一氧化氮(NO)在脊髓缺血再灌注损伤中作用的实验研究
作者：于泽生 刘忠军 党耕町
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：一氧化氮；脊髓损伤；神经元
中华骨科杂志000213
【摘要】目的研究一氧化氮(NO)在脊髓缺血再灌注损伤中的作用。方法夹闭大鼠腹主动脉制成缺血再灌注模型，随机分成L-NAME组和再灌注组，L-NAME组每日腹腔注射一氧化氮合酶(NOS)非特异性抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)10mg/kg体重，两周时取大鼠脊髓做NOS免疫组织化学染色、组织学及超微病理观察。结果脊髓缺血再灌注后前角运动神经元出现固有型一氧化氮合酶(cNOS)阳性表达，同时伴随前角运动神经元损伤；应用L-NAME后可减少cNOS的异常表达，减轻前角运动神经元损伤。结论局部组织中NO产生增多可能是脊髓再灌注损伤的机制之一。
, 百拇医药
Experimental studies on effect of nitrous oxide reperfusion for the treatment of spinal cord ischemia
YU Zesheng， LIU Zhongjun， DANG Gengting.
(The Third Teaching Hospital, Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
【 Abstract】 Objective To clarify the effect of nitrous oxide(NO) for the treatment of spinal cord ischemia reperfusion injury. Methods The animal modle was established by clamping rat's abodominal aorta. The animals were randomly divided into NG-nitiro- L-arginine methylester (L-NAME) group and reperfusion group; the animals in L-NAME group received intraperitoneal injection of L-NAME at a dose of 10 mg/kg body weight everyday. Two weeks after experiment rat spinal cord was sectioned and stained by nitrous oxide synthase(NOS) immunochemistry and the ultrastructural histopathologic changes were observed. Results Expression of constitutive NO synthase(cNOS) was induced in spinal ventral horn motorneuron with motorneuron damage after spinal cord ischemia reperfusion, animals that were given L-NAME had lower expression of cNOS and less damage of motorneuron. Conclusion Increase of NO production in local tissue may cause reperfusion injury.
, 百拇医药
【 Key words】Nitric oxide； Spinal cord injuries； Neurons
目前认为脊髓缺血再灌注损伤的发病机制与离子平衡失调[1]、自由基与脂质过氧化[2]及兴奋性氨基酸有关[3]。近年来发现一氧化氮是一种活跃的小分子自由基，具有神经毒性[4]，本实验观察缺血再灌注后大鼠脊髓中一氧化氮合酶(nitrous oxide synthase,NOS)的异常表达和神经元损伤情况，目的在于明确NO在脊髓再灌注损伤中的作用，完善再灌注损伤机制，为临床治疗提供理论依据。
材料与方法
一、动物模型的制作
29只雄性SD大鼠，腹腔麻醉，无菌条件下开腹暴露腹主动脉，在左肾动脉上方0.5cm处夹闭腹主动脉，夹闭40min后放开，缝合伤口，分笼饲养，自由进食。
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二、动物分组
L-NAME组15只，术后当天开始腹腔注射NOS非特异性抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)10mg/kg体重，每日一次，连续注射14d；再灌组14只，术后不予任何治疗；另有7只正常雄性SD大鼠开腹暴露腹主动脉但不夹闭，作为对照组。
