黄芪提取物对小鼠学习记忆及免疫功能的影响
作者：张艳 明亮 李卫平 李京培 陈敏珠
单位：安徽医科大学药理教研室，合肥 230032
关键词：黄芪提取物；环磷酰胺；记忆；免疫功能
中国临床药理学与治疗学000208
目的 观察黄芪提取物对免疫抑制小鼠学习记忆及免疫功能的影响。方法 采用小鼠跳台法测定学习记忆功能；采用吞噬鸡红细胞法检测腹腔巨噬细胞的吞噬功能；采用3H-TdR掺入法测定外周血T淋巴细胞增殖反应；采用ELISA法测定血中IFN-γ含量。结果 黄芪提取物(25,50 mg.kg-1，ig,21 d)能改善CTX降低的小鼠学习记忆功能，同时能提高降低的单核细胞吞噬能力、T淋巴细胞增殖反应以及血中IFN-γ含量。结论 黄芪提取物可改善小鼠学习记忆功能和具有免疫调节作用。
, http://www.100md.com
中图分类号 R937.71
Effect of extracts of astralus on learning,memory and immune function in mice
ZHANG Yan
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
MING Liang
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
LI Wei-Ping
, http://www.100md.com
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
LI Jing-Pei
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
CHEN Min-Zhu
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
Aim The effect of extracts of astralus(EA) on learning, memory and immune function of CTX treated mice was observed.Methods The step-down test was adopted to investigate learning and memory in mice; the method of enveloping CRBC was adopted to explore the function of macrophage in abdominal cavity; 3H-TdR marking method was used to observe the prolifernation of T lymphocytes and the method of ELISA was applied to measure the concentration of IFN-γ in blood. Results EA (25 mg.kg-1, 50mg .kg-1,ig, 21 d ) could boost learning and memory , enhance the phagocytic activity of monocytes and the proliferation of T lymphocytes of CTX treated mice, and increase the concentration of IFN-γ in blood of CTX treated mice. Conclusion EA not only promote learning and memory, but regulate immune function.
, http://www.100md.com
Key words extracts of astralus; cytoxan; memory; immune function
黄芪作为补气药，应用历史悠久，其单体具有免疫调节、抗炎、镇痛等多方面的药理作用[1～3]。黄芪提取物(extracts of astralus,EA)是从中药黄芪中提取的有效成分，本研究旨在观察EA对免疫抑制小鼠学习记忆及免疫功能的影响。
1 材料
1.1 药品 黄芪提取物,由江苏药物研究所提供；环磷酰胺(cytoxan,CTX)，上海第十二制药厂产品，批号：981024；刀豆蛋白A(Con A)为美国Sigma公司产品；3H-TdR，上海原子能研究所产品；Mouse IFN-γ ELISA kit为美国BioSource International公司产品。
, 百拇医药 1.2 动物 C57BL/6J小鼠，体重(21±2)g，♀♂兼用，购自安徽医科大学实验中心，动物合格证：皖医实动准字第01号。
1.3 仪器 CO2培养箱:重庆试验设备厂生产；FJ-2107型液闪仪，西安262厂产品；Backman Accu-Prep TM System 222A稀释进样仪:日本东芝公司产品；3022型ELISA读数仪:南京华东电子管厂生产；小鼠跳台测定装置由浙江宁海白石药检仪器厂生产的声-光-电单向穿梭箱改装而成。
2 方法
将C57BL/6J小鼠随机分为阴性对照、病理模型及黄芪提取物用药组(25 mg.kg-1及50 mg.kg-1)4组，每组25只，共计100只。黄芪提取物ig给药，gd×21 d；测验前7 d，小鼠每天sc CTX60 mg.kg-1(阴性对照组sc等容量生理盐水)，共3 d。最后一次给药后1 h，采用跳台法对小鼠进行训练，24 h后再进行测验。测验结束后，小鼠眼球取血抗凝供测定外周血T淋巴细胞增殖反应及其IFN-γ含量测定。然后处死小鼠，摘取脾及胸腺，称重后计算脏器系数。另一批小鼠跳台测验结束后用于测定腹腔巨噬细胞的功能。
