风湿性心脏病细胞免疫及调控失衡初探
作者：李代渝 赵华 杨奇 袁刚
单位：李代渝(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；赵华(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；杨奇(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；袁刚(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))
关键词：风湿性心脏病；T淋巴细胞亚群；淋巴细胞转化；自然杀伤细胞；HLA-DR抗原
临床心血管病杂志000209 摘 要：目的：探讨风湿性心脏病(RHD)细胞免疫是否存在异常及其特点，为RHD的早期免疫诊断及今后的免疫疗法提供依据。方法：对41例RHD和44例RHD伴风湿活动(RF)患者的T淋巴细胞亚群、淋巴细胞转化率、自然杀伤(NK)细胞数量及活性，HLA-DR抗原遗传位点进行了测定，并与正常对照组(50例)比较。结果：RHD和RF组细胞免疫功能活性增强，表现为CD4数量增加，CD8数量减少，CD4/CD8比值增大，与正常对照组比较P<0.05和P<0.01；RF组淋巴细胞转化率较正常对照组和RHD组高(P<0.01)，NK细胞数量增加，但活性降低(P<0.01和P<0.05)；RF和RHD组HLA-DR4抗原呈高频分布(53.6%和47.7%)，DR5呈低频分布(14.6%和15.9%)(P<0.01)。结论：RHD存在细胞免疫功能异常，且发生自身免疫趋式，其机制可能是细胞免疫调控失衡。DR4的高频分布，可作为RHD早期诊断的危险度估计。
, http://www.100md.com
Preliminary study of cytoimmune regulatory disturbances
in rheumatic heart disease
LI Dai-yu ZHAO Hua YANG Qi YUAN Gang
(Central Laboratory of Attached Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou 646000)
Abstract：Objective:Of 85 patients,41 with rheumatic heart disease(RHD) 44 with acute rheumatic fever(RF) were studied in order to observe whether they had cytoimmume regulatory disturbances.Method:Tests of T lymphocyte subsets, T lymphocyte conversion rate, natural killer cell counts and functions, and frequencies specific histocompatibillity DR antigens (HLA-DR1-DR7) were performed in 85 consecutive patients with RHD and in 50 normal control subjects.Result:Significant differences were noted for CD4,CD8 and CD4/CD8 ratio. The numbers of CD4 cell were presented more in RHD, RF groups than normal control subjects (P<0.05，<0.01).Lymphocyte conversion rate was observed abnormally high in RF group 〔(87±22)%,P<0.01〕.Numbers of NK cell tended to be higher in RF patients than in control subjects(P<0.01),but the functional activity of NK tended to be lower than other groups. Significant differences were noted for HLA-DR4、DR5,high frequency for DR4(53.6%， P<0.01),low frequency for DR5(14.6%， P<0.01).Conclusion:Immune factors, especially cytoimmune regulatory disturbances may play a role in some cases of RHD and is worth for further investigation.
