人血管内皮细胞生长因子的cDNA克隆及其在兔成骨细胞中的表达
作者：杨述华 杨操 许伟华 李进 张银钢 屈伸
单位：杨述华 杨操 许伟华 李进 张银钢(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院骨科)；屈伸(同济医科大学基础医学院生化教研室)
关键词：内皮细胞生长因子；血管；基因扩增；基因表达
中华骨科杂志000210
【摘要】目的获得人VEGF165cDNA并构建其真核表达载体，探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因治疗骨科各种疾患的可行性。方法采用巢式(polymerase chain reaction,PCR)技术。从HL60细胞中扩增出人血管内皮生长因子(hVEGF165)cDNA，并将这一cDNA克隆至pcDNA3真核表达载体上，构建成为pCD-hVEGF165重组质粒。并对cDNA片段进行了限制性酶切分析及DNA测序分析。应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入兔成骨细胞后，用链酶亲合素-生物素-酶复合物法(streptavidin-biotin-enzymecomplex，SABC)进行瞬时表达的检测。结果经酶切鉴定及基因测序证实,克隆的基因片段为人VEGF165cDNA，重组质粒pCD-hVEGF165转染成骨细胞后，免疫组化检测有VEGF表达。结论我们成功地克隆了人VEGF165基因，为进一步研究VEGF基因治疗骨缺血性坏死、骨缺损及骨折的修复打下了基础。
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Cloning of human vascular endothelial growth factor cDNA and its expression in rabbit osteoblasts
YANG Shuhua,YANG Cao, XU Weihua, et al.
(Department of Orthopaedics, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
【 Abstract】 Objective To clone VEGF gene and construct its eukaryotic expression vector for the evaluation of the possability of VEGF gene therapy in orthopedic disease. Methods Human vascular endothelial growth factor(hVEGF) cDNA was amplified by nested PCR method from the HL60 cells and cloned to expression vector pcDNA 3. The cDNA was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Rabbit osteoblasts were transfered with pCD-hVEGF165 plasmid by lipofectin mediated gene transfer method. The transient expression of VEGF were detected by Streptavidin-Biotin-enzyme Complex(SABC). Results The cloned cDNA was confirmed to be VEGF165 cDNA. It was observed that the expression of human VEGF gene was detected distinctly 72 h after transfering. Conclusion We successfully cloned hVEGF165 gene and construced its eukaryotic expression vector, which provided the further foundation of VEGF gene therapy for ostenecrosis,bone defeat and fracture.
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【 Key words】Endothelial growth factors； Blood vessels； Gene amplification； Gene expression
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子。近年来，应用VEGF基因治疗四肢动脉栓塞及心肌缺血性疾病已成为国内外研究热点，有些学者已开始进行临床试验[1,2]。骨组织的发育、改建、愈合均离不开血管生成。为了研究VEGF在骨科各种疾患中基因治疗的可行性，我们进行了VEGF的基因克隆、表达载体的构建及其在体外培养的成骨细胞中表达的研究。
材料与方法
一、引物设计
根据Leurg[3]和Tischer等[4]报告的人VEGF cDNA序列。我们设计了两对引物,其中P1、P2为上游引物，P3、P4为下游引物，在引物P2、P3两端通过改变碱基引入了BamHI和EcoRI两个酶切位点，用于构建真核表达质粒。
