结石性胆囊胆汁厌氧菌的检测
作者：卢云 石景森 卓健生
单位：卢云(青岛大学医学院附属医院普外科，山东 青岛 266003)；石景森(西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室，陕西 西安 710061)；卓健生(西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室，陕西 西安 710061)
关键词：胆结石/微生物学；胆汁/微生物学；细菌；厌氧/分离和提纯
中国普通外科杂志000211 摘 要：目的 探讨不同种类厌氧菌在结石性胆囊胆汁中的分布及其临床价值。方法 对67例结石性胆囊胆汁进行厌氧菌培养和自动检测分析。结果 各型厌氧菌的总检出率为55.2%(37/67)，厌氧菌株主要以脆弱类杆菌为主，4例为专性厌氧。结论 胆囊结石的形成可能与厌氧菌感染存在联系；专性厌氧菌感染具有病史长，抗菌治疗效果差的特点。
分类号：R575.62；Q592.9 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1005-6947(2000)02-0129-03
Detection of bile anaerobic bacteria in patients with gallstone
LU Yun
(Department of General Surgery, The Affiliated Hospital Qingdao Medical College, Qingdao University, Qingdao, Shandong 266003, China)
SHI Jing-sen, ZHUO Jian-sheng
(Department of Hepatobiliary Surgery Research, The First Affiliated Hospital, Xi'an Medical University, Xi'an 710061, China)
, http://www.100md.com
Abstract：Objective To detect bile anaerobic bacteria and their actiones in patients with gallstone. Methods Anaerobic bile culture was done by automatic detection system in 67 gallstone patients with cholecystectomy. Results The ratio of positive anaerobic bacteria culture was 55.2%(37/67), including 4 patients with obligate anaerobe bile culture positive only. B.fragilis was the main kind of anaerobic bacteria in bile. Conclusions There may have some connection between anaerobic infection and gallstone formation. The patients with obligate anaerobic bacteria positive only have a long term history of chronic cholecystitis and display no improvement of the clinical symptoms by antimicrobile treatments.
, http://www.100md.com
Key words：CHOLELITHIASIS/microbiol；BILE/microbiol；BACTERIA,ANAEROBIC/isol▲
近年来随着厌氧培养技术的发展，厌氧菌在外科感染中的作用日益受到人们的重视。据报道外科感染中厌氧、需氧菌检出比为1.1∶1[1]，说明厌氧感染已达到与需氧菌同等重要地位。但有关胆道厌氧菌感染，尤其是结石 性胆囊胆汁厌氧菌的检测报道甚少。作者对两院67例胆囊结石患者于术中行胆囊穿刺胆汁厌氧培养，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
因胆囊 结石行胆囊切除术患者67例，男21例， 女46例。年龄18～70岁，平均42岁。 其中胆固醇混合性结石48例，胆色素混合性结石19例。
, http://www.100md.com 1.2 实验仪器
BacT/Alert 120微生物检测系统(包括恒温震荡连续检测自动培养仪及数据管理系统)：美国ORGANON TEKNIKA公司产品。SCEPTOR微生物鉴定系统(包括微生物鉴定药敏自动检测仪及数据管理系统)：美国BECION DICKINSON公司产品。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 术中采用一次性无菌注射器穿刺病变胆囊，取胆汁5～10ml，1min内注入BacT/Aler厌氧增菌瓶。