, 百拇医药
Key words：Rheumatic heart disease T-Lymphocyte subsets Lymphocyte transformation Natura killer cells HLA-DR antigens
风湿性心脏病(RHD)患者存在细胞免疫异常，但对其异常功能的调控研究甚少，为了进一步阐明RHD发病与临床的关系，笔者对一组RHD患者作了细胞免疫功能及遗传位点HLA-DR抗原的测定，旨在探讨RHD细胞免疫功能异常的特点，为本病的早期诊断及免疫治疗提供可靠的依据。
1 对象与方法
1.1 观察对象
RHD伴风湿活动(RF)组41例，男17例，女24例；年龄19～57(26.4±9.7)岁。均经病史询问、体检、X线检查、超声心动图和心电图检查确诊并排除其他心脏疾患。其中单纯性二尖瓣狭窄18例，二尖瓣狭窄兼关闭不全16例，二尖瓣和主动脉瓣联合病变7例。心脏功能分级(NYHA)：Ⅱ级21例，Ⅲ级16例，Ⅳ级4例。风湿活动诊断采用1985年Jones修订标准。RHD组：44例，男18例，女26例；年龄20～58(28.4±11.3)岁，均经上述检查确诊。其中单纯性二尖瓣狭窄19例，二尖瓣狭窄兼关闭不全17例，二尖瓣及主动脉瓣联合病变8例。心功能分级：Ⅱ级20例，Ⅲ级17例，Ⅳ级7例。经临床和实验室检查无风湿活动依据。对照组：50例，男女各25例；年龄18～60(28.3±11.4)岁，均经上述检查证实为健康者。
, http://www.100md.com
1.2 细胞免疫功能测定方法
1.2.1 T淋巴细胞亚群：依Stephen法，取受检者外周血10 ml，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque分离单个核细胞，采用间接免疫荧光法测定CD3、CD4、CD8亚群细胞。单克隆抗体及FITC-IgG荧光二抗试剂盒由卫生部武汉生物制品研究所提供。
1.2.2 T淋巴细胞转化试验：使用植物血凝素刺激法，计数200个淋巴细胞，按下列公式计算转化率：T淋巴细胞转化率=转化的淋巴细胞数/(转化的淋巴细胞数+未转化淋巴细胞数)×100%。
1.2.3 自然杀伤(NK)细胞活性检测〔2，3〕：以NK细胞为效应细胞，K562细胞为靶细胞，用125I UdR标记靶细胞，测定效-靶比50∶1、100∶1、200∶1梯度时的NK细胞活性，每一比例检测均设3支平行试验管和3支自然释放管对比。NK细胞活性(%)=〔上清液cpm/(上清cpm+细胞cpm)×100%〕-自然释放(%)(cpm：每min电泳冲数)。
, 百拇医药
1.2.4 HLA-DR抗原位点的检测：采用Terasaki等〔4〕微量淋巴细胞法。尼龙毛(日本产)粘附分离纯化B淋巴细胞。标准分型血清23份，7种特异性(DR1～DR7)，药盒由上海中心血站提供。
1.3 统计学处理
采用Student′s非配对t检验。
2 结果
2.1 各组T淋巴细胞亚群计数比较
各组T淋巴细胞亚群计数比较见表1。
表1 各组T淋巴细胞亚群计数比较 %，
±s 组别
, 百拇医药
例数
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
RHD组
44
58.2±8.9
44.3±6.21)
16.2±5.31)
2.7±0.61)
, 百拇医药
RF组
41
64.7±7.1
49.2±7.12)
10.3±4.92)
4.8±0.92)
对照组
50
60.1±8.5
35.3±6.2
23.6±5.8
, 百拇医药 1.5±0.3
与对照组比较 1)P<0.05，2)P<0.01
2.2 各组NK细胞活性比较
各组NK细胞活性比较见表2。
表2 各组NK细胞活性比较 %，±s 组别
NK细胞比例
(占淋巴细胞比率)
效-靶比例
50∶1
100∶1
, 百拇医药
200∶1
RHD组
16.1±5.7
35.1±8.5
44.7±8.8
53.2±11.4
RF组
27.3±6.22)
32.4±6.6
37.2±8.11)
49.1±9.31)
, 百拇医药
对照组
14.2±4.1
36.6±9.1
48.7±11.2
57.3±12.4
与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01
2.3 淋巴细胞转化率
对照组转化率为(72±18)%，RF组(87±22)%，RHD组(76±17)%。RF组转化率显著高于对照组(P<0.01)，RHD组与对照组间无显著性差异(P>0.05)。
2.4 HLA-DR抗原阳性频率
, 百拇医药
HLA-DR抗原阳性频率见表3。
表3 各组HLA-DR抗原阳性频率 例(%) 组别
例数
HLA-DR抗原
1
2
3
4
5
6
7
RHD组
44
, 百拇医药
