钩端螺旋体L型的鉴定
作者：宋秀宇 林特夫 张树波
单位：宋秀宇 林特夫(安徽省蚌埠医学院微生物学教研室233003)；张树波(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所北京102206)
关键词：钩端螺旋体L型；电镜；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；斑点免疫结合试验
淮海医药000201
【摘 要】 目的 为鉴定钩端螺旋体L型菌株。方法 用电镜检查、SDS-PAGE及斑点免疫结合试验(DIBA)鉴定一株自钩体脑动脉炎患者血及脑脊液标本中分离到菌株。结果 电镜显示该菌株细胞壁有缺陷，形态呈多形性，SDS-PAGE显示该菌株表达的蛋白质带型与钩体的相似，缺失了部分条带，无新的蛋白带出现；DIBA显示该菌株弱阳性。结论 多种方法均鉴定该菌株为钩端螺旋体L型。
【中国图书分类号】 R 446
, 百拇医药
Identification of Leptospira L-form
SONG Xiuyu，LIN Tefu，ZHANG Shubo
(Department of Micobioloy，Bengbu Medical College，Anhui 233003)
【Abstract】 Objective To identify the leptospira L-form.Methods The organism isolated from blood and spinal fluid of patients with cerebral arteritis was tested by electron microscopy，SDS-PAGE and DIBA.Results The organism under electron microscopy shown to be deficient in cell wall and polymorphic.The bands of the organism were similar to that of the Leptospira in SDS-PAGE.The organism was positive weakly in DIBA .Conclusion The organism was identified as Leptospira L-form by the multiple methods.
, 百拇医药
【Key words】 Leptospira L-form Electron micoscopy SDS-PAGE DIBA
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是目前常规的快速检测蛋白质的方法，可以测定微生物的蛋白质的基本概况[1、2]。斑点免疫结合试验(Dot immunobinding assay，DIBA)测定则是80年代中期从ELISA这种固项酶免疫测定法发展来的较简单的方法。我们将这两种方法结合电镜检查测定一株自临床钩体病神经系统后发症(钩体脑动脉炎)患者血及脑脊液标本中分离到菌株。
1 材料与方法
1.1 SDS-PAGE
1.1.1 待测菌株 疑为钩体L型的菌株[3](本室从1例脑动脉炎患者血及脑脊液中分离)。对照标准钩体菌株为黄疸出血群赖型(56601)，波摩那群波摩那型(56608)购自北京中国药品生物制品检定所。
, 百拇医药
1.1.2 主要试剂及仪器 丙烯酰胺，N，N，-亚甲双丙烯酰胺，考马斯亮蓝R 250、TEMED及SDS均为Sigma产品，2-巯酚蓝(上海化学试剂总厂)，中低分子量标准蛋白(上海生化所)，甘氨酸，Tris，过硫酸胺和硝酸银(北京化工厂)。
1.1.3 菌株处理 待测钩体L型菌株因常规方法处理不易裂解，故将其菌落置研钵内，加适量玻璃砂(0.22 mm，荷兰Ieidan大学)和2倍标本缓冲液研磨数小时，收集菌液于离心管内，5 000 rpm/min离心5 min，吸取上清液即可或将上清液再进行37℃～-70℃反复冻融10次处理；钩体56601和56608株则仅经反复冻融处理。
