维拉帕米对心肌细胞的毒性作用
作者：王达理 南柏松
单位：王达理(解放军第四五四医院,南京 210002)；南柏松(第四军医大学唐都医院, 西安 710038)
关键词：
中国临床药理学与治疗学000230
维拉帕米 ( verapamil, Ver )可减轻缺血心肌再灌注损伤[1]，也具有直接细胞毒性及增强抗癌药物的作用[2,3]。本实验观察不同浓度维拉帕米对培养心肌细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar 乳大鼠由第四军医大学动物实验中心提供；小牛血清由第四军医大学附属唐都医院中心实验室提供，用 Eagle(JRS USA)干粉三蒸水配制培养基；胰蛋白酶1∶250(Difco,USA)；Ver注射剂(芬兰Orion制药厂生产)；噻唑兰(Sigma)；LDH 试剂盒(Beckman,USA); 国产分析纯试剂配制 PBS液、Hang's 液。
, 百拇医药
1.2 心肌细胞培养 同文献[4]方法制备单个心肌细胞悬浮于含20%小牛血清Eagle 培养基中，24孔板每孔接种1.0 ml(含心肌细胞1×106个)静置贴壁培养。每24 h更换一次培养基，72 h 后分6 组处理，每组24 孔。
1.3 分组处理 正常对照组换入新鲜培养基，五个浓度药物组分别换入含有Ver 1.0,5.0,10.0,20.0,50.0 mg.L-1培养基后继续培养96 h。
1.4 观察指标 细胞搏动功能：细胞搏动在倒置显微镜上观察，并于分组处理结束时以Hank's液洗涤两遍再以正常培养基培养4 h，观察细胞搏动恢复情况；乳酸脱氢酶(LDH)：分组处理结束时取培养液在Beckman-700自动生化分析仪上测定；活细胞及代谢功能[4,5]：分组处理结束，吸出培养基每孔加PBS液配制的0.2%噻唑兰溶液200 μl，37 ℃静置4 h，弃液后每孔加入二甲基亚砜600 μl，震荡显色后测定540 nm处的吸光值(A540)。
, 百拇医药
表1 不同浓度的维拉帕米对心肌细胞LHD、A540的影响(
±s) 指标
正常对照组
Ver1.0
Ver5.0
Ver10.0
Ver20.0
Ver50.0
LDH
96±12
86±13*
, 百拇医药
101±12
108±20*
150±18**
337±44**
A50
0.88±0.09
0.94±0.10*
0.84±0.10
0.79±0.10*
0.63±0.09**
, 百拇医药
0.14±0.09**
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01；Ver 浓度单位为mg.L-1
2 结果
分组处理时，各组细胞搏动良好，细胞簇形成呈同心圆放散状，各簇间借伪足连接成功能合胞体，同步匀律搏动。分组处理96 h，各组细胞均停止搏动。洗涤细胞再培养4 h，正常对照组细胞恢复同步搏动，但18/24 孔细胞呈现节律失常。Ver 1.0 mg.L-1组细胞全部恢复同步搏动，4/24孔细胞搏动节律失常。5.0 mg.L-1 和10.0 mg.L-1组细胞仅部分恢复搏动且节律失常。20.0 mg.L-1 组细胞不能恢复搏动，而50.0 mg.L-1 组细胞严重坏死脱落。损伤细胞释放的LDH及活细胞代谢噻唑兰的比色值(A540)见表 1。
, http://www.100md.com
3 讨论
噻唑兰(MTT)可被活细胞摄入，经线粒体脱氢还原成紫色颗粒并能溶于二甲基亚砜，A540反映细胞存活数及代谢功能[4,5]。1.0 mg.L-1 Ver组A540 高而LDH低，表明心肌细胞存活良好，且该浓度的Ver易于洗脱，细胞能恢复良好的搏动。随Ver浓度增高， 细胞损伤有所加重， 20.0 mg.L-1以上使心肌细胞死亡明显。这可能与高浓度Ver抑制细胞DNA、RNA和蛋白质合成并直接杀伤细胞[2,3]作用有关。但实验所观察到的明显心肌细胞毒性作用浓度远大于临床所用的药物浓度。
参考文献
1，朱平，程源恩，黄立,等.异搏定加钾停搏液对心肌保护作用的实验研究. 中华医学杂志, 1988； 68:316
, http://www.100md.com
2，王楠，汤仲明，章扬培,等.维拉帕米对MDR1基因转染的Swiss-3T3细胞的化疗增敏作用.药学学报,1996；31:346
3，刘乃丰，黄元伟，楼定安. 维拉帕米抑制细胞DNA,RNA和蛋白质合成的作用. 浙江医科大学学报, 1990；19:107
4，王达理，曾爱萍，南柏松. 心肌细胞培养方法和活细胞噻唑兰法测定. 空军医高专学报，1999；21:191
5，Carmichael J,De Graff WG, Gazdar AF，et al. Evaluation of tetrzolium based semiautomated colorimetric assay.Cancer Res,1987；47：936
2000-01-20 收稿，2000-04-14 修回, 百拇医药
单位：王达理(解放军第四五四医院,南京 210002)；南柏松(第四军医大学唐都医院, 西安 710038)
关键词：
中国临床药理学与治疗学000230