2(4.5)
12(27.3)
7(15.9)
21(47.7)2)
7(15.9)2)
4(9.1)
7(15.9)
RF组
41
1(2.4)
13(31.7)
7(17.1)
, 百拇医药
22(53.6)2)
6(14.6)2)
5(12.2)
6(14.6)
对照组
50
1(2.0)
18(36.0)
9(18.0)
11(22.0)
22(44.0)
5(10.0)
, 百拇医药
7(14.0)
与对照组比较2)P<0.01
3 讨论
CD4、CD8 T细胞亚群在调节人体细胞免疫功能方面起重要作用。CD4与B细胞数目增加和活性增强可导致细胞免疫功能异常亢进以及自身抗体形成。另外，A族溶血性链球菌体M蛋白质可激活细胞毒性T细胞，后者能杀伤人体不同器官组织细胞包括心肌和心内膜细胞，直接导致RHD患者心脏损害。M蛋白质、细胞毒性T细胞和NK细胞均参与自身免疫反应，促使免疫复合物在心肌、瓣膜和乳头肌等组织沉积，加重心脏病变。NK细胞是广谱非特异性杀伤细胞，其表面缺乏免疫球蛋白和C3受体，仅有低密度T细胞抗原，活性不受抗原-抗体复合物影响，胸腺素可增强NK细胞功能。本文RF组NK细胞显著增多，可能与CD4细胞辅助诱导有关，但其活性低于正常，原因不明。RHD组NK细胞数量和活性均与对照组无显著改变。NK细胞活性恢复正常，利于病变组织自然修复，并提示风湿活动趋于静止。
, http://www.100md.com
HLA抗原在免疫活性细胞相互作用，发生免疫反应的过程中起限制作用。在巨噬细胞将外来抗原提呈给CD4，进而与激活的CD4协助B细胞增殖，转化为浆细胞的过程中，需要有相同的D或DR抗原，即CD4同时识别外来抗原和DR抗原〔5〕，否则，免疫反应将不能发生，DR抗原实际上起着调控作用。本文结果表明，RHD和RF组DR抗原虽仍呈多态性分布，但存在分布异常，主要表现为DR4抗原频率增高，DR5抗原频率降低。HLA-DR抗原的异常分布可能是RHD发病的先决条件，导致机体发生异常免疫反应。有文献〔6〕观察了33例RHD患者，结果仍然是DR4抗原频率增高(52%)。与本文基本相符。DR4抗原是否就是RHD疾病的病理基因，还有待进一步研究。
RF组患者细胞免疫反应异常亢进，且有自身免疫参与；RHD组患者虽无临床风湿活动依据，但CD4细胞仍增多，HLA-DR抗原频率亦高，提示细胞免疫反应在体内隐匿进行。因此，对风湿活动患者给予包括皮质激素在内的抗炎和免疫抑制剂治疗是合理的，但现行疗程似嫌过短。建议在评价风湿活动和药物疗效时，结合细胞免疫检查分析，以期改善RHD和RF患者的诊断和治疗。
, http://www.100md.com
基金项目：四川省科委资助项目(NO.92-012)
参考文献：
1 Stephen H I. Rapid enumeration of T lymphocytes by a flow cytometric immunofluorescence method. Clin Chem,1982,28:1095～1103
2 方建明，毕爱华.人类淋巴结自然杀伤细胞活性的探讨.中华微生物学和免疫杂志，1988，8：78～83
3 Svejggard A, Platz P, Ryder L P.HLA and disease 1982-a survey. Immunol Rev,1983,70:193～218
4 Terasaki P I, McClelland J D, Park M S, et al. Microdroplet lymphocyte cytotoxicity test-1973. Manual of tissue techniques. Washington DC:United States Government Printing Office 1973:DHEW Publication No. (NIH)75-545：54
, 百拇医药
5 Sasazuki T, Yasuharu N, Muto M, et al. HLA-linked genes controlling immune response and disease susceptibility. Immunol Rev,1983,70:51～75
6 Anastasiou-Nana, M I,Anderson J L,Carlguist J F, et al. HLA-DR typing and lymphocyte subset evaluation in rheumatic heart disease. A search for immue response factors. Am Heart J,1986,112:992～997
收稿日期：1998-12-29
修稿日期：1999-08-09, 百拇医药