, 百拇医药
2.1 小鼠学习记忆功能测定 采用小鼠跳台法[4]。训练时，将小鼠置反射箱内适应5 min后，轻放于平台上，并记录小鼠停留在平台上的潜伏期(step-down latency, SDL)。小鼠从平台上跳下，四肢接触铜栅时，立即给予电刺激(40 V)，记录小鼠逃避至台上的潜伏期(escape latency，EL)，同时记录5 min内小鼠从台上跳下的触电次数(即错误次数)。选取SDL和EL在2～60 s的小鼠，于训练后24 h进行测验，分别记录3 min内小鼠的跳台错误次数、SDL及EL。测验时，若小鼠停留在台上超过3 min时，将其取下放入箱内一角，尾对平台，给予电刺激，并记录EL。
2.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定[5] 小鼠跳台测验结束后，每鼠ip 5%鸡红细胞(CRBC)0.5 ml，12 h后，脱臼处死小鼠，剪开腹壁皮肤，ip Hank's液2 ml，轻揉小鼠腹部，吸取腹腔冲洗液，滴片，晾干后，Giemsa-wright染色，油镜观察。计数100个巨噬细胞，并按下式计算：吞噬百分率=吞噬CRBC的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%。
, 百拇医药
2.3 小鼠外周血T淋巴细胞增殖反应测定 采用3H-TdR掺入法[6]。小鼠取血后，用淋巴细胞分层液制备单个核细胞，以RPMI-1640培养液制备外周血淋巴细胞悬液(1×106.ml-1)。在40孔培养板上，每孔分别加入200 μl细胞悬液及Con A，终浓度50 μg.ml-1，置37 ℃，5% CO2培养箱中培养72 h，于培养终止前6 h均值，加3H-TdR，每孔加10 μl相当于0.5 μCi。继续培养至72 h后，收集细胞用液闪仪测定放射性，并以cpm均值表示结果。
2.4 小鼠血中IFN-γ含量测定 按照试剂盒操作方法进行。分别吸取标准品及样品100 μl加入包被板孔内，37 ℃孵育2 h，然后倾去孔内液体，清洗孔板4次，每孔加入100 μl生物素标记的抗IFN-γ抗体，混匀，37 ℃孵育40 min，再次倾去孔内液体及清洗孔板；每孔加入工作浓度的streptravidin- HPR，37 ℃孵育40 min，并于最后一次倾去孔内液体及清洗孔板后，每孔加入100 μl底物TMB，室温暗处放置30 min，于450 nm处用ELISA读数仪测定OD值，并根据标准曲线计算IFN-γ含量。
, 百拇医药
2.5 统计方法 采用方差分析法。
表1 EA对CTX致学习记忆障碍小鼠的影响(
±s,n=10) 组别
EA剂量/mg.kg-1
跳台错误次数
测验时潜伏期/s
训练/5min
测验/3min
SDL
EL
对照组
, 百拇医药
-
4.6±1.2
2.8±0.9
110±45
2.3±1.4
CTX
-
7.0±1.5**
4.2±1.4**
64±31**
4.4±2.1**
, 百拇医药
CTX+EA
25
4.5±1.3△△
4.1±0.9
69±26
3.8±2.1
CTX+EA
50
5.0±0.9△△
3.2±1.5△
100±44△△
, http://www.100md.com
2.9±1.4△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01表2 EA对CTX致免疫功能低下小鼠脾、胸腺指数的影响(±s,n=10) 组别
EA剂量/mg.kg-1
脾指数/mg.(10g)-1
胸腺指数/mg.(10g)-1
对照组
, 百拇医药 -
33.4±4.3
30.8±2.0
CTX
-
15.4±2.3**
15.3±1.6**
CTX+EA
25
18.9±3.0△
21.0±1.9△
, http://www.100md.com CTX+EA
50
26.3±4.7△△
25.3±2.7△△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01
表3 EA对CTX致免疫功能低下小鼠的影响( ±s,n=10) 组别
EA剂量/mg.kg-1
巨噬细胞吞噬百分率%
T淋巴细胞增殖反应/cpm
IFN-γ含量/pg.ml-1
, http://www.100md.com
对照组
-
32.0±4.3
9989±2509
4.8±0.8
CTX
-
11.9±2.5**
6132±1509**
3.0±0.5**
CTX+EA
25
, 百拇医药
19.0±3.6△
6662±1797
3.4±0.5
CTX+EA
50
21.8±3.8△△
8358±2812△
4.0±0.6△△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01
3 结果
, 百拇医药
3.1 对CTX致学习记忆障碍小鼠的影响 与阴性对照组相比，CTX组小鼠训练和测验时跳台错误次数明显增多，测验时SDL缩短，而EL延长，说明CTX可致C57BL/6J 小鼠学习记忆障碍。两个剂量黄芪提取物对学习记忆均有改善作用，表现为跳台错误次数减少，SDL延长及EL缩短，见表1。
3.2 对CTX致免疫功能低下小鼠的影响 与阴性对照组相比较，CTX组小鼠的脾、胸腺重量下降；腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、外周血T淋巴细胞增殖反应及IFN-γ含量降低。两种剂量黄芪提取物对各项免疫指标均有程度不同的改善作用，不仅可提高脾、胸腺重量及巨噬细胞的吞噬百分率，而且可使小鼠外周血降低的T淋巴细胞增殖反应及IFN-γ含量明显升高，差异有显著性，见表2、表3。