1.3.2 增菌 将厌氧增菌瓶放入BacT/Alert恒温震荡培养箱自动培养1～6d，底部感应器显示为阳性者根据其微生物生长曲线，于对数生长期取出做转种；培养6d仍为阴性者，视为厌氧菌阴性。
1.3.3 培养及鉴定 快速接种到厌氧琼脂板上后，置厌氧罐孵育，48h后取出，制备108/ml标准厌氧菌菌悬液，取10μl放入10ml增菌管内，转种到SCEPTOR厌氧板。厌氧培养48h后，直接在SCEPTOR微生物鉴定仪中确定厌氧菌种。
, 百拇医药
本组所有病例厌氧培养同时行胆汁需氧菌培养。
2 结 果
2.1 培养结果
67例结石性胆囊胆汁中单纯分离到厌氧菌4例(6.0%)，单纯分离出需氧菌14例(20.9%)，同时分离到厌氧、需氧菌者33例(49.3%)。累积计算，厌氧菌阳性检出率为55.2%(37/67)，需氧菌为70.1%(47/67)；细菌总检出率76.1%(51/67)。
67例厌氧培养共分离到厌氧菌42株，分归8个菌属，其中脆弱类杆菌(B.fragilis)占厌氧菌株的40.5%(17/42)(附表)。
附表 67例胆结石相应胆汁细菌菌株培养鉴定结果 厌氧菌
株数
, 百拇医药
需氧菌
株数
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阴性杆菌
脆弱类杆菌
17
大肠埃希氏菌
22
变形梭杆菌
3
肺炎克雷白菌
4
革兰氏阳性杆菌
, 百拇医药
鼻臭克雷白菌
2
痤疮丙酸杆菌
4
费氏枸盐酸杆菌
2
贪婪丙酸杆菌
2
绿脓假单胞菌
2
颗粒丙酸杆菌
2
变形杆菌
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6
艰难梭菌
2
哈夫尼亚杆菌
2
产气荚膜梭菌
5
产气肠杆菌
1
放线杆菌
1
革兰氏阳性球菌
革兰氏阴性球菌
, 百拇医药
金黄色葡萄球菌
7
小韦荣氏球菌
1
肠球菌
1
革兰氏阳性球菌
粪链球菌
5
厌氧消化链球菌
2
厌氧性链球菌
2
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黑色消化球菌
1
合计
42
合计
54
2.2 结石类型与细菌定性分析
48例胆固醇为主的混合性结石患者中胆汁厌氧菌阳性者21例次(43.8%)，需氧菌阳性者29例次(60.4%)；19例胆色素为主混合性结石中厌氧菌阳性者16例次(84.2%)，需氧菌阳性者18例次(94.7%)。
3 讨 论
正常人胆汁是无菌的，尤其是胆囊胆汁。胆道厌氧菌多来自胃肠道的内源性感染，由于是条件致病菌，只有在胆道需氧菌感染严重，机体免疫力降低，厌氧菌获得适当生长环境时才能繁殖生长，故厌氧菌感染绝大多数并发需氧菌感染，本组为76.1%(33/51)。二者互相作用使胆道感染加重，增加了其复杂性及难治性[2]。
, 百拇医药
本组需氧菌株主要以大肠杆菌及肠球菌为主，二者对胆汁的耐受性较强，一旦侵入胆系，易于存活形成炎症，继而与细菌抗体复合物等可初步形成胆石核心。同时这些细菌可产生β葡萄糖醛酸酶，使胆汁内可溶性葡萄糖醛酸胆红素转变为葡萄糖醛酸和不溶性胆红素，也构成了胆石的核心成分。厌氧菌在胆色素结石形成中的作用主要是由于脆弱类杆菌、梭形杆菌等厌氧菌可产生与大肠杆菌相同的β葡萄糖醛酸酶，从而分解结合胆红素后，与钙等金属离子结合形成胆红素结石[3]。本组胆色素混合性结石中厌氧菌阳性率高达84.2%，也验证了这一点。细菌与胆固醇结石形成的联系也日益受到重视[4]，人们通过聚合酶链反应等方法证实胆固醇结石核心有细菌DNA存在，特别是存在痤疮丙酸杆菌等厌氧菌DNA。本组中4株痤疮丙酸杆菌的检出，同胆固醇结石厌氧菌DNA结果相吻合，为厌氧菌在胆固醇结石形成中的作用提供了一定的依据，但有待于进一步的探讨。
厌氧菌培养过去多采用忍天青液增菌瓶送检，操作复杂且标本触氧时间较长。本组采用厌氧增 菌瓶术中直接注入法，触氧时间不到30s。 同时根据厌氧菌自动生长曲线的4个生长时期即迟缓期、对数生长期、稳定期和衰退期进行培养，在其生长最旺盛的对数生长期进行转种，可提高阳性培养率。本组观察该期时间多集中于增菌后6～24h内，此时尽管多数增菌瓶仍保持较清亮状态，但细菌培养阳性率高达95%。同时由于对厌氧菌株采用微生物鉴定仪自动读板鉴定，避免了使用API20/10系统所导致的系统误差。本组培养出4株专性厌氧菌，每株均通过2次需氧实验证实，该4例胆石病人有两个共同特点：一是均有慢性胆囊炎病史，病程均在2年以上；二是都曾经多种抗生素治疗，疗效均不显著。Jackaman[5]对73份胆汁行厌氧培养，仅1例专性厌氧，估计与当时的技术有关。本组曾对10份厌氧阳性的胆汁同时采用无氧忍天青增菌瓶方法进行培养，结果仅6例培养阳性。作者认为随着厌氧培养技术的改进、胆汁厌氧菌谱研究的深入，厌氧菌在胆道系统所起的作用会逐渐被揭示。■
, 百拇医药