单位：李代渝(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；赵华(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；杨奇(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))；袁刚(泸州医学院附属医院中心实验室检验科心血管研究室(四川泸州，646000))
关键词：风湿性心脏病；T淋巴细胞亚群；淋巴细胞转化；自然杀伤细胞；HLA-DR抗原
临床心血管病杂志000209 摘 要：目的：探讨风湿性心脏病(RHD)细胞免疫是否存在异常及其特点，为RHD的早期免疫诊断及今后的免疫疗法提供依据。方法：对41例RHD和44例RHD伴风湿活动(RF)患者的T淋巴细胞亚群、淋巴细胞转化率、自然杀伤(NK)细胞数量及活性，HLA-DR抗原遗传位点进行了测定，并与正常对照组(50例)比较。结果：RHD和RF组细胞免疫功能活性增强，表现为CD4数量增加，CD8数量减少，CD4/CD8比值增大，与正常对照组比较P<0.05和P<0.01；RF组淋巴细胞转化率较正常对照组和RHD组高(P<0.01)，NK细胞数量增加，但活性降低(P<0.01和P<0.05)；RF和RHD组HLA-DR4抗原呈高频分布(53.6%和47.7%)，DR5呈低频分布(14.6%和15.9%)(P<0.01)。结论：RHD存在细胞免疫功能异常，且发生自身免疫趋式，其机制可能是细胞免疫调控失衡。DR4的高频分布，可作为RHD早期诊断的危险度估计。
, http://www.100md.com
Preliminary study of cytoimmune regulatory disturbances
in rheumatic heart disease
LI Dai-yu ZHAO Hua YANG Qi YUAN Gang
(Central Laboratory of Attached Hospital, Luzhou Medical College,Luzhou 646000)
Abstract：Objective:Of 85 patients,41 with rheumatic heart disease(RHD) 44 with acute rheumatic fever(RF) were studied in order to observe whether they had cytoimmume regulatory disturbances.Method:Tests of T lymphocyte subsets, T lymphocyte conversion rate, natural killer cell counts and functions, and frequencies specific histocompatibillity DR antigens (HLA-DR1-DR7) were performed in 85 consecutive patients with RHD and in 50 normal control subjects.Result:Significant differences were noted for CD4,CD8 and CD4/CD8 ratio. The numbers of CD4 cell were presented more in RHD, RF groups than normal control subjects (P<0.05，<0.01).Lymphocyte conversion rate was observed abnormally high in RF group 〔(87±22)%,P<0.01〕.Numbers of NK cell tended to be higher in RF patients than in control subjects(P<0.01),but the functional activity of NK tended to be lower than other groups. Significant differences were noted for HLA-DR4、DR5,high frequency for DR4(53.6%， P<0.01),low frequency for DR5(14.6%， P<0.01).Conclusion:Immune factors, especially cytoimmune regulatory disturbances may play a role in some cases of RHD and is worth for further investigation.
