改变，在一定程度上不能改变其分子生物学的遗传基因DNA。我们试图用PCR这个90年代新兴的分子生物学手段证实它，因为结核菌L型感染淋巴结炎通常失去原菌的典型病理特征，仅表现为非特异性淋巴结炎，而导致临床和病理学的漏诊和误诊[2]。但它并未改变其分子结构，本研究中，PCR法具有体外克隆的特点，它具有快速、特异之优点，对抗酸菌L型检出率达60.0%(18/30)，使其诊断水平达到了分子水平，弥补了细菌培养不能鉴别结核菌L型之缺点。研究中30例淋巴结炎有一半多(60.0%)组织中检出了TB-DNA，在临床上大多数怀疑淋巴结核而组织病理检查诊断为非特异性淋巴结炎，但未行PCR检测而误诊。可见PCR不但对组织中的结核DNA有较好的诊断价值，并且对结核菌L型也行之有效。
IK染色法和PCR法相比，无显著性差异，P>0.05，两法同时检出阳性率为60.0%(18/30)。研究证明，对于临床上怀疑为淋巴结核的病人，不但应做病理检查，IK法和PCR法的联合测定不妨是一种检测、鉴定抗酸菌L型的行之有效的可靠方法，并且此种方法在结核性淋巴结炎的细菌学诊断上具有重要意义，从而达到减少临床和病理学误诊和漏诊之目的。
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参考文献：
[1]倪语星，殷常红，蓝鸿泰综述. 细菌L型研究的某些进展.中华医学检测杂志，1994，17(5)：305
[2]张世馥，姚敏，洪先知，等.抗酸菌L型感染病理和临床误诊的研究.中华结核 和呼吸杂志，1994，17(3)：159
[3]林万明主编.PCR技术和应用指南.第1版，北京：人民军医出版社，1993：37
[4]谢家政，王安潮.肺结核患者结核分支杆菌L型的检测及临床意义.中华结核和 呼吸杂志，1999，22(3)：190
[5]黄谷良，林特夫，郭秉兰，等编著.细菌L型与疾病.第1版，北京：学苑出版社 ，1991：343, 百拇医药