维拉帕米 ( verapamil, Ver )可减轻缺血心肌再灌注损伤[1]，也具有直接细胞毒性及增强抗癌药物的作用[2,3]。本实验观察不同浓度维拉帕米对培养心肌细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 Wistar 乳大鼠由第四军医大学动物实验中心提供；小牛血清由第四军医大学附属唐都医院中心实验室提供，用 Eagle(JRS USA)干粉三蒸水配制培养基；胰蛋白酶1∶250(Difco,USA)；Ver注射剂(芬兰Orion制药厂生产)；噻唑兰(Sigma)；LDH 试剂盒(Beckman,USA); 国产分析纯试剂配制 PBS液、Hang's 液。
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1.2 心肌细胞培养 同文献[4]方法制备单个心肌细胞悬浮于含20%小牛血清Eagle 培养基中，24孔板每孔接种1.0 ml(含心肌细胞1×106个)静置贴壁培养。每24 h更换一次培养基，72 h 后分6 组处理，每组24 孔。
1.3 分组处理 正常对照组换入新鲜培养基，五个浓度药物组分别换入含有Ver 1.0,5.0,10.0,20.0,50.0 mg.L-1培养基后继续培养96 h。
1.4 观察指标 细胞搏动功能：细胞搏动在倒置显微镜上观察，并于分组处理结束时以Hank's液洗涤两遍再以正常培养基培养4 h，观察细胞搏动恢复情况；乳酸脱氢酶(LDH)：分组处理结束时取培养液在Beckman-700自动生化分析仪上测定；活细胞及代谢功能[4,5]：分组处理结束，吸出培养基每孔加PBS液配制的0.2%噻唑兰溶液200 μl，37 ℃静置4 h，弃液后每孔加入二甲基亚砜600 μl，震荡显色后测定540 nm处的吸光值(A540)。
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表1 不同浓度的维拉帕米对心肌细胞LHD、A540的影响(
±s) 指标正常对照组
Ver1.0
Ver5.0
Ver10.0
Ver20.0
Ver50.0
LDH
96±12
86±13*
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101±12
108±20*
150±18**
337±44**
A50
0.88±0.09
0.94±0.10*
0.84±0.10
0.79±0.10*
0.63±0.09**
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0.14±0.09**
与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01；Ver 浓度单位为mg.L-1
2 结果
分组处理时，各组细胞搏动良好，细胞簇形成呈同心圆放散状，各簇间借伪足连接成功能合胞体，同步匀律搏动。分组处理96 h，各组细胞均停止搏动。洗涤细胞再培养4 h，正常对照组细胞恢复同步搏动，但18/24 孔细胞呈现节律失常。Ver 1.0 mg.L-1组细胞全部恢复同步搏动，4/24孔细胞搏动节律失常。5.0 mg.L-1 和10.0 mg.L-1组细胞仅部分恢复搏动且节律失常。20.0 mg.L-1 组细胞不能恢复搏动，而50.0 mg.L-1 组细胞严重坏死脱落。损伤细胞释放的LDH及活细胞代谢噻唑兰的比色值(A540)见表 1。
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3 讨论
噻唑兰(MTT)可被活细胞摄入，经线粒体脱氢还原成紫色颗粒并能溶于二甲基亚砜，A540反映细胞存活数及代谢功能[4,5]。1.0 mg.L-1 Ver组A540 高而LDH低，表明心肌细胞存活良好，且该浓度的Ver易于洗脱，细胞能恢复良好的搏动。随Ver浓度增高， 细胞损伤有所加重， 20.0 mg.L-1以上使心肌细胞死亡明显。这可能与高浓度Ver抑制细胞DNA、RNA和蛋白质合成并直接杀伤细胞[2,3]作用有关。但实验所观察到的明显心肌细胞毒性作用浓度远大于临床所用的药物浓度。
参考文献
1，朱平，程源恩，黄立,等.异搏定加钾停搏液对心肌保护作用的实验研究. 中华医学杂志, 1988； 68:316
, http://www.100md.com
2，王楠，汤仲明，章扬培,等.维拉帕米对MDR1基因转染的Swiss-3T3细胞的化疗增敏作用.药学学报,1996；31:346
3，刘乃丰，黄元伟，楼定安. 维拉帕米抑制细胞DNA,RNA和蛋白质合成的作用. 浙江医科大学学报, 1990；19:107
4，王达理，曾爱萍，南柏松. 心肌细胞培养方法和活细胞噻唑兰法测定. 空军医高专学报，1999；21:191
5，Carmichael J,De Graff WG, Gazdar AF，et al. Evaluation of tetrzolium based semiautomated colorimetric assay.Cancer Res,1987；47：936
2000-01-20 收稿，2000-04-14 修回, 百拇医药