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P1:(37-56)5'-CCGGTCGGGCCTCCGAAAC-3',P2:(47-77)5'-GTTGGATCCGAAACCATGAACTTCTGCTG-3',P3:(613-642)5'-ATTGAATTCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3',P4:(669-689)5'-CTGGTGAGAGATCTGGTTCC-3'
二、细胞培养
HL60细胞(购自武汉大学典型培养物保存中心)用含体积分数为10%小牛血清RPMI-1640培养基培养，细胞处于对数生长期时加入PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)至10ng/ml，继续培养36h。
三、总RNA提取及逆转录
用异硫氰酸胍一步法提取HL60细胞总RNA[5],以Oligo(dT)12-18为引物,利用SuperscriptTM Preamplification System(GIBCO)反转录合成cDNA第一链。
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四、巢式PCR扩增VEGFcDNA
第一轮反应以反转录产物2μl为模板，以P1、P4为引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，反应总体积为50μl，循环参数为94℃×45s,50℃×50s，72℃×1min,30次循环。第二轮反应扩增取第一轮PCR产物4μl作为模板,以P2、P3为引物，反应总体积为100μl,循环参数为94℃×45s,58℃×50s,72℃×1min,35次循环。取PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。
五、pCD-hVEGF165质粒的构建
将特异PCR产物利用低溶点琼脂糖凝胶(GIBCO)电泳回收纯化后用BamHI及EcoRI(GIBCO)酶切。真核表达载体pcDNA3(同济医科大学生化教研室提供)也用BamHI及EcoRI酶切，酶切产物经酚∶氯仿抽提后用T4DNA连接酶(GIBCO)连接，连接产物转化感受态细菌HB101。挑选抗氨苄青霉素的克隆进行小量颗粒制备，用HindⅢ及XbaI(GIBCO)双酶切选取有特异cDNA片段插入的阳性重组质粒。
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六、hVEGF165 cNDA鉴定
将重组质粒大量制备，用BamHI、EcoRI酶切后回收插入pcDNA3中的cDNA，用HaeⅢ、HinfI(Promega)进行酶切鉴定。以重组质粒为模板，以pcDNA3载体T7启动子的序列为引物，应用Sanger链末端终止法，以荧光染料标记，在ABI3T3型DNA自动测序仪上测定插入cDNA的序列。
七、兔成骨细胞培养
取大耳白兔胎兔的颅骨、剪碎后I型胶原酶(Sigma)消化，用含体积分数为10%小牛血清的DMEM(GIBCO)培养基培养，传一代至六孔培养板，当细胞处于对数生长期时用于转染。
八、基因转染
参照Lipofectin Reagent(GIBCO)说明书，将重组质粒pCD-hVEGF165和空载体pcDNA3通过lipofectin介导转染兔成骨细胞，转染72h后用冷丙酮固定于玻片上15min,吹干，-20℃保存,用于免疫组化检测。
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九、免疫组化检测
采用SABC法检测人VEGF165基因的表达。I抗为鼠抗人VEGF IgG1单克隆抗体(SantaCruz)按1∶30加在玻片上，37℃反应1h后，再按1∶100加入Ⅱ抗(生物素化羊抗鼠IgG),37℃反应20min后,加入SABC37℃反应20min,PBS洗两次。最后用DAB显色,苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片、显微镜观察并摄片。以PBS代替I抗作阴性对照。
结果
一、hVEGF cDNA扩增结果
hVEGF cDNA经两轮PCR扩增后,PCR产物在1.7%琼脂糖凝胶上电泳,约在600bp及468bp处出现两条特异条带 (图1),初步表明他们可能为hVEGF165和hVEGF121 cDNA。
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1. pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Marker(657,458,434,328,289,267,174,142,102,80hp)
2.3. VEGF165(600 hp) VEGF121(468 hp) cDNA
图1 hVEGF cDNA PCR 电泳结果
二、pCD-hVEGF165重组质粒鉴定
由于在pcDNA3多克隆位点上的BamHI及EcoRI位点外侧,分别有HindⅢ及XabI酶切位点,重组质粒经HindⅢ及XabI酶切后,得到5.4kb(pcDNA3)和600余bp(插入片段)两个片段(图2)。
三、hVEGF165 cDNA鉴定
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pCD-hVEGF165用BamHI、EcoRI双酶切,将插入片段回收后用HaeⅢ酶切,得到280、160、91、69 bp四个片段。用HinfI酶切后得到210、190、114、86 bp四个片段(图3)。完全符合hVEGF165 cDNA的酶切图谱。重组质粒pCD-hVEGF165中插入片段经DNA自动测序仪测出序列与Leurg等[3]和Tischer等[4]报告的人VEGF165序列相符。