三、取材
于再灌后两周处死动物，经左心室插管灌注固定后迅速将腰段脊髓完整取出以锐刀截取1cm腰髓，用于光镜检查和免疫组织化学染色的标本以质量分数为4%多聚甲醛后固定6h，移至质量分数30%蔗糖溶液中,4℃冰箱过夜;用于电镜检查的标本则以质量分数3%戊二醛固定2h。
四、免疫组织化学染色
采用NOS1和NOS2两种抗体染色，光镜下观察前角NOS阳性细胞并记数。
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五、统计分析
实验结果采用SPSS软件包经计算机统计处理。
结果
一、免疫组织化学染色结果
(一)NOS1染色：三组动物脊髓中均有固有型一氧化氮合酶(constitutive NO synthase,cNOS)表达，对照组大鼠脊髓cNOS阳性细胞主要分布于中央导水管周围和后角浅层，前角运动神经元无cNOS免疫活性；L-NAME组和再灌注组大鼠脊髓除上述区域表达cNOS外，前角运动神经元也出现cNOS阳性表达，其染色颗粒存在于胞浆中(图1)；L-NAME组与再灌注组比较前角cNOS阳性运动神经元数明显减少(表1)。
图1 大鼠脊髓缺血再灌注后前角运动神经元出现cNOS阳性表达 ×40
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图2 再灌注组大鼠脊髓前角运动神经元嗜酸性变,细胞皱缩,胞浆、胞核及尼氏体不清 ×20
图3 L-NAME组,个别前角运动神经元轻度损害呈尼氏体溶解,血管增生明显× 20
图4 再灌注组大鼠脊髓前索,部分髓鞘高度解离,轴索内团块状致密物沉积 透射电镜 ×8 000
图5 L-NAME组大鼠脊髓前索,灰质内血管增生,少数髓鞘轻度解离 透射电镜 ×6 700
表1 L-NAME组和再灌注组脊髓前角cNOS阳性运动神经元数 组别
前角cNOS阳性运动神经元个数
L-NAME组
2.66±0.61
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再灌注组
8.68±1.36
注：t检验,P<0.05
(二)NOS2染色：三组大鼠脊髓均无iNOS阳性表达。
二、组织学与超微病理结果
HE染色显示再灌注组中脊髓损伤以前角运动神经元为主，表现为嗜酸性变，细胞皱缩,胞浆、胞核及尼氏体不清(图2)；L-NAME组损伤明显较轻，仅个别前角运动神经元轻度损害呈尼氏体溶解，血管增生明显(图3)。电镜显示再灌组前角运动神经元胞体皱缩,基质致密度增加，核染色质浓聚，部分髓鞘高度解离及脱失，轴索内线粒体基质的絮状沉积和变性的神经微丝形成团块状电子致密物(图4)；L-NAME组灰质内血管增生，少数髓鞘轻度解离(图5)。结果显示L-NAME组脊髓前角运动神经元损伤程度明显低于再灌注组。
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讨论
NO半衰期很短，直接测定困难，常用间接法如测NO的终产物亚硝酸盐以及免疫组织化学检测NOS的分布和含量。到目前为止，研究发现生理情况下NO在中枢神经系统中具有神经递质和神经内分泌功能[5,6]，但NO的过量合成会产生神经毒性[4]。近几年研究发现NO参与脊髓损伤。在脊神经前根撕裂的大鼠模型中NO导致了运动神经元损伤[7]；NO是否在脊髓缺血再灌注损伤中起作用是一个值得研究的问题。
正常脊髓中cNOS阳性细胞主要分布于灰质后角、中间外侧柱和中央导水管周围，而前角运动神经元无cNOS表达[8]。本实验发现缺血再灌后大鼠脊髓除上述区域表达cNOS外，前角运动神经元也出现cNOS阳性表达，病理结果显示再灌后损伤主要发生于前角运动神经元，说明脊髓缺血再灌注可诱导cNOS的表达，其异常表达与前角运动神经元损伤有关，而这种关联是通过cNOS合成NO起作用的。再灌注后给予NOS抑制剂L-NAME则cNOS阳性运动神经元数量明显减少，运动神经元受损程度明显减轻，说明抑制cNOS的异常表达可使再灌注损伤减轻，进一步显示局部NO产生增多可能是再灌注损伤的原因之一。研究表明异常出现的NO引起损伤的机制为NOS合成还原型离子NO·，NO·与超氧阴离子(O2-)作用形成亚硝基阴离子(ONOO-),然后降解为羟自由基(OH-)和二氧化氮自由基(NO2-),两者性质活泼引起蛋白质、核酸和脂质膜的损伤[9]。
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综上所述，作者认为局部组织中NO产生增多可能是脊髓再灌注损伤的机制之一。本实验采用腹腔注射L-NAME 10mg/kg体重给药，对脊髓损伤有保护作用，其量效关系值得进一步研究。
参 考 文 献
1.Chavko M, Kalincakova K, Kluchova D, et al. Blood flow and electrolytes in spinal cord ischemia. Exp Neurol, 1991， 112:299- 303.
