血瘀证血细胞流变学研究
作者：邢海燕 朱文云 马丽 李尚珠 黄平平 王书桂 金永娟
单位：中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院,开津市,300020
关键词：血瘀证；白细胞；自发活化；粘附
中国微循环000222
【摘要】目的 以动脉硬化性闭塞症(ASO)为对象,研究白细胞(WBC)活化及粘附状态对血瘀的影响.方法 采用(1)硝基蓝四唑(NBT)试验测定WBC的自发活化率(SAR);(2)钢疫荧光法检测WBC表面粘附分子CD11b/CD18表达;(3)剪切力耐受法观测WBC的粘附.结果 ASO三种血瘀证WBC的SAR和粘附率显著高于正常(P<0.01)，粘附分子表达增加，全血粘度升高，红细胞(RBC)变形性下降。结论 血液异常改变是中医血瘀“血行失度”的共同病理基础，白细胞高活化状态及粘附性的改变在血细胞微血管嵌塞和组织损伤中起重要作用。因此对血瘀证的治疗应重视抑制WBC的活化和粘附，抗自由基及改善RBC的变形性。
, 百拇医药
Studies on the Rheology of Blood Cells in Blood Stasis Syndrome
Xing Haiyan,Zhu Wenyun,Ma Li,et al.
(Institute of Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical University,Tianjin,300020)
【Abstract】Objective Selecting arteriosclerosis obliterans (ASO) as objects to study the effects of WBC spontaneous activation and adhesion in blood stasis syndrome.Methods (1) Nitro blue tetraxolium test was used to measure the spontaneous activating rate (SAR) of circulating leukocytes.(2) Immunofluorescence test was used to detect the expression of cell adhesion molecule CD11b/CD18 on leukocytes.(3) Shear stress tolerance test was used to observe the adhesion of leukocytes.Results Compared with control group,the SAR and adherent rate of WBC were elevated significantly (P<0.01) with the increased expression of CD11b/CD18,the rise of blood viscosity and the decreased deformability of erythrocyte.Conclusion The abnormal changes of blood is the common pathogenesis of TCM blood stasis.The elevated SAR and adhenion of leukocyte play important roles in microvascular obstruction and tissue injury.So more emphasis should be layed on the inhibition of WBC spontaneous activation、adhesion、restraining free radicals and improving the deformability of RBC.
, 百拇医药
【Key words】Blood stasis syndrome White blood cell Spontaneous activation Adhesion
许多疾病在发生发展过程中常出现或伴有血瘀证，经历代医家的努力已形成了一套完整的中医血瘀证理论和相应的有效治则。以往的研究多侧重于血液粘度、红细胞表面电荷、血小板聚集和粘附等方面。然而血液中的主要有形成份是红细胞(RBC)和白细胞(WBC)，尤其WBC，因其大而硬，又易于活化嵌塞于微血管内，并释放大量的氧自由基，引起RBC和血管内皮的损伤[1]。因此WBC的活化状态和流变性对血流异常、微循环障碍即“血行失度”起着十分重要的作用。本研究以较常见的周围血管病——动脉硬化性闭塞症(ASO)为对象(选择其中的气滞血瘀、气虚血瘀、阴虚血瘀三型)，探索WBC自发活化状态、粘附分子表达、 流变性(粘附性)及血液流变性在三种血瘀证中的变化规律及差异，以期为血瘀证的防治提供一些新的启示。
材料与方法
, 百拇医药
1 研究对象：根据第三届活血化瘀研究学术会议修订的血瘀证诊断标准，选择气滞血瘀病人30例，均龄61.5±12.9岁；气虚血瘀病人38例，均龄64.5±11.0岁；阴虚血瘀病人35例，均龄57.9±11.9岁。正常人40名，均龄47.7±8.8岁。排除心、脑及周围血管病。
2 方法
2.1 循环白细胞SAR的检测：采用本组改进的Park方法测定[2]。