四、hVEGF165在兔成骨细胞的瞬时表达
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI Marker(21 227,5 148,4 937,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584，1 375,947,831,564)
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2.3.4.经HindⅢ及XbaⅠ酶切后得到5.4kb (载体)和600余bp(插入子)两个片段
图2重组质粒pCD-hVEGF165HindⅢXbaⅠ
酶切鉴定电泳图谱
1.pGEM-7Zf(+)/HaeⅢMarker(657,458,434,328,289,267,174,142,102,80bp)
2.HaeⅢ酶切得到280、160、91、69bp四个片段
3.HinfⅠ酶切得到210、190、114、86bp四个片段
4.未酶切的VEGF165 cDNA
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图3 VEGF cDNA酶切图谱
a 转染pcDNA3空载体的细胞未见VEGF165表达 b 转染pCD-hVEGF165质粒的细胞胞浆中见大量棕褐色颗粒,证实有VEGF165表达 c 以PBS代替I抗的阴性对照
图4 SABC法检测pCD-hVEGF165在兔成骨细胞中的表达(DAB显色，苏木素复染 ×400)
经用SABC法检测,可见转染pCD-hVEGF165的兔成骨细胞浆中充满棕褐色颗粒,证实在细胞中存在有VEGF165基因的表达产物,而转染空载体pcDNA3的兔成骨细胞胞浆中未见有VEGF165基因的表达(图4)。
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讨论
人血管内皮细胞生长因子基因位于染色体6p21.3,全长14kb,由8个外显子,7个内含子组成,编码产物为34～45kD的同源二聚体糖蛋白,由于其mRNA剪接方式不同,共有5种形成存在,即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。VEGF中研究最多的是VEGF165和VEGF121,它们以可溶性蛋白形式存在,能分泌到细胞外。VEGF通过受体flt1及KDR选择性地作用于血管内皮细胞,具有促进微静脉、小静脉通透性增加,血管内皮细胞分裂、增殖、细胞钙聚集以及诱导血管生成的作用[6,7]。
VEGF可以在正常人和动物的组织中表达,但一般水平较低;在一些代谢旺盛的组织及病理情况下如肿瘤组织等有过量表达[6]。在大多数研究中，VEGF165和VEGF121 mRNA同时表达，有时VEGF189也表达。HL60细胞是一种人白血病细胞，其VEGF mRNA表达较正常组织高，PMA是一种肿瘤刺激剂，经其刺激肿瘤细胞VEGF表达可增高[7]。我们通过巢式PCR，成功地从HL60细胞中克隆出VEGF165 cDNA。由于VEGF mRNA表达高度较低，我们在第一轮扩增后，未发现有特异的条带。用内侧一对引物进行第二轮扩增，即出现与VEGF165及VEGF121 cDNA电泳相符的600bp与468bp两条带。将600bp片段回收克隆入真核表达载体pcDNA3后，经酶切分析及cDNA序列测定，证实为VEGF165 cDNA。本实验所用的载体pcDNA3可在哺乳动物细胞中高效表达。我们用BamHI及EcoRI两种酶分别酶切pcDNA3及VEGF165 cDNA,进行粘端定向连接。目的基因被插入到pcDNA3 CMV启动子下游的BamHI及EcoRI两个位点之间,可受其调控而表达。
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由于VEGF能特异地作用于血管内皮细胞,促进血管增生,人们考虑用VEGF治疗机体缺血性疾病。Takeshita等[8]用VEGF局部给药治疗动脉阻断的动物,发现侧支循环明显增加。但是VEGF在体内半衰期短,给治疗带来很大不便,而且其价格昂贵。Tsurumi等[9]应用VEGF真核表达质粒转染兔动脉壁,发现侧支循环明显增加,血流动力学明显改善。Baumgartner等[2]已开始进行VEGF基因治疗肢体缺血性疾病的临床试验,并取得了良好的结果。
事实上,除了软骨、角膜和晶状体外,机体所有组织发育及修复均离不开血管生成。研究发现，骨组织和其他组织再生一样,依赖于血管再生。首先由毛细血管长入软骨或骨痂,形成新的微循环网；同时带入成骨细胞,形成新骨[10]。Wang等[11]研究发现,VEGF还可促进血管内皮细胞分泌胰岛素样生长因子-I(IGF-I)及内皮素-1(ET-1)刺激成骨细胞生长。我们应用构建的pCD-hVEGF165质粒,成功地转染了成骨细胞,经免疫组化证实VEGF165在成骨细胞中获得了表达,为进一步应用VEGF基因治疗骨缺血性坏死、骨缺损及骨折的修复打下了基础。
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参 考 文 献
1.Isner JM, Pieczek A， Schainfeld R， et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischaemic limb. Lancet， 1996,348:370- 374.