, 百拇医药
Key words：Rheumatic heart disease T-Lymphocyte subsets Lymphocyte transformation Natura killer cells HLA-DR antigens
风湿性心脏病(RHD)患者存在细胞免疫异常，但对其异常功能的调控研究甚少，为了进一步阐明RHD发病与临床的关系，笔者对一组RHD患者作了细胞免疫功能及遗传位点HLA-DR抗原的测定，旨在探讨RHD细胞免疫功能异常的特点，为本病的早期诊断及免疫治疗提供可靠的依据。
1 对象与方法
1.1 观察对象
RHD伴风湿活动(RF)组41例，男17例，女24例；年龄19～57(26.4±9.7)岁。均经病史询问、体检、X线检查、超声心动图和心电图检查确诊并排除其他心脏疾患。其中单纯性二尖瓣狭窄18例，二尖瓣狭窄兼关闭不全16例，二尖瓣和主动脉瓣联合病变7例。心脏功能分级(NYHA)：Ⅱ级21例，Ⅲ级16例，Ⅳ级4例。风湿活动诊断采用1985年Jones修订标准。RHD组：44例，男18例，女26例；年龄20～58(28.4±11.3)岁，均经上述检查确诊。其中单纯性二尖瓣狭窄19例，二尖瓣狭窄兼关闭不全17例，二尖瓣及主动脉瓣联合病变8例。心功能分级：Ⅱ级20例，Ⅲ级17例，Ⅳ级7例。经临床和实验室检查无风湿活动依据。对照组：50例，男女各25例；年龄18～60(28.3±11.4)岁，均经上述检查证实为健康者。
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1.2 细胞免疫功能测定方法
1.2.1 T淋巴细胞亚群：依Stephen法，取受检者外周血10 ml，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque分离单个核细胞，采用间接免疫荧光法测定CD3、CD4、CD8亚群细胞。单克隆抗体及FITC-IgG荧光二抗试剂盒由卫生部武汉生物制品研究所提供。
1.2.2 T淋巴细胞转化试验：使用植物血凝素刺激法，计数200个淋巴细胞，按下列公式计算转化率：T淋巴细胞转化率=转化的淋巴细胞数/(转化的淋巴细胞数+未转化淋巴细胞数)×100%。
1.2.3 自然杀伤(NK)细胞活性检测〔2，3〕：以NK细胞为效应细胞，K562细胞为靶细胞，用125I UdR标记靶细胞，测定效-靶比50∶1、100∶1、200∶1梯度时的NK细胞活性，每一比例检测均设3支平行试验管和3支自然释放管对比。NK细胞活性(%)=〔上清液cpm/(上清cpm+细胞cpm)×100%〕-自然释放(%)(cpm：每min电泳冲数)。
, 百拇医药
1.2.4 HLA-DR抗原位点的检测：采用Terasaki等〔4〕微量淋巴细胞法。尼龙毛(日本产)粘附分离纯化B淋巴细胞。标准分型血清23份，7种特异性(DR1～DR7)，药盒由上海中心血站提供。
1.3 统计学处理
采用Student′s非配对t检验。
2 结果
2.1 各组T淋巴细胞亚群计数比较
各组T淋巴细胞亚群计数比较见表1。
表1 各组T淋巴细胞亚群计数比较 %，
±s 组别, 百拇医药
例数
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
RHD组
44
58.2±8.9
44.3±6.21)
16.2±5.31)
2.7±0.61)
, 百拇医药
RF组
41
64.7±7.1
49.2±7.12)
10.3±4.92)
4.8±0.92)
对照组
50
60.1±8.5
35.3±6.2
23.6±5.8
, 百拇医药 1.5±0.3
与对照组比较 1)P<0.05，2)P<0.01
2.2 各组NK细胞活性比较
各组NK细胞活性比较见表2。
表2 各组NK细胞活性比较 %，
±s 组别NK细胞比例
(占淋巴细胞比率)
效-靶比例
50∶1
100∶1
, 百拇医药
200∶1
RHD组
16.1±5.7
35.1±8.5
44.7±8.8
53.2±11.4
RF组
27.3±6.22)
32.4±6.6
37.2±8.11)
49.1±9.31)
, 百拇医药
对照组
14.2±4.1
36.6±9.1
48.7±11.2
57.3±12.4
与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01
2.3 淋巴细胞转化率
对照组转化率为(72±18)%，RF组(87±22)%，RHD组(76±17)%。RF组转化率显著高于对照组(P<0.01)，RHD组与对照组间无显著性差异(P>0.05)。
2.4 HLA-DR抗原阳性频率
, 百拇医药
HLA-DR抗原阳性频率见表3。
表3 各组HLA-DR抗原阳性频率 例(%) 组别
例数
HLA-DR抗原
1
2
3
4
5
6
7
RHD组