1.1.4 SDS-PAGE[1、2] ①电泳条件：11%分离胶，5%浓缩胶，垂直板下不连续缓冲系统电泳，电泳液为pH 8.3的Tris-甘氨酸系统，加样后50 V稳压过夜。②染色：电泳完毕后，卸胶用考马斯亮蓝R 250或银盐染色，最后用脱色液脱色至条带消晰。
, 百拇医药
1.2 DIBA
1.2.1 菌株 待测钩体L型菌株及56601株同上，大肠杆菌、霍乱弧菌、鼠伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌(北京流行病学研究所腹泻病室保存)。
1.2.2 主要试剂及仪器 硝酸纤维素膜(NC膜，0.45 μm)和酶标SPA系Sigma产品，明胶，4-氯-1-奈酚(Promega)，56601兔血清(北京中国药品生物制品检定所)。
1.2.3 DIBA[4、5] ①点膜：将菌液(109个菌/ml)5 ml及菌落点于NC膜上，置37℃干燥15 min后置于含5 ml 0.5 N HCL的平皿中作用30 min，并用蒸馏水洗去肉眼可见的菌落。②封闭：3%明胶封闭2 h，TBS-Tween20洗涤3次，每次5 min。③加入1∶200稀释的抗56601兔血清，室温慢摇2 h，同上洗涤。④加入1∶200稀释的酶标SPA，室温慢摇2 h，同上洗涤。⑤加入酶底物溶液(6 mg 4-氯-1-奈酚+2 ml -20℃冷甲醇+10 mlTRS+6 ml 30%H2O2)室温下慢摇至膜上出现紫蓝色斑点，蒸馏水充分洗涤终止显色，滤纸吸干。
, 百拇医药
1.3 电镜检查 待测菌株经2.5%戊二醛固定后送上海第二医科大学做扫描电镜和透射电镜检查。
2 结果
2.1 SDS-PAGE 两种染色以银盐色效果好，56601和56608株蛋白带型相似，只是两者的蛋白带染色有深浅之别。待测菌株与56601及56608株相比，表达出蛋白带型相似，但缺失了许多蛋白带，如缺失了分子量约为9×104、6×104、17.5×103的蛋白带出现。
2.2 DIBA 钩体56601呈强阳性(深紫色)斑点，待测菌株的菌落呈弱阳性(浅紫蓝色)斑点，待测菌株的菌液及大肠杆菌、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏痢疾杆菌的菌落和菌液均呈阴性(无色)斑点。
2.3 电镜 透射电镜显示待测菌株细胞壁缺陷(图1)，扫描电镜显示待测菌株呈多形性，菌体仍有螺旋并且末端呈钩状(图2)。
, 百拇医药
图1 透射电镜显示钩端螺旋体L型细胞壁缺陷。
图2 扫描电镜显示钩端螺旋体L型呈多形性，菌体有螺旋，末端呈钩状。
3 讨论
Browm等在分析含赛罗群、波摩那群、黄疸出血群、流感伤寒群和犬群的五价疫苗中各菌株的蛋白抗原体时，发现5株无论是全细胞溶解片段还是去垢剂溶解片段的蛋白条带均相似，仅量有所下降，他将这几株与兔抗赛罗群哈焦型的血清进行免疫印迹分析，证实在这几个不同血清群间广泛存在着共同抗原，我们在SDS-PAGE中也证实钩体黄疸出血群赖型(56601)和波摩那群波摩那型(56608)的蛋白带型相似，两者各条带的蛋白质仅量有所不同。从临床分离的待测钩体L型所表达出的蛋白带与前两者的蛋白质带型相似，提示该菌株确实是钩体，仅缺失了部分条带，这可能与缺失细胞壁有关。由于细胞壁发生缺陷，其许多生物学性状改变。如形态呈多形性，显微镜凝集试验(MAT)呈阴性[3、6]，致使鉴定有困难。用SDS-PAGE电泳主要分析的是蛋白质抗原。可以确定待测菌株是否是钩体，若可靠地区别其群型尚需对钩体的DNA进行分析。
, 百拇医药
许多细菌发生L型变异后，细胞膜代偿性增厚。我们在处理该钩体L型菌株时，曾用多种方法加以破膜：①SDS。②超声波。③组织研磨器研磨。④酸碱处理。⑤37℃～-70℃反复冻融10次。⑥0.22 mm玻璃砂研磨。⑦玻璃砂研磨后再冻融。待测钩体L型菌株用玻璃砂研磨后再冻融的方法才成功破膜，而钩体原型56601和56608株经反复冻融或超声波处理均可破膜，这证实了钩体发生L型变异后，虽细胞壁发生缺陷，但细胞膜却可能增厚致使破膜困难。现已经超薄切片计算机图像分析证实该待测钩体L型菌株与钩体56608原型细胞膜厚度(50个点的均值)之比为45.07∶15.60，P<0.001[7]，表明该钩体变为L型后，细胞膜确实明显增厚，这可能是该菌株在体内能长期存活而致病的原因之一。
