骨髓基质中的骨源性干细胞
作者：刘延青 娄思权
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：
中华骨科杂志000214
骨髓基质是对骨髓血系细胞起支持和连接作用的组织,并影响血系细胞分化。骨髓基质细胞包括：骨系细胞、成纤维细胞、网状细胞、脂细胞[1]，此外,还包括巨噬细胞和内皮细胞。骨髓基质中含有多能干细胞，Owen称之为骨髓基质干细胞，假定这种细胞分化为定向祖细胞，后者可分化为成纤维细胞、网状细胞、脂细胞、骨源性细胞(osteogeniccell)[1]。骨髓基质干细胞可以在无诱导下骨化，称为确定性骨源性前体细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC),也称作骨源性干细胞(osteogenic stem cell);而在骨以外组织中存在的干细胞需要骨基质和移行上皮来源的因子诱导骨化，称之为诱导性骨源性前体细胞(inducible osteogenic precursor cell,IOPC)。骨髓基质中骨源性干细胞是骨愈合过程中骨化的重要细胞，对其研究有助于更好地认识骨愈合的过程和机制，为临床促进骨愈合提供理论基础。
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一、骨髓基质中骨源性干细胞的识别和分离
确定骨源性干细胞最可靠的方法是：检测细胞分化后产生矿化或骨样化结节。结节可以通过Von Kossa染色识别，或在相差显微镜下看到，骨样结节还表现碱性磷酸酶(APase)、Ⅰ型胶原和骨钙素阳性[2]。对于骨源性干细胞表面抗原和其它特征了解很少。Vlasselaer用荧光激活细胞分离技术(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)分离骨髓细胞，发现经向前光散射(forward light scatter，FIS)、垂直光散射(perpendicular light scatter，PIS)骨源性干细胞出现在FSChighSSChigh部分。这部分细胞经Sca-1抗体和麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)再次选择,骨源性干细胞出现在Sca-1+和麦胚凝集素高亲和部分。经过选择的骨源性干细胞可以分化成骨细胞、表达APase，产生胶原、骨钙素和矿化，但骨化能力较没有经选择的细胞弱，可能是选择过程损伤或丢失了一部分骨源性干细胞[3]。SH2、SH3、SH4、Stro-1抗体也可以识别部分骨源性干细胞。此外，骨源性干细胞和大豆凝集素亲和[2]。经细胞分离液离心后，骨源性干细胞位于≤1.075g/cm3部分。全骨髓细胞培养，血系细胞不贴壁7d内死亡或换液弃去，余下细胞形成单层成纤维细胞集落，骨源性干细胞就存在其中，可达到大致分离的目的[2,4]。
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二、骨髓中骨源性干细胞数目
骨髓细胞体外培养，血系细胞死亡，基质细胞贴壁生长形成成纤维细胞集落，这些细胞被称为成纤维细胞集落形成单位(colonyforming unitfibroblastic CFU-F)。CFU-F仅占骨髓细胞一小部分，并与动物种属、年龄有关。小鼠CFU-F占骨髓有核细胞的1/(2.5×104),兔占1/(3.3×105)，人占1×106～10×106[2]。集落形成效率(colonyforming efficiency，CFE)也是反映CFU-F数量的指标,表示体外培养形成集落(≥50个细胞)除以接种的骨髓有核细胞数。不同种属动物CFE值1×10-5～5×10-5[4,5]，年老动物CFE下降，切除卵巢后CFE下降，双氢速甾醇Dihydrotachystero[1,25(OH)2D3类似物]可以使CFE增高[5]。CFU-F中骨源性干细胞含量和分化骨化能力有很大差别，几内亚猪和兔的CFU-F40%可以在体内骨化；小鼠CFU-F30%可以体内骨化[4]。而小鼠CFU-F在体外培养形成矿化结节的只占11%。静脉注射5-氟尿嘧啶(5-FU)可以提高CFU-F/有核细胞比值5倍，骨源性干细胞增加12倍[2]。
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三、骨髓基质细胞体外成骨能力的研究
骨髓基质细胞体外培养，其中的骨源性干细胞增殖分化为成骨细胞和骨细胞，其分化各阶段特点见表1[6]。