2.Basem K, Chester DY, Edward WF, et al. Prevention of spinal cord injury after transient aortic clamping with tissue factor pathway inhibitor.Surgery, 1996， 119: 269- 274.
, 百拇医药
3.Simpson RK Jr, Robertson CS, Goodman JC. Spinal cord ischemia induced elevation of amino acids: extracellular measurement with microdialysis. Neurochem Res, 1990, 15: 635- 639.
4.Dawson VL, Brahmbhatt HP, Mong JA,et al. Expression of inducible nitric oxide synthase cause delayed neurotoxicity in primary mixed neuronal glial cortical cultures. Neuropharmacology,1994, 33:1425- 1430.
5.Snvder SH. Nitric oxide: first in a new class of neurotransmitters. Science, 1992, 257: 494- 496.
, http://www.100md.com
6.Forstermann U, Gorsky LD, Pollock JS, et al. Regional distribution of EDRF/NO- synthesizing enzyme(s) in rat brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990,168:727- 732.
7.Wu W, Li L. Inhibition of nitric oxide synthase reduces motoneuron death due to spinal root avulsion. Neurosci Lett, 1993, 153: 121- 124.
8.Dun NJ, Dun SL, Forstermann U, et al. Nitric oxide synthase immunoreactivity in rat spinal cord. Neurosci Lett, 1992, 147: 217- 220.
9.Radi R, Beckman JS, Bush KM, et al. Peroxynitrite induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys, 1991, 288: 481- 487.
收稿日期:1998-11-06, http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三医院骨科
关键词：一氧化氮；脊髓损伤；神经元
中华骨科杂志000213
【摘要】目的研究一氧化氮(NO)在脊髓缺血再灌注损伤中的作用。方法夹闭大鼠腹主动脉制成缺血再灌注模型，随机分成L-NAME组和再灌注组，L-NAME组每日腹腔注射一氧化氮合酶(NOS)非特异性抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)10mg/kg体重，两周时取大鼠脊髓做NOS免疫组织化学染色、组织学及超微病理观察。结果脊髓缺血再灌注后前角运动神经元出现固有型一氧化氮合酶(cNOS)阳性表达，同时伴随前角运动神经元损伤；应用L-NAME后可减少cNOS的异常表达，减轻前角运动神经元损伤。结论局部组织中NO产生增多可能是脊髓再灌注损伤的机制之一。
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Experimental studies on effect of nitrous oxide reperfusion for the treatment of spinal cord ischemia
YU Zesheng， LIU Zhongjun， DANG Gengting.
(The Third Teaching Hospital, Beijing Medical University,Beijing 100083,China)
【 Abstract】 Objective To clarify the effect of nitrous oxide(NO) for the treatment of spinal cord ischemia reperfusion injury. Methods The animal modle was established by clamping rat's abodominal aorta. The animals were randomly divided into NG-nitiro- L-arginine methylester (L-NAME) group and reperfusion group; the animals in L-NAME group received intraperitoneal injection of L-NAME at a dose of 10 mg/kg body weight everyday. Two weeks after experiment rat spinal cord was sectioned and stained by nitrous oxide synthase(NOS) immunochemistry and the ultrastructural histopathologic changes were observed. Results Expression of constitutive NO synthase(cNOS) was induced in spinal ventral horn motorneuron with motorneuron damage after spinal cord ischemia reperfusion, animals that were given L-NAME had lower expression of cNOS and less damage of motorneuron. Conclusion Increase of NO production in local tissue may cause reperfusion injury.