2.2 WBC粘附性的观测：采用剪切力耐受法，将新鲜抗凝全血分离出的WBC悬浮于PBS缓冲液中，加到锥板与洁净玻璃板之间，静置5min，利用显微摄像装置观测WBC在0.3Pa剪切应力作用下的脱落过程，计算粘附率，公式如下：
2.3 粘附分子CD11b/CD18表达率的测定：采用间接免疫荧光法测定。所用单抗为鼠抗人CD11b抗体，二抗为FITC标记的兔抗鼠抗体，在荧光显微镜下分别观测视野内WBC总数和表达荧光的细胞数，计算CD11b的表达率，即相当于CD11b/CD18的表达率。
, 百拇医药
2.4 血液粘度：采用NXE-1型锥板粘度计，测定5.75S-1切变率下的全血粘度。
2.5 统计学处理：t检验
结 果
1 ASO三种血瘀证WBC活化状态、流变性的变化见表1。
表1 三种血瘀证与正常人SAR、粘附率和粘附分子表达率的比较(
±s)
n
SAR(%)
粘附率(%)
CD1b/CD18
, http://www.100md.com
表达率(%)
气滞血瘀
30
13.42±8.52*
97.2±5.2*
46.32±12.80*
气虚血瘀
38
9.72±6.32*
88.9±11.2*
39.36±10.28*
, http://www.100md.com
阴虚血瘀
35
8.47±5.90*
85.2±13.3*
47.60±12.55*
正常人
40
4.96±2.04
43.5±6.3
24.12±9.35
注：*与正常对照组相比，P<0.01。
, 百拇医药
由表中结果可见，三种血瘀证循环白细胞SAR、WBC粘附率及介导其粘附的粘附分子表达率下正常对照组相比，均具有非常显著差异，尤以气滞血瘀患者的自发活化及粘附性改变最为明显。
2 ASO三种血瘀证血液流变性的变化结果见表2。
表2结果表明血瘀症患者在切变率5.75S-1下的全血粘度显著高于正常人，气滞血瘀和阴虚血瘀的RBC变形性也明显下降，其它指标统计学差异不明显。
3 对SAR和IR在三种血瘀证中异常百分率的比较见表3。
表2 三种血瘀证与正常人血液流变性的变化(±s)
n
ηb(mpa.s)
, 百拇医药
ηp(mpa.s)
HCT(mpa.s)
1R
气滞血瘀
30
19.49±6.39*
1.55±0.13
41.52±8.05
6.67±0.82*
气虚血瘀
, 百拇医药
38
17.05±7.24*
1.51±0.09
38.47±6.90
5.86±1.30
阴虚血瘀
35
18.18±8.36*
1.53±0.13
39.61±5.15
6.17±1.04*
, http://www.100md.com
正常人
40
13.30±3.17
1.54±0.19
40.43±4.90
5.33±1.30
注：*与正常对照组相比，P<0.01。表3 三种血瘀证SAR和IR异常百分率的比较
SAR>10%
SAR>15%
1R
气滞血瘀
, http://www.100md.com 56.7
36.7
44.8
气虚血瘀
38.9
25.0
31.4
阴虚血瘀
22.2
8.3
33.4
注：IR正常范围：4.03～6.03
由表3可见，气滞血瘀患者WBC处于高活化状态，红细胞IR也高于其它型的病人，提示SAR和IR可能有一定的相关性。
, 百拇医药
讨 论
血瘀是血和脉共同构成的“血行”在体内外各种因素作用下引起的“血行失度”，它既是疾病的产物，也是致病因素。血液中WBC数量仅为RBC的1/700，但其体积较大，内粘度比RBC高3个数量级，因此流经毛细血管时，变形较慢，阻力较大。schmid-Schnbein等的研究发现，体内循环WBC中存在一自发活化的亚群，actin蛋白的聚合作用使细胞的变形性降低，细胞表面粘附分子表达增加[3]。粘附分子CD11b/CD18(巨噬细胞分化抗原-1，Mac-1)是整合素家族β2亚族成员，主要表达在粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上，正常情况下存在于亚细胞颗粒，WBC活化后数分钟即表达于细胞表面[4]。它在WBC对血管内皮的粘附中作用特别活跃。本研究证实，三种血瘀证的白细胞SAR升高，粘附性增强，粘附分子表达增加，尤其是气滞血瘀患者各项指标均较高。WBC高活化状态可能是血瘀证一个重要特征。WBC活化后其CD11b/CD18磷酸化并与细胞骨架相连，胞外段变构，由低亲和力状态变成高亲和力状态，使WBC粘附功能增强，聚集性也增强。
, 百拇医药
活化后的WBC代谢活跃，膜表面的NADPH氧化酶吸收氧产生大量超氧阴离子自由基。一方面使RBC膜脂质过氧化损伤，变形性下降，破坏RBC膜表面唾液酸基团，引起RBC聚集性增强。因而三种血瘀证高SAR的同时，全血粘度也高，但血浆粘度和RBC压积差别不明显。另一方面，活化WBC释放的超氧阴离子自由基及蛋白酶损伤血管内皮，破坏血管壁的完整性。血管内皮细胞(VEC)受刺激后产生一些可溶性激活因子，如血小板激活因子(PAF)、白介素-8(IL-8)等，又成为促进WBC活化的因素[5]。粘附于血管内皮表面的WBC也相互激活，产生血管活性物质如白三烯B4(LTB4)、 PAF、 前列腺素等，诱导VEC、WBC表达细胞粘附分子，促进血管收缩，诱导血小板聚集，引起血流缓慢及血栓形成，组织缺血缺氧甚至坏死，加重血瘀证的症状。
WBC自发活化率、粘附性、粘附分子表达、全血粘度增加及RBC变形性降低是构成三种血瘀证“血行失度”的共同病理基础，但也各有特点。其中气滞血瘀的血液异常改变较重，气虚血瘀较轻，在治疗中应侧重于降低WBC的自发活化率。因此，在应用活血化瘀中药进行辨证论治的同时，服用一些抑制WBC活化和粘附、抗自由基，改善RBC变形性的药物，如前列环素(PGI2)、人参皂甙、已酮可可碱、类黄酮类药物，对于ASO各型血瘀证的预防和治疗都有重要的价值。