2.Baumgartner I, Pieczek A， Manor O， et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation， 1998,97:1114- 1123.
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3.Leurg DW, Cachianes G， Kuang WJ， et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science, 1989,246:1306- 1309.
4.Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor: multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991,266:11947- 11954.
5.Chomczynski P, Sacchi N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159.
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6.Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor /vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability,and angiogenesis. Am J Pathol, 1995,146:1029- 1039.
7.Dolecki GJ, Connolly DT. Effects of a variety of cytokines and inducing agents on vascular permeability factor mRNA levels in U937 cells. Biochem Biophys Res Commun, 1991,180:572- 578.
8.Takeshita S , Zheng LP, Brogi E, et al. Therapeutic angiogenesis:a single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J Clin Invest, 1994,93:662- 670.
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9.Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene. Circulation. 1997, 96(Suppl Ⅱ ):382- 388.
10.Streeten EA , Brandi ML. Biology of bone endothelial cells. Bone Miner, 1990,10:85- 94.
11.Wang S, Miura M, Demura H, et al. Anablic effects of 1,25- dihydroxyvitamin D3 on osteoblasts are enhanced by vascular endothelial growth factor produced by osteoblasts and by growth factors produced by endothelial cells. Endocrinology, 1997,138:2953- 2962.
收稿日期:1999-01-21, http://www.100md.com
单位：杨述华 杨操 许伟华 李进 张银钢(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院骨科)；屈伸(同济医科大学基础医学院生化教研室)
关键词：内皮细胞生长因子；血管；基因扩增；基因表达
中华骨科杂志000210
【摘要】目的获得人VEGF165cDNA并构建其真核表达载体，探讨应用血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因治疗骨科各种疾患的可行性。方法采用巢式(polymerase chain reaction,PCR)技术。从HL60细胞中扩增出人血管内皮生长因子(hVEGF165)cDNA，并将这一cDNA克隆至pcDNA3真核表达载体上，构建成为pCD-hVEGF165重组质粒。并对cDNA片段进行了限制性酶切分析及DNA测序分析。应用脂质体介导的基因转移技术将这一表达载体导入兔成骨细胞后，用链酶亲合素-生物素-酶复合物法(streptavidin-biotin-enzymecomplex，SABC)进行瞬时表达的检测。结果经酶切鉴定及基因测序证实,克隆的基因片段为人VEGF165cDNA，重组质粒pCD-hVEGF165转染成骨细胞后，免疫组化检测有VEGF表达。结论我们成功地克隆了人VEGF165基因，为进一步研究VEGF基因治疗骨缺血性坏死、骨缺损及骨折的修复打下了基础。
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Cloning of human vascular endothelial growth factor cDNA and its expression in rabbit osteoblasts
YANG Shuhua,YANG Cao, XU Weihua, et al.
(Department of Orthopaedics, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022,China)
【 Abstract】 Objective To clone VEGF gene and construct its eukaryotic expression vector for the evaluation of the possability of VEGF gene therapy in orthopedic disease. Methods Human vascular endothelial growth factor(hVEGF) cDNA was amplified by nested PCR method from the HL60 cells and cloned to expression vector pcDNA 3. The cDNA was identified by enzyme digestion and DNA sequencing. Rabbit osteoblasts were transfered with pCD-hVEGF165 plasmid by lipofectin mediated gene transfer method. The transient expression of VEGF were detected by Streptavidin-Biotin-enzyme Complex(SABC). Results The cloned cDNA was confirmed to be VEGF165 cDNA. It was observed that the expression of human VEGF gene was detected distinctly 72 h after transfering. Conclusion We successfully cloned hVEGF165 gene and construced its eukaryotic expression vector, which provided the further foundation of VEGF gene therapy for ostenecrosis,bone defeat and fracture.