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【 Key words】Nitric oxide； Spinal cord injuries； Neurons
目前认为脊髓缺血再灌注损伤的发病机制与离子平衡失调[1]、自由基与脂质过氧化[2]及兴奋性氨基酸有关[3]。近年来发现一氧化氮是一种活跃的小分子自由基，具有神经毒性[4]，本实验观察缺血再灌注后大鼠脊髓中一氧化氮合酶(nitrous oxide synthase,NOS)的异常表达和神经元损伤情况，目的在于明确NO在脊髓再灌注损伤中的作用，完善再灌注损伤机制，为临床治疗提供理论依据。
材料与方法
一、动物模型的制作
29只雄性SD大鼠，腹腔麻醉，无菌条件下开腹暴露腹主动脉，在左肾动脉上方0.5cm处夹闭腹主动脉，夹闭40min后放开，缝合伤口，分笼饲养，自由进食。
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二、动物分组
L-NAME组15只，术后当天开始腹腔注射NOS非特异性抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)10mg/kg体重，每日一次，连续注射14d；再灌组14只，术后不予任何治疗；另有7只正常雄性SD大鼠开腹暴露腹主动脉但不夹闭，作为对照组。
三、取材
于再灌后两周处死动物，经左心室插管灌注固定后迅速将腰段脊髓完整取出以锐刀截取1cm腰髓，用于光镜检查和免疫组织化学染色的标本以质量分数为4%多聚甲醛后固定6h，移至质量分数30%蔗糖溶液中,4℃冰箱过夜;用于电镜检查的标本则以质量分数3%戊二醛固定2h。
四、免疫组织化学染色
采用NOS1和NOS2两种抗体染色，光镜下观察前角NOS阳性细胞并记数。
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五、统计分析
实验结果采用SPSS软件包经计算机统计处理。
结果
一、免疫组织化学染色结果
(一)NOS1染色：三组动物脊髓中均有固有型一氧化氮合酶(constitutive NO synthase,cNOS)表达，对照组大鼠脊髓cNOS阳性细胞主要分布于中央导水管周围和后角浅层，前角运动神经元无cNOS免疫活性；L-NAME组和再灌注组大鼠脊髓除上述区域表达cNOS外，前角运动神经元也出现cNOS阳性表达，其染色颗粒存在于胞浆中(图1)；L-NAME组与再灌注组比较前角cNOS阳性运动神经元数明显减少(表1)。
图1 大鼠脊髓缺血再灌注后前角运动神经元出现cNOS阳性表达 ×40
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图2 再灌注组大鼠脊髓前角运动神经元嗜酸性变,细胞皱缩,胞浆、胞核及尼氏体不清 ×20
图3 L-NAME组,个别前角运动神经元轻度损害呈尼氏体溶解,血管增生明显× 20
图4 再灌注组大鼠脊髓前索,部分髓鞘高度解离,轴索内团块状致密物沉积 透射电镜 ×8 000
图5 L-NAME组大鼠脊髓前索,灰质内血管增生,少数髓鞘轻度解离 透射电镜 ×6 700
表1 L-NAME组和再灌注组脊髓前角cNOS阳性运动神经元数 组别
前角cNOS阳性运动神经元个数
L-NAME组
2.66±0.61
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再灌注组
8.68±1.36
注：t检验,P<0.05
(二)NOS2染色：三组大鼠脊髓均无iNOS阳性表达。
二、组织学与超微病理结果
HE染色显示再灌注组中脊髓损伤以前角运动神经元为主，表现为嗜酸性变，细胞皱缩,胞浆、胞核及尼氏体不清(图2)；L-NAME组损伤明显较轻，仅个别前角运动神经元轻度损害呈尼氏体溶解，血管增生明显(图3)。电镜显示再灌组前角运动神经元胞体皱缩,基质致密度增加，核染色质浓聚，部分髓鞘高度解离及脱失，轴索内线粒体基质的絮状沉积和变性的神经微丝形成团块状电子致密物(图4)；L-NAME组灰质内血管增生，少数髓鞘轻度解离(图5)。结果显示L-NAME组脊髓前角运动神经元损伤程度明显低于再灌注组。
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讨论
NO半衰期很短，直接测定困难，常用间接法如测NO的终产物亚硝酸盐以及免疫组织化学检测NOS的分布和含量。到目前为止，研究发现生理情况下NO在中枢神经系统中具有神经递质和神经内分泌功能[5,6]，但NO的过量合成会产生神经毒性[4]。近几年研究发现NO参与脊髓损伤。在脊神经前根撕裂的大鼠模型中NO导致了运动神经元损伤[7]；NO是否在脊髓缺血再灌注损伤中起作用是一个值得研究的问题。