, 百拇医药
国家中医药管理局科研基金资助项目(95B137)
参考文献
1，Nash GB.White Blood Cell Rheology and Atherosclerotic Ischemic Disease.Clin Hemorrheology.1992,12:59
2，金永娟，朱文去，邢海燕，等.某些血管病循环白细胞自发活化作用的研究。微循环杂志。1997，7(2)：10
3，Schmid-Schnbein GW.The Damaging of Leukocyte Activation in the Microcirculation.Angiology.1993,44(1):45
3，Guy A.Zimmerman,Stephen M.Prescott,Thomas M.Mcintyre.Endothelial Cell Interactions with Granulocytes:Tethering and Signaling Molecules.Immunol Today.1992,13:93
4，Carlos Rosales,Rudy L.Juliano.Signal Transduction by Cell Adhesion Receptors in Leukocytes.J Leukocyte Biol.1995,57:189
(收稿：1999-04-30 修回：1999-08-24), 百拇医药
单位：中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院,开津市,300020
关键词：血瘀证；白细胞；自发活化；粘附
中国微循环000222
【摘要】目的 以动脉硬化性闭塞症(ASO)为对象,研究白细胞(WBC)活化及粘附状态对血瘀的影响.方法 采用(1)硝基蓝四唑(NBT)试验测定WBC的自发活化率(SAR);(2)钢疫荧光法检测WBC表面粘附分子CD11b/CD18表达;(3)剪切力耐受法观测WBC的粘附.结果 ASO三种血瘀证WBC的SAR和粘附率显著高于正常(P<0.01)，粘附分子表达增加，全血粘度升高，红细胞(RBC)变形性下降。结论 血液异常改变是中医血瘀“血行失度”的共同病理基础，白细胞高活化状态及粘附性的改变在血细胞微血管嵌塞和组织损伤中起重要作用。因此对血瘀证的治疗应重视抑制WBC的活化和粘附，抗自由基及改善RBC的变形性。
, 百拇医药
Studies on the Rheology of Blood Cells in Blood Stasis Syndrome
Xing Haiyan,Zhu Wenyun,Ma Li,et al.
(Institute of Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical University,Tianjin,300020)
【Abstract】Objective Selecting arteriosclerosis obliterans (ASO) as objects to study the effects of WBC spontaneous activation and adhesion in blood stasis syndrome.Methods (1) Nitro blue tetraxolium test was used to measure the spontaneous activating rate (SAR) of circulating leukocytes.(2) Immunofluorescence test was used to detect the expression of cell adhesion molecule CD11b/CD18 on leukocytes.(3) Shear stress tolerance test was used to observe the adhesion of leukocytes.Results Compared with control group,the SAR and adherent rate of WBC were elevated significantly (P<0.01) with the increased expression of CD11b/CD18,the rise of blood viscosity and the decreased deformability of erythrocyte.Conclusion The abnormal changes of blood is the common pathogenesis of TCM blood stasis.The elevated SAR and adhenion of leukocyte play important roles in microvascular obstruction and tissue injury.So more emphasis should be layed on the inhibition of WBC spontaneous activation、adhesion、restraining free radicals and improving the deformability of RBC.