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【 Key words】Endothelial growth factors； Blood vessels； Gene amplification； Gene expression
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子。近年来，应用VEGF基因治疗四肢动脉栓塞及心肌缺血性疾病已成为国内外研究热点，有些学者已开始进行临床试验[1,2]。骨组织的发育、改建、愈合均离不开血管生成。为了研究VEGF在骨科各种疾患中基因治疗的可行性，我们进行了VEGF的基因克隆、表达载体的构建及其在体外培养的成骨细胞中表达的研究。
材料与方法
一、引物设计
根据Leurg[3]和Tischer等[4]报告的人VEGF cDNA序列。我们设计了两对引物,其中P1、P2为上游引物，P3、P4为下游引物，在引物P2、P3两端通过改变碱基引入了BamHI和EcoRI两个酶切位点，用于构建真核表达质粒。
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P1:(37-56)5'-CCGGTCGGGCCTCCGAAAC-3',P2:(47-77)5'-GTTGGATCCGAAACCATGAACTTCTGCTG-3',P3:(613-642)5'-ATTGAATTCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3',P4:(669-689)5'-CTGGTGAGAGATCTGGTTCC-3'
二、细胞培养
HL60细胞(购自武汉大学典型培养物保存中心)用含体积分数为10%小牛血清RPMI-1640培养基培养，细胞处于对数生长期时加入PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)至10ng/ml，继续培养36h。
三、总RNA提取及逆转录
用异硫氰酸胍一步法提取HL60细胞总RNA[5],以Oligo(dT)12-18为引物,利用SuperscriptTM Preamplification System(GIBCO)反转录合成cDNA第一链。
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四、巢式PCR扩增VEGFcDNA
第一轮反应以反转录产物2μl为模板，以P1、P4为引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，反应总体积为50μl，循环参数为94℃×45s,50℃×50s，72℃×1min,30次循环。第二轮反应扩增取第一轮PCR产物4μl作为模板,以P2、P3为引物，反应总体积为100μl,循环参数为94℃×45s,58℃×50s,72℃×1min,35次循环。取PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。
五、pCD-hVEGF165质粒的构建
将特异PCR产物利用低溶点琼脂糖凝胶(GIBCO)电泳回收纯化后用BamHI及EcoRI(GIBCO)酶切。真核表达载体pcDNA3(同济医科大学生化教研室提供)也用BamHI及EcoRI酶切，酶切产物经酚∶氯仿抽提后用T4DNA连接酶(GIBCO)连接，连接产物转化感受态细菌HB101。挑选抗氨苄青霉素的克隆进行小量颗粒制备，用HindⅢ及XbaI(GIBCO)双酶切选取有特异cDNA片段插入的阳性重组质粒。
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六、hVEGF165 cNDA鉴定
将重组质粒大量制备，用BamHI、EcoRI酶切后回收插入pcDNA3中的cDNA，用HaeⅢ、HinfI(Promega)进行酶切鉴定。以重组质粒为模板，以pcDNA3载体T7启动子的序列为引物，应用Sanger链末端终止法，以荧光染料标记，在ABI3T3型DNA自动测序仪上测定插入cDNA的序列。
七、兔成骨细胞培养
取大耳白兔胎兔的颅骨、剪碎后I型胶原酶(Sigma)消化，用含体积分数为10%小牛血清的DMEM(GIBCO)培养基培养，传一代至六孔培养板，当细胞处于对数生长期时用于转染。
八、基因转染
参照Lipofectin Reagent(GIBCO)说明书，将重组质粒pCD-hVEGF165和空载体pcDNA3通过lipofectin介导转染兔成骨细胞，转染72h后用冷丙酮固定于玻片上15min,吹干，-20℃保存,用于免疫组化检测。
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九、免疫组化检测
采用SABC法检测人VEGF165基因的表达。I抗为鼠抗人VEGF IgG1单克隆抗体(SantaCruz)按1∶30加在玻片上，37℃反应1h后，再按1∶100加入Ⅱ抗(生物素化羊抗鼠IgG),37℃反应20min后,加入SABC37℃反应20min,PBS洗两次。最后用DAB显色,苏木素轻度复染，常规脱水、透明、封片、显微镜观察并摄片。以PBS代替I抗作阴性对照。
结果
一、hVEGF cDNA扩增结果
hVEGF cDNA经两轮PCR扩增后,PCR产物在1.7%琼脂糖凝胶上电泳,约在600bp及468bp处出现两条特异条带 (图1),初步表明他们可能为hVEGF165和hVEGF121 cDNA。