4 讨论
衰老过程与免疫系统的关系已越来越受到人们的重视。免疫系统不仅是机体对内、外环境变化的适应和反应系统，而且与机体的老化过程密切相关，免疫功能的降低或失调均可加速机体的衰老。衰老过程发生时，免疫功能可逐渐出现减退或失调，尤以细胞免疫功能的降低出现早且表现突出。
, http://www.100md.com
众所周知，CTX可明显抑制机体的免疫功能，常用于造成免疫功能低下动物模型。而我们的研究着眼点在于用CTX引起免疫抑制的同时，观察小鼠的学习记忆能力有何改变。结果发现适量CTX的应用可同时影响免疫功能及学习记忆能力，并造成免疫功能障碍及学习记忆障碍。黄芪提取物对CTX引起的学习记忆障碍及免疫功能低下有明显的改善作用，可不同程度地纠正CTX所致的小鼠学习记忆障碍，使免疫器官重量上升，免疫功能提高，血中IFN-γ含量提高，提示黄芪提取物具有改善学习记忆功能和调节免疫功能的作用。
安徽省教委资助项目。
张艳，女，38岁，副教授。
陈敏珠，女，66岁，博士生导师，教授
参考文献
1，李卫平，周爱武，郑亦文，等. 88016的免疫调节作用. 新药研究基金会报，1993；3：83
, 百拇医药
2，李卫平，王斌，陈敏珠，等. 88016对大鼠腹腔巨噬细胞产生过氧化氢的调节作用.新药研究基金会报，1993；3：77
3，王斌，郑芙林，周爱武，等. 88016的抗炎和镇痛作用.新药研究基金会报，1993；3：95
4，徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991：659
5，许士凯,主编. 抗衰老药物学. 第1版.北京：中国医药科技出版社，1994：163
6，中华人民共和国卫生部药政局编. 免疫调节药. 见：新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993：128
2000-03-17 收稿，2000-04-18 修回, 百拇医药
单位：安徽医科大学药理教研室，合肥 230032
关键词：黄芪提取物；环磷酰胺；记忆；免疫功能
中国临床药理学与治疗学000208
目的 观察黄芪提取物对免疫抑制小鼠学习记忆及免疫功能的影响。方法 采用小鼠跳台法测定学习记忆功能；采用吞噬鸡红细胞法检测腹腔巨噬细胞的吞噬功能；采用3H-TdR掺入法测定外周血T淋巴细胞增殖反应；采用ELISA法测定血中IFN-γ含量。结果 黄芪提取物(25,50 mg.kg-1，ig,21 d)能改善CTX降低的小鼠学习记忆功能，同时能提高降低的单核细胞吞噬能力、T淋巴细胞增殖反应以及血中IFN-γ含量。结论 黄芪提取物可改善小鼠学习记忆功能和具有免疫调节作用。
, http://www.100md.com
中图分类号 R937.71
Effect of extracts of astralus on learning,memory and immune function in mice
ZHANG Yan
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
MING Liang
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
LI Wei-Ping
, http://www.100md.com
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
LI Jing-Pei
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
CHEN Min-Zhu
(Department of Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei, 230032)
Aim The effect of extracts of astralus(EA) on learning, memory and immune function of CTX treated mice was observed.Methods The step-down test was adopted to investigate learning and memory in mice; the method of enveloping CRBC was adopted to explore the function of macrophage in abdominal cavity; 3H-TdR marking method was used to observe the prolifernation of T lymphocytes and the method of ELISA was applied to measure the concentration of IFN-γ in blood. Results EA (25 mg.kg-1, 50mg .kg-1,ig, 21 d ) could boost learning and memory , enhance the phagocytic activity of monocytes and the proliferation of T lymphocytes of CTX treated mice, and increase the concentration of IFN-γ in blood of CTX treated mice. Conclusion EA not only promote learning and memory, but regulate immune function.