DIBA用于钩体病的诊断已有报道，我们用DI-BA常规法检测钩体L型，该待测钩体L型菌株与钩体抗血清未见阳性反应。用酸预先处理后，菌液仍无反应，可能系菌量太少，而菌落则有弱阳性反应，这一方面证实该菌株是钩体L型，另一方面说明L型变异后，抗原性有所减弱。
, http://www.100md.com
电镜显示该钩体L型菌株虽然菌体呈螺旋状并且末端呈钩状，但由于细胞壁缺陷，所以呈多形性，形态上与原菌有很大差异，需要采用其它方法来鉴定。
本课题获卫生部科学研究基金资助[91108049]
参 考 文 献
1，周本正.各类电泳技术.周本正，主编.实用电泳及免疫电泳技术.武汉：湖北科学技术出版社，1989：15～183
2，金冬雁，黎梦枫，译.克隆化基因所表达蛋白质的检测与分析.见：Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，主编.分子克隆实验指南，第2版.北京：科学出版社，1992：852～904
3，宋秀宇，林特夫.免疫荧光和免疫酶技术鉴定钩端螺旋体L型.中华流行病学杂志，1993，14(11)：52
4，张明杰.单克隆抗体的筛选与检测.见：徐志凯主编.实用单克隆抗体.西安：陕西科学出版社，1992：42～62
5，林 涛，时曼华，聂一新，等.酶免疫斑点试验用于钩端螺旋体早期血清学诊断的研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(2A)：4
6，宋秀宇，唐素兰，林特夫，等.临床标本中钩端螺旋体及其L型的检测与鉴定.中国人兽共患病杂志，1999，15(5)：33
7，林特夫，宋秀宇，唐素兰，等.钩端螺旋体L型形态与超微结构的研究.中华微生物学与免疫学杂志，1997，17(3)：192, 百拇医药
单位：宋秀宇 林特夫(安徽省蚌埠医学院微生物学教研室233003)；张树波(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所北京102206)
关键词：钩端螺旋体L型；电镜；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；斑点免疫结合试验
淮海医药000201
【摘 要】 目的 为鉴定钩端螺旋体L型菌株。方法 用电镜检查、SDS-PAGE及斑点免疫结合试验(DIBA)鉴定一株自钩体脑动脉炎患者血及脑脊液标本中分离到菌株。结果 电镜显示该菌株细胞壁有缺陷，形态呈多形性，SDS-PAGE显示该菌株表达的蛋白质带型与钩体的相似，缺失了部分条带，无新的蛋白带出现；DIBA显示该菌株弱阳性。结论 多种方法均鉴定该菌株为钩端螺旋体L型。
【中国图书分类号】 R 446
, 百拇医药
Identification of Leptospira L-form
SONG Xiuyu，LIN Tefu，ZHANG Shubo
(Department of Micobioloy，Bengbu Medical College，Anhui 233003)
【Abstract】 Objective To identify the leptospira L-form.Methods The organism isolated from blood and spinal fluid of patients with cerebral arteritis was tested by electron microscopy，SDS-PAGE and DIBA.Results The organism under electron microscopy shown to be deficient in cell wall and polymorphic.The bands of the organism were similar to that of the Leptospira in SDS-PAGE.The organism was positive weakly in DIBA .Conclusion The organism was identified as Leptospira L-form by the multiple methods.