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1. pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Marker(657,458,434,328,289,267,174,142,102,80hp)
2.3. VEGF165(600 hp) VEGF121(468 hp) cDNA
图1 hVEGF cDNA PCR 电泳结果
二、pCD-hVEGF165重组质粒鉴定
由于在pcDNA3多克隆位点上的BamHI及EcoRI位点外侧,分别有HindⅢ及XabI酶切位点,重组质粒经HindⅢ及XabI酶切后,得到5.4kb(pcDNA3)和600余bp(插入片段)两个片段(图2)。
三、hVEGF165 cDNA鉴定
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pCD-hVEGF165用BamHI、EcoRI双酶切,将插入片段回收后用HaeⅢ酶切,得到280、160、91、69 bp四个片段。用HinfI酶切后得到210、190、114、86 bp四个片段(图3)。完全符合hVEGF165 cDNA的酶切图谱。重组质粒pCD-hVEGF165中插入片段经DNA自动测序仪测出序列与Leurg等[3]和Tischer等[4]报告的人VEGF165序列相符。
四、hVEGF165在兔成骨细胞的瞬时表达
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI Marker(21 227,5 148,4 937,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584，1 375,947,831,564)
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2.3.4.经HindⅢ及XbaⅠ酶切后得到5.4kb (载体)和600余bp(插入子)两个片段
图2重组质粒pCD-hVEGF165HindⅢXbaⅠ
酶切鉴定电泳图谱
1.pGEM-7Zf(+)/HaeⅢMarker(657,458,434,328,289,267,174,142,102,80bp)
2.HaeⅢ酶切得到280、160、91、69bp四个片段
3.HinfⅠ酶切得到210、190、114、86bp四个片段
4.未酶切的VEGF165 cDNA
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图3 VEGF cDNA酶切图谱
a 转染pcDNA3空载体的细胞未见VEGF165表达 b 转染pCD-hVEGF165质粒的细胞胞浆中见大量棕褐色颗粒,证实有VEGF165表达 c 以PBS代替I抗的阴性对照
图4 SABC法检测pCD-hVEGF165在兔成骨细胞中的表达(DAB显色，苏木素复染 ×400)
经用SABC法检测,可见转染pCD-hVEGF165的兔成骨细胞浆中充满棕褐色颗粒,证实在细胞中存在有VEGF165基因的表达产物,而转染空载体pcDNA3的兔成骨细胞胞浆中未见有VEGF165基因的表达(图4)。
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讨论
人血管内皮细胞生长因子基因位于染色体6p21.3,全长14kb,由8个外显子,7个内含子组成,编码产物为34～45kD的同源二聚体糖蛋白,由于其mRNA剪接方式不同,共有5种形成存在,即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。VEGF中研究最多的是VEGF165和VEGF121,它们以可溶性蛋白形式存在,能分泌到细胞外。VEGF通过受体flt1及KDR选择性地作用于血管内皮细胞,具有促进微静脉、小静脉通透性增加,血管内皮细胞分裂、增殖、细胞钙聚集以及诱导血管生成的作用[6,7]。
VEGF可以在正常人和动物的组织中表达,但一般水平较低;在一些代谢旺盛的组织及病理情况下如肿瘤组织等有过量表达[6]。在大多数研究中，VEGF165和VEGF121 mRNA同时表达，有时VEGF189也表达。HL60细胞是一种人白血病细胞，其VEGF mRNA表达较正常组织高，PMA是一种肿瘤刺激剂，经其刺激肿瘤细胞VEGF表达可增高[7]。我们通过巢式PCR，成功地从HL60细胞中克隆出VEGF165 cDNA。由于VEGF mRNA表达高度较低，我们在第一轮扩增后，未发现有特异的条带。用内侧一对引物进行第二轮扩增，即出现与VEGF165及VEGF121 cDNA电泳相符的600bp与468bp两条带。将600bp片段回收克隆入真核表达载体pcDNA3后，经酶切分析及cDNA序列测定，证实为VEGF165 cDNA。本实验所用的载体pcDNA3可在哺乳动物细胞中高效表达。我们用BamHI及EcoRI两种酶分别酶切pcDNA3及VEGF165 cDNA,进行粘端定向连接。目的基因被插入到pcDNA3 CMV启动子下游的BamHI及EcoRI两个位点之间,可受其调控而表达。