, 百拇医药
【Key words】Blood stasis syndrome White blood cell Spontaneous activation Adhesion
许多疾病在发生发展过程中常出现或伴有血瘀证，经历代医家的努力已形成了一套完整的中医血瘀证理论和相应的有效治则。以往的研究多侧重于血液粘度、红细胞表面电荷、血小板聚集和粘附等方面。然而血液中的主要有形成份是红细胞(RBC)和白细胞(WBC)，尤其WBC，因其大而硬，又易于活化嵌塞于微血管内，并释放大量的氧自由基，引起RBC和血管内皮的损伤[1]。因此WBC的活化状态和流变性对血流异常、微循环障碍即“血行失度”起着十分重要的作用。本研究以较常见的周围血管病——动脉硬化性闭塞症(ASO)为对象(选择其中的气滞血瘀、气虚血瘀、阴虚血瘀三型)，探索WBC自发活化状态、粘附分子表达、 流变性(粘附性)及血液流变性在三种血瘀证中的变化规律及差异，以期为血瘀证的防治提供一些新的启示。
材料与方法
, 百拇医药
1 研究对象：根据第三届活血化瘀研究学术会议修订的血瘀证诊断标准，选择气滞血瘀病人30例，均龄61.5±12.9岁；气虚血瘀病人38例，均龄64.5±11.0岁；阴虚血瘀病人35例，均龄57.9±11.9岁。正常人40名，均龄47.7±8.8岁。排除心、脑及周围血管病。
2 方法
2.1 循环白细胞SAR的检测：采用本组改进的Park方法测定[2]。
2.2 WBC粘附性的观测：采用剪切力耐受法，将新鲜抗凝全血分离出的WBC悬浮于PBS缓冲液中，加到锥板与洁净玻璃板之间，静置5min，利用显微摄像装置观测WBC在0.3Pa剪切应力作用下的脱落过程，计算粘附率，公式如下：
2.3 粘附分子CD11b/CD18表达率的测定：采用间接免疫荧光法测定。所用单抗为鼠抗人CD11b抗体，二抗为FITC标记的兔抗鼠抗体，在荧光显微镜下分别观测视野内WBC总数和表达荧光的细胞数，计算CD11b的表达率，即相当于CD11b/CD18的表达率。
, 百拇医药
2.4 血液粘度：采用NXE-1型锥板粘度计，测定5.75S-1切变率下的全血粘度。
2.5 统计学处理：t检验
结 果
1 ASO三种血瘀证WBC活化状态、流变性的变化见表1。
表1 三种血瘀证与正常人SAR、粘附率和粘附分子表达率的比较(
±s)n
SAR(%)
粘附率(%)
CD1b/CD18
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表达率(%)
气滞血瘀
30
13.42±8.52*
97.2±5.2*
46.32±12.80*
气虚血瘀
38
9.72±6.32*
88.9±11.2*
39.36±10.28*
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阴虚血瘀
35
8.47±5.90*
85.2±13.3*
47.60±12.55*
正常人
40
4.96±2.04
43.5±6.3
24.12±9.35
注：*与正常对照组相比，P<0.01。
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由表中结果可见，三种血瘀证循环白细胞SAR、WBC粘附率及介导其粘附的粘附分子表达率下正常对照组相比，均具有非常显著差异，尤以气滞血瘀患者的自发活化及粘附性改变最为明显。
2 ASO三种血瘀证血液流变性的变化结果见表2。
表2结果表明血瘀症患者在切变率5.75S-1下的全血粘度显著高于正常人，气滞血瘀和阴虚血瘀的RBC变形性也明显下降，其它指标统计学差异不明显。
3 对SAR和IR在三种血瘀证中异常百分率的比较见表3。
表2 三种血瘀证与正常人血液流变性的变化(
±s)n
ηb(mpa.s)
, 百拇医药
ηp(mpa.s)
HCT(mpa.s)
1R
气滞血瘀
30
19.49±6.39*
1.55±0.13
41.52±8.05
6.67±0.82*
气虚血瘀
, 百拇医药
38
17.05±7.24*
1.51±0.09
38.47±6.90
5.86±1.30
阴虚血瘀
35
18.18±8.36*
1.53±0.13
39.61±5.15
6.17±1.04*
, http://www.100md.com
正常人
40
13.30±3.17
1.54±0.19
40.43±4.90
5.33±1.30
注：*与正常对照组相比，P<0.01。表3 三种血瘀证SAR和IR异常百分率的比较