大鼠骨髓基质细胞培养(含地塞米松dexamethasone,DEX)，APase和骨涎蛋白(sialoprotein)mRNA8d达最高，12d后下降[7]。APase最先出现在集落中央，此处细胞密集接触，生长抑制，细胞开始分化。APase常作为有骨化潜能的细胞标记。骨钙素mRNA也出现在第8d，12d后明显升高，骨连接素一直处于高水平，骨桥素呈减少趋势，矿化结节出现在12d[7]。值得注意的是仅55%的APase阳性细胞形成矿化结节，可能是APase阳性不都是成骨潜能细胞，或一些成骨潜能的细胞不能分化至形成矿化结节节段。因为骨钙素开始表达于成骨细胞，大鼠骨髓基质骨源性干细胞体外分化至成骨细胞需8～12d。矿化结节是成骨细胞分泌的钙盐形成，出现于第12d，也提示成骨细胞出现于第12d。
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骨髓基质细胞在(不含DEX)培养状态下也可分化为成骨细胞[2]，成骨细胞形成矿化结节，则必须有维生素C和β-磷酸甘油存在，后者提供有机磷[2,8]，维生素C是合成胶原和骨形成的要求，调节成骨样细胞ATPase、APase和蛋白合成[8]。
四、骨髓基质细胞成骨的体内研究
完整的骨髓移植至皮下或肾囊可形成骨组织。1×107个骨髓细胞悬液放入扩散格再植入皮下，3d时仅有15个成纤维细胞，20d增加至1×106，在出现APase(细胞分化)之前细胞倍增13～14次(213～14倍)，证明骨髓基质细胞有很强增殖能力[9]。植入1周有纤维组织出现，2周纤维组织占大部分空间，至20d有骨软骨组织形成，软骨位于中央，外面有部分骨组织，最外面是一层纤维组织包围，纤维组织与扩散格壁(diffusion chamber)接触。在最初的纤维组织中含Ⅲ型胶原，Laminin和纤维连接素，Ⅰ、Ⅱ型胶原；骨软骨形成后以Ⅰ、Ⅱ型胶原为主，Ⅲ型胶原和层粘连蛋白(laminin)，纤维连接素减少至消失[10]。
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表1骨系细胞分化各阶段特点 阶段
碱性磷
酸酶
鼠骨髓211.13
单抗识别
骨钙素
骨桥素
骨涎蛋白
甲状旁腺
素受体
地塞米松反应
表达骨抗原
地塞米松反应
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体外骨化
骨原性干
细胞
(-)？？？？？？
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早期骨祖
细胞？--------？？？？？
+++++++
晚期骨祖
细胞
-++
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前成骨
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成骨细胞
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骨细胞--------
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注:+出现,-不出现,?不清楚,(-)未表达
骨髓基质细胞体外培养后附着于多孔陶瓷内再植入体内,也可形成骨组织。2周后出现成骨细胞,骨组织占陶瓷体积的40%，3周后出现一层编织骨，4周后骨组织占据整个植入体,有少于10%的软骨形成[11]。细胞在多孔陶瓷内的骨化优于扩散格,经过培养的骨髓基质细胞的骨化优于全骨髓细胞[11]。
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五、影响骨髓基质干细胞骨化的因素
细胞密集有利于骨化，矿化结节最先出现在集落中央细胞聚集区。骨髓基质细胞培养，接种密度≥2.4×104/cm2有利于矿化结节形成[12]。体内接种细胞密度≥5×105/ml才分化骨化[11]。
骨髓基质细胞骨化能力强于全骨髓细胞。骨髓基质细胞传代18次后植于皮下仍有骨化能力，原代细胞骨化能力最强，需要2周时间，第7代细胞骨化需要6周时间，第18代需12周。软骨形成只见于原代、第1和第2代细胞。经冻存复苏的细胞骨化能力不受影响[11]。