作者简介：卢云(1969-)，男，山东禹城人，青岛大学医学院附属医院主治医师，博士，从事胆石成因及胆道肿瘤方面研究。
参考文献：
[1]黎沾良.国内外科10年感染变迁及对策[J].实用外科杂志，1991，11(7)：408～409.
[2]石景森，邱随民，刘绍诰，等.胆汁中结合胆汁酸的高压液相色谱定量分析[J].中华实验外科杂志，1990，7(4)：178～179.
[3]Tabata. Bacteria and gallstone[J].Dig Dis Sic, 1981,26(4):218～220.
[4]Swidsinski A, Khilkin M, Pahlig H, et al. Time dependent changes in the concentration and bacterial sequences found in cholesterol gallstone[J].Hepatology, 1998,27(4):662～665.
[5]Jackaman FR. Bile bacteria in patients with benign bile duct stricture[J].Br J Surg, 1980,67(6):320～330.
收稿日期：1999-02-21
修稿日期：2000-02-17, http://www.100md.com
单位：卢云(青岛大学医学院附属医院普外科，山东 青岛 266003)；石景森(西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室，陕西 西安 710061)；卓健生(西安医科大学第一附属医院肝胆外科研究室，陕西 西安 710061)
关键词：胆结石/微生物学；胆汁/微生物学；细菌；厌氧/分离和提纯
中国普通外科杂志000211 摘 要：目的 探讨不同种类厌氧菌在结石性胆囊胆汁中的分布及其临床价值。方法 对67例结石性胆囊胆汁进行厌氧菌培养和自动检测分析。结果 各型厌氧菌的总检出率为55.2%(37/67)，厌氧菌株主要以脆弱类杆菌为主，4例为专性厌氧。结论 胆囊结石的形成可能与厌氧菌感染存在联系；专性厌氧菌感染具有病史长，抗菌治疗效果差的特点。
分类号：R575.62；Q592.9 文献标识码：A
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文章编号：1005-6947(2000)02-0129-03
Detection of bile anaerobic bacteria in patients with gallstone
LU Yun
(Department of General Surgery, The Affiliated Hospital Qingdao Medical College, Qingdao University, Qingdao, Shandong 266003, China)
SHI Jing-sen, ZHUO Jian-sheng
(Department of Hepatobiliary Surgery Research, The First Affiliated Hospital, Xi'an Medical University, Xi'an 710061, China)
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Abstract：Objective To detect bile anaerobic bacteria and their actiones in patients with gallstone. Methods Anaerobic bile culture was done by automatic detection system in 67 gallstone patients with cholecystectomy. Results The ratio of positive anaerobic bacteria culture was 55.2%(37/67), including 4 patients with obligate anaerobe bile culture positive only. B.fragilis was the main kind of anaerobic bacteria in bile. Conclusions There may have some connection between anaerobic infection and gallstone formation. The patients with obligate anaerobic bacteria positive only have a long term history of chronic cholecystitis and display no improvement of the clinical symptoms by antimicrobile treatments.