SAR>10%
SAR>15%
1R
气滞血瘀
, http://www.100md.com 56.7
36.7
44.8
气虚血瘀
38.9
25.0
31.4
阴虚血瘀
22.2
8.3
33.4
注：IR正常范围：4.03～6.03
由表3可见，气滞血瘀患者WBC处于高活化状态，红细胞IR也高于其它型的病人，提示SAR和IR可能有一定的相关性。
, 百拇医药
讨 论
血瘀是血和脉共同构成的“血行”在体内外各种因素作用下引起的“血行失度”，它既是疾病的产物，也是致病因素。血液中WBC数量仅为RBC的1/700，但其体积较大，内粘度比RBC高3个数量级，因此流经毛细血管时，变形较慢，阻力较大。schmid-Schnbein等的研究发现，体内循环WBC中存在一自发活化的亚群，actin蛋白的聚合作用使细胞的变形性降低，细胞表面粘附分子表达增加[3]。粘附分子CD11b/CD18(巨噬细胞分化抗原-1，Mac-1)是整合素家族β2亚族成员，主要表达在粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上，正常情况下存在于亚细胞颗粒，WBC活化后数分钟即表达于细胞表面[4]。它在WBC对血管内皮的粘附中作用特别活跃。本研究证实，三种血瘀证的白细胞SAR升高，粘附性增强，粘附分子表达增加，尤其是气滞血瘀患者各项指标均较高。WBC高活化状态可能是血瘀证一个重要特征。WBC活化后其CD11b/CD18磷酸化并与细胞骨架相连，胞外段变构，由低亲和力状态变成高亲和力状态，使WBC粘附功能增强，聚集性也增强。
, 百拇医药
活化后的WBC代谢活跃，膜表面的NADPH氧化酶吸收氧产生大量超氧阴离子自由基。一方面使RBC膜脂质过氧化损伤，变形性下降，破坏RBC膜表面唾液酸基团，引起RBC聚集性增强。因而三种血瘀证高SAR的同时，全血粘度也高，但血浆粘度和RBC压积差别不明显。另一方面，活化WBC释放的超氧阴离子自由基及蛋白酶损伤血管内皮，破坏血管壁的完整性。血管内皮细胞(VEC)受刺激后产生一些可溶性激活因子，如血小板激活因子(PAF)、白介素-8(IL-8)等，又成为促进WBC活化的因素[5]。粘附于血管内皮表面的WBC也相互激活，产生血管活性物质如白三烯B4(LTB4)、 PAF、 前列腺素等，诱导VEC、WBC表达细胞粘附分子，促进血管收缩，诱导血小板聚集，引起血流缓慢及血栓形成，组织缺血缺氧甚至坏死，加重血瘀证的症状。
WBC自发活化率、粘附性、粘附分子表达、全血粘度增加及RBC变形性降低是构成三种血瘀证“血行失度”的共同病理基础，但也各有特点。其中气滞血瘀的血液异常改变较重，气虚血瘀较轻，在治疗中应侧重于降低WBC的自发活化率。因此，在应用活血化瘀中药进行辨证论治的同时，服用一些抑制WBC活化和粘附、抗自由基，改善RBC变形性的药物，如前列环素(PGI2)、人参皂甙、已酮可可碱、类黄酮类药物，对于ASO各型血瘀证的预防和治疗都有重要的价值。
, 百拇医药
国家中医药管理局科研基金资助项目(95B137)
参考文献
1，Nash GB.White Blood Cell Rheology and Atherosclerotic Ischemic Disease.Clin Hemorrheology.1992,12:59
2，金永娟，朱文去，邢海燕，等.某些血管病循环白细胞自发活化作用的研究。微循环杂志。1997，7(2)：10
3，Schmid-Schnbein GW.The Damaging of Leukocyte Activation in the Microcirculation.Angiology.1993,44(1):45
3，Guy A.Zimmerman,Stephen M.Prescott,Thomas M.Mcintyre.Endothelial Cell Interactions with Granulocytes:Tethering and Signaling Molecules.Immunol Today.1992,13:93
4，Carlos Rosales,Rudy L.Juliano.Signal Transduction by Cell Adhesion Receptors in Leukocytes.J Leukocyte Biol.1995,57:189
(收稿：1999-04-30 修回：1999-08-24), 百拇医药