皮质醇调节正在分化细胞的基因表达,诱导基因组目的序列皮质醇受体的亲和性;氢化可的松和地塞米松(DEX)增加APase活性，促进集落形成；DEX使细胞形态由长变方，增加基质细胞对甲状旁腺素(PTH)和前列腺素E2反应的cAMP水平，诱导细胞分化表达骨钙素，不影响骨连接素mRNA,增加Ⅰ型胶原和骨桥素mRNA，矿化结节数目增多。因此，DEX有诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞作用，促分化的同时也抑制了骨髓基质细胞增生[12]。
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孕激素(黄体酮)对骨髓基质中的骨源性干细胞也有诱导作用，可以增加细胞在体外培养状态的矿化结节数，矿化结节显著出现于16～20d，而DEX作用下矿化结节出现于10～12d，提示对孕激素反应的细胞分化至成骨细胞时间较长，可能是孕激素作用于较早期的骨源性干细胞，而DEX对早和晚期骨源性干细胞都有作用[6]。
转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族是重要的骨诱导因子，目前发现有：骨形态发生蛋白2～8(bone morphogenetic protein，BMP)、Dorsophila dpp、Dorsophila 60A有体内异位骨诱导作用；TGF-β、激活蛋白(activin)A、B无体内骨诱导作用；Vg1作用不详。TGF-β、BMP2可刺激体外培养的骨祖细胞增殖，TGF-β作用强于BMP2,尤其是对早期骨祖细胞作用强。TGF-β1促进骨髓基质细胞增殖但APase减少，使细胞在体外失去成骨能力，而植入体内又获得成骨能力[13]。BMP6、7在体外有诱导骨源性干细胞分化作用。
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1,25(OH) 2D3可促进骨祖细胞增殖，碱性成纤维细胞生长因子可促进早期骨祖细胞增殖[14]。上皮细胞生长因子使CFU-F集落数目减少，集落直径增大，APase阳性集落比例减小[15]。血小板衍生生长因子PDGF-BB可以使骨髓基质细胞增殖，APase活性减小[13]。成骨细胞与骨髓基质细胞混合培养，可促进骨髓基质细胞骨结节形成，成骨细胞旁分泌一种生长因子(相对分子质量1×104～3×104),这一因子不同于TGF-β、胰岛素样生长因子IGFs Ⅰ、Ⅱ和酸性成纤维细胞生长因子，可以刺激骨祖细胞分化，APase阳性细胞先增多而后减少[16]。
六、骨髓基质细胞成软骨的能力
骨髓基质细胞在体内、体外都有成软骨能力。Ephrat以维生素C、DEX、碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导骨髓基质细胞，细胞密度大于1×106/cm2，培养诱导后软骨细胞比例达到85%[17,18]。含透明质酸培养基，低氧浓度(8%)可诱导软骨细胞生成20%～30%[19]。避免细胞与培养皿接触利于软骨形成，凝胶中悬浮培养可以提供这样的条件。
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骨髓基质细胞在胶原负载下植入关节软骨缺损，2周后植入组织表层(关节面)细胞为圆形，甲苯胺蓝染色(+)，深层形成松质骨。表明骨髓基质细胞在不同体内环境中可以分化为骨组织或者软骨组织，关节内有利于软骨发生，推测损伤后的软骨释放或吸引生物活性因子(如TGF-β超家族),诱导成软骨祖细胞分化[20]。
七、骨髓基质中骨源性干细胞与组织工程及临床意义
骨修复是骨科的基本问题，创伤和手术后的骨缺损常常需要植骨愈合，自体骨移植可以造成供骨部位并发症，异体骨移植有排斥反应，两者骨来源都有限，植入骨形状很难与原解剖形状相符，会影响功能。关节软骨损伤不能自行修复，软骨移植因为来源有限和塑形困难不能广泛使用。组织工程将是骨、软骨修复的理想方法。
组织工程的简单定义就是制作新的组织以替换和再生体内组织。它可以将少量细胞培养成骨和软骨组织。体内骨修复过程包括：血肿形成，化学信号趋化骨源性干细胞并促其分化，软骨内成骨。组织工程人工模拟这一过程，包括三方面因素：调控信号、细胞、细胞外基质。如前所述，骨髓基质细胞有良好增殖和分化成骨、成软骨能力，是组织工程的理想细胞。