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Key words：CHOLELITHIASIS/microbiol；BILE/microbiol；BACTERIA,ANAEROBIC/isol▲
近年来随着厌氧培养技术的发展，厌氧菌在外科感染中的作用日益受到人们的重视。据报道外科感染中厌氧、需氧菌检出比为1.1∶1[1]，说明厌氧感染已达到与需氧菌同等重要地位。但有关胆道厌氧菌感染，尤其是结石 性胆囊胆汁厌氧菌的检测报道甚少。作者对两院67例胆囊结石患者于术中行胆囊穿刺胆汁厌氧培养，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
因胆囊 结石行胆囊切除术患者67例，男21例， 女46例。年龄18～70岁，平均42岁。 其中胆固醇混合性结石48例，胆色素混合性结石19例。
, http://www.100md.com 1.2 实验仪器
BacT/Alert 120微生物检测系统(包括恒温震荡连续检测自动培养仪及数据管理系统)：美国ORGANON TEKNIKA公司产品。SCEPTOR微生物鉴定系统(包括微生物鉴定药敏自动检测仪及数据管理系统)：美国BECION DICKINSON公司产品。
1.3 方法
1.3.1 标本采集 术中采用一次性无菌注射器穿刺病变胆囊，取胆汁5～10ml，1min内注入BacT/Aler厌氧增菌瓶。
1.3.2 增菌 将厌氧增菌瓶放入BacT/Alert恒温震荡培养箱自动培养1～6d，底部感应器显示为阳性者根据其微生物生长曲线，于对数生长期取出做转种；培养6d仍为阴性者，视为厌氧菌阴性。
1.3.3 培养及鉴定 快速接种到厌氧琼脂板上后，置厌氧罐孵育，48h后取出，制备108/ml标准厌氧菌菌悬液，取10μl放入10ml增菌管内，转种到SCEPTOR厌氧板。厌氧培养48h后，直接在SCEPTOR微生物鉴定仪中确定厌氧菌种。
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本组所有病例厌氧培养同时行胆汁需氧菌培养。
2 结 果
2.1 培养结果
67例结石性胆囊胆汁中单纯分离到厌氧菌4例(6.0%)，单纯分离出需氧菌14例(20.9%)，同时分离到厌氧、需氧菌者33例(49.3%)。累积计算，厌氧菌阳性检出率为55.2%(37/67)，需氧菌为70.1%(47/67)；细菌总检出率76.1%(51/67)。
67例厌氧培养共分离到厌氧菌42株，分归8个菌属，其中脆弱类杆菌(B.fragilis)占厌氧菌株的40.5%(17/42)(附表)。
附表 67例胆结石相应胆汁细菌菌株培养鉴定结果 厌氧菌
株数
, 百拇医药
需氧菌
株数
革兰氏阴性杆菌
革兰氏阴性杆菌
脆弱类杆菌
17
大肠埃希氏菌
22
变形梭杆菌
3
肺炎克雷白菌
4
革兰氏阳性杆菌
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鼻臭克雷白菌
2
痤疮丙酸杆菌
4
费氏枸盐酸杆菌
2
贪婪丙酸杆菌
2
绿脓假单胞菌
2
颗粒丙酸杆菌
2
变形杆菌
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6
艰难梭菌
2
哈夫尼亚杆菌
2
产气荚膜梭菌
5
产气肠杆菌
1
放线杆菌
1
革兰氏阳性球菌
革兰氏阴性球菌
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金黄色葡萄球菌
7
小韦荣氏球菌
1
肠球菌
1
革兰氏阳性球菌
粪链球菌
5
厌氧消化链球菌
2
厌氧性链球菌
2
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黑色消化球菌
1
合计
42
合计
54
2.2 结石类型与细菌定性分析