44
, 百拇医药
2(4.5)
12(27.3)
7(15.9)
21(47.7)2)
7(15.9)2)
4(9.1)
7(15.9)
RF组
41
1(2.4)
13(31.7)
7(17.1)
, 百拇医药
22(53.6)2)
6(14.6)2)
5(12.2)
6(14.6)
对照组
50
1(2.0)
18(36.0)
9(18.0)
11(22.0)
22(44.0)
5(10.0)
, 百拇医药
7(14.0)
与对照组比较2)P<0.01
3 讨论
CD4、CD8 T细胞亚群在调节人体细胞免疫功能方面起重要作用。CD4与B细胞数目增加和活性增强可导致细胞免疫功能异常亢进以及自身抗体形成。另外，A族溶血性链球菌体M蛋白质可激活细胞毒性T细胞，后者能杀伤人体不同器官组织细胞包括心肌和心内膜细胞，直接导致RHD患者心脏损害。M蛋白质、细胞毒性T细胞和NK细胞均参与自身免疫反应，促使免疫复合物在心肌、瓣膜和乳头肌等组织沉积，加重心脏病变。NK细胞是广谱非特异性杀伤细胞，其表面缺乏免疫球蛋白和C3受体，仅有低密度T细胞抗原，活性不受抗原-抗体复合物影响，胸腺素可增强NK细胞功能。本文RF组NK细胞显著增多，可能与CD4细胞辅助诱导有关，但其活性低于正常，原因不明。RHD组NK细胞数量和活性均与对照组无显著改变。NK细胞活性恢复正常，利于病变组织自然修复，并提示风湿活动趋于静止。
, http://www.100md.com
HLA抗原在免疫活性细胞相互作用，发生免疫反应的过程中起限制作用。在巨噬细胞将外来抗原提呈给CD4，进而与激活的CD4协助B细胞增殖，转化为浆细胞的过程中，需要有相同的D或DR抗原，即CD4同时识别外来抗原和DR抗原〔5〕，否则，免疫反应将不能发生，DR抗原实际上起着调控作用。本文结果表明，RHD和RF组DR抗原虽仍呈多态性分布，但存在分布异常，主要表现为DR4抗原频率增高，DR5抗原频率降低。HLA-DR抗原的异常分布可能是RHD发病的先决条件，导致机体发生异常免疫反应。有文献〔6〕观察了33例RHD患者，结果仍然是DR4抗原频率增高(52%)。与本文基本相符。DR4抗原是否就是RHD疾病的病理基因，还有待进一步研究。
RF组患者细胞免疫反应异常亢进，且有自身免疫参与；RHD组患者虽无临床风湿活动依据，但CD4细胞仍增多，HLA-DR抗原频率亦高，提示细胞免疫反应在体内隐匿进行。因此，对风湿活动患者给予包括皮质激素在内的抗炎和免疫抑制剂治疗是合理的，但现行疗程似嫌过短。建议在评价风湿活动和药物疗效时，结合细胞免疫检查分析，以期改善RHD和RF患者的诊断和治疗。
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基金项目：四川省科委资助项目(NO.92-012)
参考文献：
1 Stephen H I. Rapid enumeration of T lymphocytes by a flow cytometric immunofluorescence method. Clin Chem,1982,28:1095～1103
2 方建明，毕爱华.人类淋巴结自然杀伤细胞活性的探讨.中华微生物学和免疫杂志，1988，8：78～83
3 Svejggard A, Platz P, Ryder L P.HLA and disease 1982-a survey. Immunol Rev,1983,70:193～218
4 Terasaki P I, McClelland J D, Park M S, et al. Microdroplet lymphocyte cytotoxicity test-1973. Manual of tissue techniques. Washington DC:United States Government Printing Office 1973:DHEW Publication No. (NIH)75-545：54
, 百拇医药
5 Sasazuki T, Yasuharu N, Muto M, et al. HLA-linked genes controlling immune response and disease susceptibility. Immunol Rev,1983,70:51～75
6 Anastasiou-Nana, M I,Anderson J L,Carlguist J F, et al. HLA-DR typing and lymphocyte subset evaluation in rheumatic heart disease. A search for immue response factors. Am Heart J,1986,112:992～997
收稿日期：1998-12-29
修稿日期：1999-08-09, 百拇医药