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TGF-β(超家族)、生长因子、DEX等因子在体内骨愈合过程中起趋化、诱导骨源性干细胞增殖分化的作用，组织工程技术利用这些因子在体外发挥调控作用。细胞外基质提供细胞生长分化的支架，并为细胞传递控制生长和形态的因子。理想的细胞外基质应具备：(1)组织相容性;(2)可吸收性;(3)易于加工制作；(4)表面与细胞相互作用以保留分化细胞的功能。天然基质成分有：胶原、透明质酸等，可作为骨髓基质细胞向软骨分化的载体成分[17,20]。人工合成的基质有：羟基磷灰石、聚乳酸、聚乙醇酸等。人工合成材料为多孔或非编织纤维网结构，孔径大于100μm，中空体积达90%，可以吸附大量细胞，保证细胞与外界物质交换。羟基磷灰石适合负载骨髓基质细胞分化成骨；聚乳酸、聚乙醇酸是可降解材料，在数月至数年内完全被体内组织取代，降解产物无副作用，是软骨细胞良好的载体。
骨髓促进骨愈合的动物试验表明:试验动物(兔)桡骨缺损1cm,经一次自体骨髓局部注射,表现出较好的成骨作用,12周后骨缺损间隙为1mm,对照组则为7.5mm[21]。Grundel等[22]比较羟基磷灰石作为载体吸附骨髓修复犬的骨缺损，未移植骨髓组愈合例数为0/3例，植入骨髓组为13/17例。Connolly等[23]使用自体骨髓3～5ml局部注射治疗20例胫骨骨折不愈合患者，其中18例愈合，平均时间为6个月。郑承泽等[24]使用多孔磷酸三钙与自体骨髓复合物移植修复21例骨缺损患者，其中肿瘤17例，陈旧骨折4例;术后3个月，植入物与周围骨组织愈合;随访1～3年，疗效满意。用骨髓基质细胞修复动物关节软骨，修复组织为透明软骨，生物特性接近正常关节软骨[17,20]。可以设想，用生物合成材料预制成人体解剖结构，吸附细胞，并加入调控因子，体外合成组织器官会成为现实。
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参 考 文 献
1.Owen ME. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system.In:Peck WA,eds. Bone and Mineral Research. Amsterdam:Elsevier,1984.1-25.
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3.Van Vlasselaer P,Falla N,Snoeck H. Char-acterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two color cell sorting using anti Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin.Blood,1994,84: 753-763.
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4.Friedenstein AJ. Stromal mechanisms of bone marrow:cloning in vitro and retransplantation in vivo. Hamatol Bluttransfus, 1980, 25: 19-29.
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收稿日期:1998-12-14, http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：
中华骨科杂志000214
骨髓基质是对骨髓血系细胞起支持和连接作用的组织,并影响血系细胞分化。骨髓基质细胞包括：骨系细胞、成纤维细胞、网状细胞、脂细胞[1]，此外,还包括巨噬细胞和内皮细胞。骨髓基质中含有多能干细胞，Owen称之为骨髓基质干细胞，假定这种细胞分化为定向祖细胞，后者可分化为成纤维细胞、网状细胞、脂细胞、骨源性细胞(osteogeniccell)[1]。骨髓基质干细胞可以在无诱导下骨化，称为确定性骨源性前体细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC),也称作骨源性干细胞(osteogenic stem cell);而在骨以外组织中存在的干细胞需要骨基质和移行上皮来源的因子诱导骨化，称之为诱导性骨源性前体细胞(inducible osteogenic precursor cell,IOPC)。骨髓基质中骨源性干细胞是骨愈合过程中骨化的重要细胞，对其研究有助于更好地认识骨愈合的过程和机制，为临床促进骨愈合提供理论基础。
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一、骨髓基质中骨源性干细胞的识别和分离