, 百拇医药
【Key words】 Leptospira L-form Electron micoscopy SDS-PAGE DIBA
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是目前常规的快速检测蛋白质的方法，可以测定微生物的蛋白质的基本概况[1、2]。斑点免疫结合试验(Dot immunobinding assay，DIBA)测定则是80年代中期从ELISA这种固项酶免疫测定法发展来的较简单的方法。我们将这两种方法结合电镜检查测定一株自临床钩体病神经系统后发症(钩体脑动脉炎)患者血及脑脊液标本中分离到菌株。
1 材料与方法
1.1 SDS-PAGE
1.1.1 待测菌株 疑为钩体L型的菌株[3](本室从1例脑动脉炎患者血及脑脊液中分离)。对照标准钩体菌株为黄疸出血群赖型(56601)，波摩那群波摩那型(56608)购自北京中国药品生物制品检定所。
, 百拇医药
1.1.2 主要试剂及仪器 丙烯酰胺，N，N，-亚甲双丙烯酰胺，考马斯亮蓝R 250、TEMED及SDS均为Sigma产品，2-巯酚蓝(上海化学试剂总厂)，中低分子量标准蛋白(上海生化所)，甘氨酸，Tris，过硫酸胺和硝酸银(北京化工厂)。
1.1.3 菌株处理 待测钩体L型菌株因常规方法处理不易裂解，故将其菌落置研钵内，加适量玻璃砂(0.22 mm，荷兰Ieidan大学)和2倍标本缓冲液研磨数小时，收集菌液于离心管内，5 000 rpm/min离心5 min，吸取上清液即可或将上清液再进行37℃～-70℃反复冻融10次处理；钩体56601和56608株则仅经反复冻融处理。
1.1.4 SDS-PAGE[1、2] ①电泳条件：11%分离胶，5%浓缩胶，垂直板下不连续缓冲系统电泳，电泳液为pH 8.3的Tris-甘氨酸系统，加样后50 V稳压过夜。②染色：电泳完毕后，卸胶用考马斯亮蓝R 250或银盐染色，最后用脱色液脱色至条带消晰。
, 百拇医药
1.2 DIBA
1.2.1 菌株 待测钩体L型菌株及56601株同上，大肠杆菌、霍乱弧菌、鼠伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌(北京流行病学研究所腹泻病室保存)。
1.2.2 主要试剂及仪器 硝酸纤维素膜(NC膜，0.45 μm)和酶标SPA系Sigma产品，明胶，4-氯-1-奈酚(Promega)，56601兔血清(北京中国药品生物制品检定所)。
1.2.3 DIBA[4、5] ①点膜：将菌液(109个菌/ml)5 ml及菌落点于NC膜上，置37℃干燥15 min后置于含5 ml 0.5 N HCL的平皿中作用30 min，并用蒸馏水洗去肉眼可见的菌落。②封闭：3%明胶封闭2 h，TBS-Tween20洗涤3次，每次5 min。③加入1∶200稀释的抗56601兔血清，室温慢摇2 h，同上洗涤。④加入1∶200稀释的酶标SPA，室温慢摇2 h，同上洗涤。⑤加入酶底物溶液(6 mg 4-氯-1-奈酚+2 ml -20℃冷甲醇+10 mlTRS+6 ml 30%H2O2)室温下慢摇至膜上出现紫蓝色斑点，蒸馏水充分洗涤终止显色，滤纸吸干。
, 百拇医药
1.3 电镜检查 待测菌株经2.5%戊二醛固定后送上海第二医科大学做扫描电镜和透射电镜检查。
2 结果
2.1 SDS-PAGE 两种染色以银盐色效果好，56601和56608株蛋白带型相似，只是两者的蛋白带染色有深浅之别。待测菌株与56601及56608株相比，表达出蛋白带型相似，但缺失了许多蛋白带，如缺失了分子量约为9×104、6×104、17.5×103的蛋白带出现。
2.2 DIBA 钩体56601呈强阳性(深紫色)斑点，待测菌株的菌落呈弱阳性(浅紫蓝色)斑点，待测菌株的菌液及大肠杆菌、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏痢疾杆菌的菌落和菌液均呈阴性(无色)斑点。