正常脊髓中cNOS阳性细胞主要分布于灰质后角、中间外侧柱和中央导水管周围，而前角运动神经元无cNOS表达[8]。本实验发现缺血再灌后大鼠脊髓除上述区域表达cNOS外，前角运动神经元也出现cNOS阳性表达，病理结果显示再灌后损伤主要发生于前角运动神经元，说明脊髓缺血再灌注可诱导cNOS的表达，其异常表达与前角运动神经元损伤有关，而这种关联是通过cNOS合成NO起作用的。再灌注后给予NOS抑制剂L-NAME则cNOS阳性运动神经元数量明显减少，运动神经元受损程度明显减轻，说明抑制cNOS的异常表达可使再灌注损伤减轻，进一步显示局部NO产生增多可能是再灌注损伤的原因之一。研究表明异常出现的NO引起损伤的机制为NOS合成还原型离子NO·，NO·与超氧阴离子(O2-)作用形成亚硝基阴离子(ONOO-),然后降解为羟自由基(OH-)和二氧化氮自由基(NO2-),两者性质活泼引起蛋白质、核酸和脂质膜的损伤[9]。
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综上所述，作者认为局部组织中NO产生增多可能是脊髓再灌注损伤的机制之一。本实验采用腹腔注射L-NAME 10mg/kg体重给药，对脊髓损伤有保护作用，其量效关系值得进一步研究。
参 考 文 献
1.Chavko M, Kalincakova K, Kluchova D, et al. Blood flow and electrolytes in spinal cord ischemia. Exp Neurol, 1991， 112:299- 303.
2.Basem K, Chester DY, Edward WF, et al. Prevention of spinal cord injury after transient aortic clamping with tissue factor pathway inhibitor.Surgery, 1996， 119: 269- 274.
, 百拇医药
3.Simpson RK Jr, Robertson CS, Goodman JC. Spinal cord ischemia induced elevation of amino acids: extracellular measurement with microdialysis. Neurochem Res, 1990, 15: 635- 639.
4.Dawson VL, Brahmbhatt HP, Mong JA,et al. Expression of inducible nitric oxide synthase cause delayed neurotoxicity in primary mixed neuronal glial cortical cultures. Neuropharmacology,1994, 33:1425- 1430.
5.Snvder SH. Nitric oxide: first in a new class of neurotransmitters. Science, 1992, 257: 494- 496.
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6.Forstermann U, Gorsky LD, Pollock JS, et al. Regional distribution of EDRF/NO- synthesizing enzyme(s) in rat brain. Biochem Biophys Res Commun, 1990,168:727- 732.
7.Wu W, Li L. Inhibition of nitric oxide synthase reduces motoneuron death due to spinal root avulsion. Neurosci Lett, 1993, 153: 121- 124.
8.Dun NJ, Dun SL, Forstermann U, et al. Nitric oxide synthase immunoreactivity in rat spinal cord. Neurosci Lett, 1992, 147: 217- 220.
9.Radi R, Beckman JS, Bush KM, et al. Peroxynitrite induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys, 1991, 288: 481- 487.
收稿日期:1998-11-06, http://www.100md.com