确定骨源性干细胞最可靠的方法是：检测细胞分化后产生矿化或骨样化结节。结节可以通过Von Kossa染色识别，或在相差显微镜下看到，骨样结节还表现碱性磷酸酶(APase)、Ⅰ型胶原和骨钙素阳性[2]。对于骨源性干细胞表面抗原和其它特征了解很少。Vlasselaer用荧光激活细胞分离技术(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)分离骨髓细胞，发现经向前光散射(forward light scatter，FIS)、垂直光散射(perpendicular light scatter，PIS)骨源性干细胞出现在FSChighSSChigh部分。这部分细胞经Sca-1抗体和麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)再次选择,骨源性干细胞出现在Sca-1+和麦胚凝集素高亲和部分。经过选择的骨源性干细胞可以分化成骨细胞、表达APase，产生胶原、骨钙素和矿化，但骨化能力较没有经选择的细胞弱，可能是选择过程损伤或丢失了一部分骨源性干细胞[3]。SH2、SH3、SH4、Stro-1抗体也可以识别部分骨源性干细胞。此外，骨源性干细胞和大豆凝集素亲和[2]。经细胞分离液离心后，骨源性干细胞位于≤1.075g/cm3部分。全骨髓细胞培养，血系细胞不贴壁7d内死亡或换液弃去，余下细胞形成单层成纤维细胞集落，骨源性干细胞就存在其中，可达到大致分离的目的[2,4]。
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二、骨髓中骨源性干细胞数目
骨髓细胞体外培养，血系细胞死亡，基质细胞贴壁生长形成成纤维细胞集落，这些细胞被称为成纤维细胞集落形成单位(colonyforming unitfibroblastic CFU-F)。CFU-F仅占骨髓细胞一小部分，并与动物种属、年龄有关。小鼠CFU-F占骨髓有核细胞的1/(2.5×104),兔占1/(3.3×105)，人占1×106～10×106[2]。集落形成效率(colonyforming efficiency，CFE)也是反映CFU-F数量的指标,表示体外培养形成集落(≥50个细胞)除以接种的骨髓有核细胞数。不同种属动物CFE值1×10-5～5×10-5[4,5]，年老动物CFE下降，切除卵巢后CFE下降，双氢速甾醇Dihydrotachystero[1,25(OH)2D3类似物]可以使CFE增高[5]。CFU-F中骨源性干细胞含量和分化骨化能力有很大差别，几内亚猪和兔的CFU-F40%可以在体内骨化；小鼠CFU-F30%可以体内骨化[4]。而小鼠CFU-F在体外培养形成矿化结节的只占11%。静脉注射5-氟尿嘧啶(5-FU)可以提高CFU-F/有核细胞比值5倍，骨源性干细胞增加12倍[2]。
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三、骨髓基质细胞体外成骨能力的研究
骨髓基质细胞体外培养，其中的骨源性干细胞增殖分化为成骨细胞和骨细胞，其分化各阶段特点见表1[6]。
大鼠骨髓基质细胞培养(含地塞米松dexamethasone,DEX)，APase和骨涎蛋白(sialoprotein)mRNA8d达最高，12d后下降[7]。APase最先出现在集落中央，此处细胞密集接触，生长抑制，细胞开始分化。APase常作为有骨化潜能的细胞标记。骨钙素mRNA也出现在第8d，12d后明显升高，骨连接素一直处于高水平，骨桥素呈减少趋势，矿化结节出现在12d[7]。值得注意的是仅55%的APase阳性细胞形成矿化结节，可能是APase阳性不都是成骨潜能细胞，或一些成骨潜能的细胞不能分化至形成矿化结节节段。因为骨钙素开始表达于成骨细胞，大鼠骨髓基质骨源性干细胞体外分化至成骨细胞需8～12d。矿化结节是成骨细胞分泌的钙盐形成，出现于第12d，也提示成骨细胞出现于第12d。
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骨髓基质细胞在(不含DEX)培养状态下也可分化为成骨细胞[2]，成骨细胞形成矿化结节，则必须有维生素C和β-磷酸甘油存在，后者提供有机磷[2,8]，维生素C是合成胶原和骨形成的要求，调节成骨样细胞ATPase、APase和蛋白合成[8]。
四、骨髓基质细胞成骨的体内研究