2.3 电镜 透射电镜显示待测菌株细胞壁缺陷(图1)，扫描电镜显示待测菌株呈多形性，菌体仍有螺旋并且末端呈钩状(图2)。
, 百拇医药
图1 透射电镜显示钩端螺旋体L型细胞壁缺陷。
图2 扫描电镜显示钩端螺旋体L型呈多形性，菌体有螺旋，末端呈钩状。
3 讨论
Browm等在分析含赛罗群、波摩那群、黄疸出血群、流感伤寒群和犬群的五价疫苗中各菌株的蛋白抗原体时，发现5株无论是全细胞溶解片段还是去垢剂溶解片段的蛋白条带均相似，仅量有所下降，他将这几株与兔抗赛罗群哈焦型的血清进行免疫印迹分析，证实在这几个不同血清群间广泛存在着共同抗原，我们在SDS-PAGE中也证实钩体黄疸出血群赖型(56601)和波摩那群波摩那型(56608)的蛋白带型相似，两者各条带的蛋白质仅量有所不同。从临床分离的待测钩体L型所表达出的蛋白带与前两者的蛋白质带型相似，提示该菌株确实是钩体，仅缺失了部分条带，这可能与缺失细胞壁有关。由于细胞壁发生缺陷，其许多生物学性状改变。如形态呈多形性，显微镜凝集试验(MAT)呈阴性[3、6]，致使鉴定有困难。用SDS-PAGE电泳主要分析的是蛋白质抗原。可以确定待测菌株是否是钩体，若可靠地区别其群型尚需对钩体的DNA进行分析。
, 百拇医药
许多细菌发生L型变异后，细胞膜代偿性增厚。我们在处理该钩体L型菌株时，曾用多种方法加以破膜：①SDS。②超声波。③组织研磨器研磨。④酸碱处理。⑤37℃～-70℃反复冻融10次。⑥0.22 mm玻璃砂研磨。⑦玻璃砂研磨后再冻融。待测钩体L型菌株用玻璃砂研磨后再冻融的方法才成功破膜，而钩体原型56601和56608株经反复冻融或超声波处理均可破膜，这证实了钩体发生L型变异后，虽细胞壁发生缺陷，但细胞膜却可能增厚致使破膜困难。现已经超薄切片计算机图像分析证实该待测钩体L型菌株与钩体56608原型细胞膜厚度(50个点的均值)之比为45.07∶15.60，P<0.001[7]，表明该钩体变为L型后，细胞膜确实明显增厚，这可能是该菌株在体内能长期存活而致病的原因之一。
DIBA用于钩体病的诊断已有报道，我们用DI-BA常规法检测钩体L型，该待测钩体L型菌株与钩体抗血清未见阳性反应。用酸预先处理后，菌液仍无反应，可能系菌量太少，而菌落则有弱阳性反应，这一方面证实该菌株是钩体L型，另一方面说明L型变异后，抗原性有所减弱。
, http://www.100md.com
电镜显示该钩体L型菌株虽然菌体呈螺旋状并且末端呈钩状，但由于细胞壁缺陷，所以呈多形性，形态上与原菌有很大差异，需要采用其它方法来鉴定。
本课题获卫生部科学研究基金资助[91108049]
参 考 文 献
1，周本正.各类电泳技术.周本正，主编.实用电泳及免疫电泳技术.武汉：湖北科学技术出版社，1989：15～183
2，金冬雁，黎梦枫，译.克隆化基因所表达蛋白质的检测与分析.见：Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，主编.分子克隆实验指南，第2版.北京：科学出版社，1992：852～904
3，宋秀宇，林特夫.免疫荧光和免疫酶技术鉴定钩端螺旋体L型.中华流行病学杂志，1993，14(11)：52
4，张明杰.单克隆抗体的筛选与检测.见：徐志凯主编.实用单克隆抗体.西安：陕西科学出版社，1992：42～62
5，林 涛，时曼华，聂一新，等.酶免疫斑点试验用于钩端螺旋体早期血清学诊断的研究.中国人兽共患病杂志，1994，10(2A)：4
6，宋秀宇，唐素兰，林特夫，等.临床标本中钩端螺旋体及其L型的检测与鉴定.中国人兽共患病杂志，1999，15(5)：33
7，林特夫，宋秀宇，唐素兰，等.钩端螺旋体L型形态与超微结构的研究.中华微生物学与免疫学杂志，1997，17(3)：192, 百拇医药