, http://www.100md.com
Key words extracts of astralus; cytoxan; memory; immune function
黄芪作为补气药，应用历史悠久，其单体具有免疫调节、抗炎、镇痛等多方面的药理作用[1～3]。黄芪提取物(extracts of astralus,EA)是从中药黄芪中提取的有效成分，本研究旨在观察EA对免疫抑制小鼠学习记忆及免疫功能的影响。
1 材料
1.1 药品 黄芪提取物,由江苏药物研究所提供；环磷酰胺(cytoxan,CTX)，上海第十二制药厂产品，批号：981024；刀豆蛋白A(Con A)为美国Sigma公司产品；3H-TdR，上海原子能研究所产品；Mouse IFN-γ ELISA kit为美国BioSource International公司产品。
, 百拇医药 1.2 动物 C57BL/6J小鼠，体重(21±2)g，♀♂兼用，购自安徽医科大学实验中心，动物合格证：皖医实动准字第01号。
1.3 仪器 CO2培养箱:重庆试验设备厂生产；FJ-2107型液闪仪，西安262厂产品；Backman Accu-Prep TM System 222A稀释进样仪:日本东芝公司产品；3022型ELISA读数仪:南京华东电子管厂生产；小鼠跳台测定装置由浙江宁海白石药检仪器厂生产的声-光-电单向穿梭箱改装而成。
2 方法
将C57BL/6J小鼠随机分为阴性对照、病理模型及黄芪提取物用药组(25 mg.kg-1及50 mg.kg-1)4组，每组25只，共计100只。黄芪提取物ig给药，gd×21 d；测验前7 d，小鼠每天sc CTX60 mg.kg-1(阴性对照组sc等容量生理盐水)，共3 d。最后一次给药后1 h，采用跳台法对小鼠进行训练，24 h后再进行测验。测验结束后，小鼠眼球取血抗凝供测定外周血T淋巴细胞增殖反应及其IFN-γ含量测定。然后处死小鼠，摘取脾及胸腺，称重后计算脏器系数。另一批小鼠跳台测验结束后用于测定腹腔巨噬细胞的功能。
, 百拇医药
2.1 小鼠学习记忆功能测定 采用小鼠跳台法[4]。训练时，将小鼠置反射箱内适应5 min后，轻放于平台上，并记录小鼠停留在平台上的潜伏期(step-down latency, SDL)。小鼠从平台上跳下，四肢接触铜栅时，立即给予电刺激(40 V)，记录小鼠逃避至台上的潜伏期(escape latency，EL)，同时记录5 min内小鼠从台上跳下的触电次数(即错误次数)。选取SDL和EL在2～60 s的小鼠，于训练后24 h进行测验，分别记录3 min内小鼠的跳台错误次数、SDL及EL。测验时，若小鼠停留在台上超过3 min时，将其取下放入箱内一角，尾对平台，给予电刺激，并记录EL。
2.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定[5] 小鼠跳台测验结束后，每鼠ip 5%鸡红细胞(CRBC)0.5 ml，12 h后，脱臼处死小鼠，剪开腹壁皮肤，ip Hank's液2 ml，轻揉小鼠腹部，吸取腹腔冲洗液，滴片，晾干后，Giemsa-wright染色，油镜观察。计数100个巨噬细胞，并按下式计算：吞噬百分率=吞噬CRBC的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%。
, 百拇医药
2.3 小鼠外周血T淋巴细胞增殖反应测定 采用3H-TdR掺入法[6]。小鼠取血后，用淋巴细胞分层液制备单个核细胞，以RPMI-1640培养液制备外周血淋巴细胞悬液(1×106.ml-1)。在40孔培养板上，每孔分别加入200 μl细胞悬液及Con A，终浓度50 μg.ml-1，置37 ℃，5% CO2培养箱中培养72 h，于培养终止前6 h均值，加3H-TdR，每孔加10 μl相当于0.5 μCi。继续培养至72 h后，收集细胞用液闪仪测定放射性，并以cpm均值表示结果。
2.4 小鼠血中IFN-γ含量测定 按照试剂盒操作方法进行。分别吸取标准品及样品100 μl加入包被板孔内，37 ℃孵育2 h，然后倾去孔内液体，清洗孔板4次，每孔加入100 μl生物素标记的抗IFN-γ抗体，混匀，37 ℃孵育40 min，再次倾去孔内液体及清洗孔板；每孔加入工作浓度的streptravidin- HPR，37 ℃孵育40 min，并于最后一次倾去孔内液体及清洗孔板后，每孔加入100 μl底物TMB，室温暗处放置30 min，于450 nm处用ELISA读数仪测定OD值，并根据标准曲线计算IFN-γ含量。
, 百拇医药
2.5 统计方法 采用方差分析法。
表1 EA对CTX致学习记忆障碍小鼠的影响(
±s,n=10) 组别EA剂量/mg.kg-1
跳台错误次数
测验时潜伏期/s
训练/5min
测验/3min
SDL
EL
对照组
, 百拇医药
-
4.6±1.2
2.8±0.9
110±45