完整的骨髓移植至皮下或肾囊可形成骨组织。1×107个骨髓细胞悬液放入扩散格再植入皮下，3d时仅有15个成纤维细胞，20d增加至1×106，在出现APase(细胞分化)之前细胞倍增13～14次(213～14倍)，证明骨髓基质细胞有很强增殖能力[9]。植入1周有纤维组织出现，2周纤维组织占大部分空间，至20d有骨软骨组织形成，软骨位于中央，外面有部分骨组织，最外面是一层纤维组织包围，纤维组织与扩散格壁(diffusion chamber)接触。在最初的纤维组织中含Ⅲ型胶原，Laminin和纤维连接素，Ⅰ、Ⅱ型胶原；骨软骨形成后以Ⅰ、Ⅱ型胶原为主，Ⅲ型胶原和层粘连蛋白(laminin)，纤维连接素减少至消失[10]。
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表1骨系细胞分化各阶段特点 阶段
碱性磷
酸酶
鼠骨髓211.13
单抗识别
骨钙素
骨桥素
骨涎蛋白
甲状旁腺
素受体
地塞米松反应
表达骨抗原
地塞米松反应
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体外骨化
骨原性干
细胞
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早期骨祖
细胞？--------？？？？？
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晚期骨祖
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前成骨
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注:+出现,-不出现,?不清楚,(-)未表达
骨髓基质细胞体外培养后附着于多孔陶瓷内再植入体内,也可形成骨组织。2周后出现成骨细胞,骨组织占陶瓷体积的40%，3周后出现一层编织骨，4周后骨组织占据整个植入体,有少于10%的软骨形成[11]。细胞在多孔陶瓷内的骨化优于扩散格,经过培养的骨髓基质细胞的骨化优于全骨髓细胞[11]。
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五、影响骨髓基质干细胞骨化的因素
细胞密集有利于骨化，矿化结节最先出现在集落中央细胞聚集区。骨髓基质细胞培养，接种密度≥2.4×104/cm2有利于矿化结节形成[12]。体内接种细胞密度≥5×105/ml才分化骨化[11]。
骨髓基质细胞骨化能力强于全骨髓细胞。骨髓基质细胞传代18次后植于皮下仍有骨化能力，原代细胞骨化能力最强，需要2周时间，第7代细胞骨化需要6周时间，第18代需12周。软骨形成只见于原代、第1和第2代细胞。经冻存复苏的细胞骨化能力不受影响[11]。
皮质醇调节正在分化细胞的基因表达,诱导基因组目的序列皮质醇受体的亲和性;氢化可的松和地塞米松(DEX)增加APase活性，促进集落形成；DEX使细胞形态由长变方，增加基质细胞对甲状旁腺素(PTH)和前列腺素E2反应的cAMP水平，诱导细胞分化表达骨钙素，不影响骨连接素mRNA,增加Ⅰ型胶原和骨桥素mRNA，矿化结节数目增多。因此，DEX有诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞作用，促分化的同时也抑制了骨髓基质细胞增生[12]。
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孕激素(黄体酮)对骨髓基质中的骨源性干细胞也有诱导作用，可以增加细胞在体外培养状态的矿化结节数，矿化结节显著出现于16～20d，而DEX作用下矿化结节出现于10～12d，提示对孕激素反应的细胞分化至成骨细胞时间较长，可能是孕激素作用于较早期的骨源性干细胞，而DEX对早和晚期骨源性干细胞都有作用[6]。
转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族是重要的骨诱导因子，目前发现有：骨形态发生蛋白2～8(bone morphogenetic protein，BMP)、Dorsophila dpp、Dorsophila 60A有体内异位骨诱导作用；TGF-β、激活蛋白(activin)A、B无体内骨诱导作用；Vg1作用不详。TGF-β、BMP2可刺激体外培养的骨祖细胞增殖，TGF-β作用强于BMP2,尤其是对早期骨祖细胞作用强。TGF-β1促进骨髓基质细胞增殖但APase减少，使细胞在体外失去成骨能力，而植入体内又获得成骨能力[13]。BMP6、7在体外有诱导骨源性干细胞分化作用。