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由于VEGF能特异地作用于血管内皮细胞,促进血管增生,人们考虑用VEGF治疗机体缺血性疾病。Takeshita等[8]用VEGF局部给药治疗动脉阻断的动物,发现侧支循环明显增加。但是VEGF在体内半衰期短,给治疗带来很大不便,而且其价格昂贵。Tsurumi等[9]应用VEGF真核表达质粒转染兔动脉壁,发现侧支循环明显增加,血流动力学明显改善。Baumgartner等[2]已开始进行VEGF基因治疗肢体缺血性疾病的临床试验,并取得了良好的结果。
事实上,除了软骨、角膜和晶状体外,机体所有组织发育及修复均离不开血管生成。研究发现，骨组织和其他组织再生一样,依赖于血管再生。首先由毛细血管长入软骨或骨痂,形成新的微循环网；同时带入成骨细胞,形成新骨[10]。Wang等[11]研究发现,VEGF还可促进血管内皮细胞分泌胰岛素样生长因子-I(IGF-I)及内皮素-1(ET-1)刺激成骨细胞生长。我们应用构建的pCD-hVEGF165质粒,成功地转染了成骨细胞,经免疫组化证实VEGF165在成骨细胞中获得了表达,为进一步应用VEGF基因治疗骨缺血性坏死、骨缺损及骨折的修复打下了基础。
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参 考 文 献
1.Isner JM, Pieczek A， Schainfeld R， et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischaemic limb. Lancet， 1996,348:370- 374.
2.Baumgartner I, Pieczek A， Manor O， et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation， 1998,97:1114- 1123.
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3.Leurg DW, Cachianes G， Kuang WJ， et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science, 1989,246:1306- 1309.
4.Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor: multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991,266:11947- 11954.
5.Chomczynski P, Sacchi N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159.
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6.Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor /vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability,and angiogenesis. Am J Pathol, 1995,146:1029- 1039.
7.Dolecki GJ, Connolly DT. Effects of a variety of cytokines and inducing agents on vascular permeability factor mRNA levels in U937 cells. Biochem Biophys Res Commun, 1991,180:572- 578.
8.Takeshita S , Zheng LP, Brogi E, et al. Therapeutic angiogenesis:a single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J Clin Invest, 1994,93:662- 670.
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9.Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene. Circulation. 1997, 96(Suppl Ⅱ ):382- 388.
10.Streeten EA , Brandi ML. Biology of bone endothelial cells. Bone Miner, 1990,10:85- 94.
11.Wang S, Miura M, Demura H, et al. Anablic effects of 1,25- dihydroxyvitamin D3 on osteoblasts are enhanced by vascular endothelial growth factor produced by osteoblasts and by growth factors produced by endothelial cells. Endocrinology, 1997,138:2953- 2962.
收稿日期:1999-01-21, http://www.100md.com