2.3±1.4
CTX
-
7.0±1.5**
4.2±1.4**
64±31**
4.4±2.1**
, 百拇医药
CTX+EA
25
4.5±1.3△△
4.1±0.9
69±26
3.8±2.1
CTX+EA
50
5.0±0.9△△
3.2±1.5△
100±44△△
, http://www.100md.com
2.9±1.4△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01表2 EA对CTX致免疫功能低下小鼠脾、胸腺指数的影响(
±s,n=10) 组别EA剂量/mg.kg-1
脾指数/mg.(10g)-1
胸腺指数/mg.(10g)-1
对照组
, 百拇医药 -
33.4±4.3
30.8±2.0
CTX
-
15.4±2.3**
15.3±1.6**
CTX+EA
25
18.9±3.0△
21.0±1.9△
, http://www.100md.com CTX+EA
50
26.3±4.7△△
25.3±2.7△△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01
表3 EA对CTX致免疫功能低下小鼠的影响( ±s,n=10) 组别
EA剂量/mg.kg-1
巨噬细胞吞噬百分率%
T淋巴细胞增殖反应/cpm
IFN-γ含量/pg.ml-1
, http://www.100md.com
对照组
-
32.0±4.3
9989±2509
4.8±0.8
CTX
-
11.9±2.5**
6132±1509**
3.0±0.5**
CTX+EA
25
, 百拇医药
19.0±3.6△
6662±1797
3.4±0.5
CTX+EA
50
21.8±3.8△△
8358±2812△
4.0±0.6△△
与对照组比较**P<0.01;与CTX组比较△P<0.05，△△P<0.01
3 结果
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3.1 对CTX致学习记忆障碍小鼠的影响 与阴性对照组相比，CTX组小鼠训练和测验时跳台错误次数明显增多，测验时SDL缩短，而EL延长，说明CTX可致C57BL/6J 小鼠学习记忆障碍。两个剂量黄芪提取物对学习记忆均有改善作用，表现为跳台错误次数减少，SDL延长及EL缩短，见表1。
3.2 对CTX致免疫功能低下小鼠的影响 与阴性对照组相比较，CTX组小鼠的脾、胸腺重量下降；腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、外周血T淋巴细胞增殖反应及IFN-γ含量降低。两种剂量黄芪提取物对各项免疫指标均有程度不同的改善作用，不仅可提高脾、胸腺重量及巨噬细胞的吞噬百分率，而且可使小鼠外周血降低的T淋巴细胞增殖反应及IFN-γ含量明显升高，差异有显著性，见表2、表3。
4 讨论
衰老过程与免疫系统的关系已越来越受到人们的重视。免疫系统不仅是机体对内、外环境变化的适应和反应系统，而且与机体的老化过程密切相关，免疫功能的降低或失调均可加速机体的衰老。衰老过程发生时，免疫功能可逐渐出现减退或失调，尤以细胞免疫功能的降低出现早且表现突出。
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众所周知，CTX可明显抑制机体的免疫功能，常用于造成免疫功能低下动物模型。而我们的研究着眼点在于用CTX引起免疫抑制的同时，观察小鼠的学习记忆能力有何改变。结果发现适量CTX的应用可同时影响免疫功能及学习记忆能力，并造成免疫功能障碍及学习记忆障碍。黄芪提取物对CTX引起的学习记忆障碍及免疫功能低下有明显的改善作用，可不同程度地纠正CTX所致的小鼠学习记忆障碍，使免疫器官重量上升，免疫功能提高，血中IFN-γ含量提高，提示黄芪提取物具有改善学习记忆功能和调节免疫功能的作用。
安徽省教委资助项目。
张艳，女，38岁，副教授。
陈敏珠，女，66岁，博士生导师，教授
参考文献
1，李卫平，周爱武，郑亦文，等. 88016的免疫调节作用. 新药研究基金会报，1993；3：83
, 百拇医药
2，李卫平，王斌，陈敏珠，等. 88016对大鼠腹腔巨噬细胞产生过氧化氢的调节作用.新药研究基金会报，1993；3：77
3，王斌，郑芙林，周爱武，等. 88016的抗炎和镇痛作用.新药研究基金会报，1993；3：95
4，徐叔云，卞如濂，陈修，主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1991：659
5，许士凯,主编. 抗衰老药物学. 第1版.北京：中国医药科技出版社，1994：163
6，中华人民共和国卫生部药政局编. 免疫调节药. 见：新药(西药)临床前研究指导原则汇编，1993：128
2000-03-17 收稿，2000-04-18 修回, 百拇医药