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1,25(OH) 2D3可促进骨祖细胞增殖，碱性成纤维细胞生长因子可促进早期骨祖细胞增殖[14]。上皮细胞生长因子使CFU-F集落数目减少，集落直径增大，APase阳性集落比例减小[15]。血小板衍生生长因子PDGF-BB可以使骨髓基质细胞增殖，APase活性减小[13]。成骨细胞与骨髓基质细胞混合培养，可促进骨髓基质细胞骨结节形成，成骨细胞旁分泌一种生长因子(相对分子质量1×104～3×104),这一因子不同于TGF-β、胰岛素样生长因子IGFs Ⅰ、Ⅱ和酸性成纤维细胞生长因子，可以刺激骨祖细胞分化，APase阳性细胞先增多而后减少[16]。
六、骨髓基质细胞成软骨的能力
骨髓基质细胞在体内、体外都有成软骨能力。Ephrat以维生素C、DEX、碱性成纤维细胞生长因子在体外诱导骨髓基质细胞，细胞密度大于1×106/cm2，培养诱导后软骨细胞比例达到85%[17,18]。含透明质酸培养基，低氧浓度(8%)可诱导软骨细胞生成20%～30%[19]。避免细胞与培养皿接触利于软骨形成，凝胶中悬浮培养可以提供这样的条件。
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骨髓基质细胞在胶原负载下植入关节软骨缺损，2周后植入组织表层(关节面)细胞为圆形，甲苯胺蓝染色(+)，深层形成松质骨。表明骨髓基质细胞在不同体内环境中可以分化为骨组织或者软骨组织，关节内有利于软骨发生，推测损伤后的软骨释放或吸引生物活性因子(如TGF-β超家族),诱导成软骨祖细胞分化[20]。
七、骨髓基质中骨源性干细胞与组织工程及临床意义
骨修复是骨科的基本问题，创伤和手术后的骨缺损常常需要植骨愈合，自体骨移植可以造成供骨部位并发症，异体骨移植有排斥反应，两者骨来源都有限，植入骨形状很难与原解剖形状相符，会影响功能。关节软骨损伤不能自行修复，软骨移植因为来源有限和塑形困难不能广泛使用。组织工程将是骨、软骨修复的理想方法。
组织工程的简单定义就是制作新的组织以替换和再生体内组织。它可以将少量细胞培养成骨和软骨组织。体内骨修复过程包括：血肿形成，化学信号趋化骨源性干细胞并促其分化，软骨内成骨。组织工程人工模拟这一过程，包括三方面因素：调控信号、细胞、细胞外基质。如前所述，骨髓基质细胞有良好增殖和分化成骨、成软骨能力，是组织工程的理想细胞。
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TGF-β(超家族)、生长因子、DEX等因子在体内骨愈合过程中起趋化、诱导骨源性干细胞增殖分化的作用，组织工程技术利用这些因子在体外发挥调控作用。细胞外基质提供细胞生长分化的支架，并为细胞传递控制生长和形态的因子。理想的细胞外基质应具备：(1)组织相容性;(2)可吸收性;(3)易于加工制作；(4)表面与细胞相互作用以保留分化细胞的功能。天然基质成分有：胶原、透明质酸等，可作为骨髓基质细胞向软骨分化的载体成分[17,20]。人工合成的基质有：羟基磷灰石、聚乳酸、聚乙醇酸等。人工合成材料为多孔或非编织纤维网结构，孔径大于100μm，中空体积达90%，可以吸附大量细胞，保证细胞与外界物质交换。羟基磷灰石适合负载骨髓基质细胞分化成骨；聚乳酸、聚乙醇酸是可降解材料，在数月至数年内完全被体内组织取代，降解产物无副作用，是软骨细胞良好的载体。
骨髓促进骨愈合的动物试验表明:试验动物(兔)桡骨缺损1cm,经一次自体骨髓局部注射,表现出较好的成骨作用,12周后骨缺损间隙为1mm,对照组则为7.5mm[21]。Grundel等[22]比较羟基磷灰石作为载体吸附骨髓修复犬的骨缺损，未移植骨髓组愈合例数为0/3例，植入骨髓组为13/17例。Connolly等[23]使用自体骨髓3～5ml局部注射治疗20例胫骨骨折不愈合患者，其中18例愈合，平均时间为6个月。郑承泽等[24]使用多孔磷酸三钙与自体骨髓复合物移植修复21例骨缺损患者，其中肿瘤17例，陈旧骨折4例;术后3个月，植入物与周围骨组织愈合;随访1～3年，疗效满意。用骨髓基质细胞修复动物关节软骨，修复组织为透明软骨，生物特性接近正常关节软骨[17,20]。可以设想，用生物合成材料预制成人体解剖结构，吸附细胞，并加入调控因子，体外合成组织器官会成为现实。
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收稿日期:1998-12-14, http://www.100md.com