48例胆固醇为主的混合性结石患者中胆汁厌氧菌阳性者21例次(43.8%)，需氧菌阳性者29例次(60.4%)；19例胆色素为主混合性结石中厌氧菌阳性者16例次(84.2%)，需氧菌阳性者18例次(94.7%)。
3 讨 论
正常人胆汁是无菌的，尤其是胆囊胆汁。胆道厌氧菌多来自胃肠道的内源性感染，由于是条件致病菌，只有在胆道需氧菌感染严重，机体免疫力降低，厌氧菌获得适当生长环境时才能繁殖生长，故厌氧菌感染绝大多数并发需氧菌感染，本组为76.1%(33/51)。二者互相作用使胆道感染加重，增加了其复杂性及难治性[2]。
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本组需氧菌株主要以大肠杆菌及肠球菌为主，二者对胆汁的耐受性较强，一旦侵入胆系，易于存活形成炎症，继而与细菌抗体复合物等可初步形成胆石核心。同时这些细菌可产生β葡萄糖醛酸酶，使胆汁内可溶性葡萄糖醛酸胆红素转变为葡萄糖醛酸和不溶性胆红素，也构成了胆石的核心成分。厌氧菌在胆色素结石形成中的作用主要是由于脆弱类杆菌、梭形杆菌等厌氧菌可产生与大肠杆菌相同的β葡萄糖醛酸酶，从而分解结合胆红素后，与钙等金属离子结合形成胆红素结石[3]。本组胆色素混合性结石中厌氧菌阳性率高达84.2%，也验证了这一点。细菌与胆固醇结石形成的联系也日益受到重视[4]，人们通过聚合酶链反应等方法证实胆固醇结石核心有细菌DNA存在，特别是存在痤疮丙酸杆菌等厌氧菌DNA。本组中4株痤疮丙酸杆菌的检出，同胆固醇结石厌氧菌DNA结果相吻合，为厌氧菌在胆固醇结石形成中的作用提供了一定的依据，但有待于进一步的探讨。
厌氧菌培养过去多采用忍天青液增菌瓶送检，操作复杂且标本触氧时间较长。本组采用厌氧增 菌瓶术中直接注入法，触氧时间不到30s。 同时根据厌氧菌自动生长曲线的4个生长时期即迟缓期、对数生长期、稳定期和衰退期进行培养，在其生长最旺盛的对数生长期进行转种，可提高阳性培养率。本组观察该期时间多集中于增菌后6～24h内，此时尽管多数增菌瓶仍保持较清亮状态，但细菌培养阳性率高达95%。同时由于对厌氧菌株采用微生物鉴定仪自动读板鉴定，避免了使用API20/10系统所导致的系统误差。本组培养出4株专性厌氧菌，每株均通过2次需氧实验证实，该4例胆石病人有两个共同特点：一是均有慢性胆囊炎病史，病程均在2年以上；二是都曾经多种抗生素治疗，疗效均不显著。Jackaman[5]对73份胆汁行厌氧培养，仅1例专性厌氧，估计与当时的技术有关。本组曾对10份厌氧阳性的胆汁同时采用无氧忍天青增菌瓶方法进行培养，结果仅6例培养阳性。作者认为随着厌氧培养技术的改进、胆汁厌氧菌谱研究的深入，厌氧菌在胆道系统所起的作用会逐渐被揭示。■
, 百拇医药
作者简介：卢云(1969-)，男，山东禹城人，青岛大学医学院附属医院主治医师，博士，从事胆石成因及胆道肿瘤方面研究。
参考文献：
[1]黎沾良.国内外科10年感染变迁及对策[J].实用外科杂志，1991，11(7)：408～409.
[2]石景森，邱随民，刘绍诰，等.胆汁中结合胆汁酸的高压液相色谱定量分析[J].中华实验外科杂志，1990，7(4)：178～179.
[3]Tabata. Bacteria and gallstone[J].Dig Dis Sic, 1981,26(4):218～220.
[4]Swidsinski A, Khilkin M, Pahlig H, et al. Time dependent changes in the concentration and bacterial sequences found in cholesterol gallstone[J].Hepatology, 1998,27(4):662～665.
[5]Jackaman FR. Bile bacteria in patients with benign bile duct stricture[J].Br J Surg, 1980,67(6):320～330.
收稿日期：1999-02-21
修稿日期：2000-02-17, http://www.100md.com