微乳薄层色谱用于黄酮类成分分离鉴定的研究
作者：康纯 闻莉毓 丁仲伯
单位：康纯 闻莉毓 丁仲伯(扬州市药品检验所 扬州 225009)
关键词：微乳液；展开剂；黄酮类药物；薄层色谱
药物分析杂志000218 摘要 目的：探讨微乳薄层色谱法在分离鉴定黄酮类成分中的应用。方法：以6种SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液作为展开剂，通过聚酰胺薄层层析，分离和检测14种中药材、 饮片及中成药的黄酮类成分，考察了微乳液类型、酸度等因素对分离效果的影响。结果：含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为适宜的展开剂。与常用展开剂比较，分离效果及检测灵敏度显著提高，且斑点圆而集中，Rf值高的组分亦无扩散现象。结论：建立了一种新型的色谱技术，可以简便、准确、高效地分离和鉴定芦丁、槲皮素、黄芩苷等黄酮类成分。
Studies on Separation and Identification of Flavonoid
, http://www.100md.com
Compositions with Microemulsion Thin Layer Chromatography
Kang Chun,Wen Liyu and Ding Zhongbo
(Yangzhou Institute for Drug Control,Yangzhou 225009)
Abstract Objective：To investigate the use of microemulsion TLC on the separation and identification of flavonoid drugs.Methods:Fourteen kinds of flavonoid drugs were separated and identified by six kinds of SDS/n-C4H9 OH/n-C7H16/H2O microemulsions as mobile phase on polyamide film TLC.Affection on separation by the kinds of microemulsions and acidity were investigated.Results:The best mobile phase was the O/W microemulsion(containing 75% water)-formic acid(9.5∶0.5).Compared with general mobile phases, the spot effects of microemulsion mobile phase could be improved.Conclusion:This new method is simple,accurate and efficient for the separation and identification of flavonoid drugs.
, 百拇医药
Key words microemulsion,mobile phase,flavonoid drugs,thin layer chromatography
薄层色谱法是药物分析中广为应用的经典方法，展开剂多为有机溶剂。近年来，胶束薄层色谱已有研究，但以微乳液为流动相，用薄层层析来分离和鉴定药物的有效成分尚未见报道。微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发生成的无色透明、各向同性、低粘度的热力学稳定体系，与胶束体系皆属缔和胶体，但在基本特性上存在着明显的差别。微乳体系与胶束体系相比，具有更大的增溶量(增溶量：胶束体系5%～20%，微乳体系60%～70%) 和超低界面张力[界面张力(mN。m-1)：油水界面72，胶束体系20，微乳体系10-2～10-4][1]。微乳体系的以上优势更有利于提高色谱的效率。本文继微乳液在生物碱薄层色谱中的应用研究(另文发表)之后，对中药中广泛存在的有效成分黄酮化合物的微乳薄层色谱进行了研究。以含水量不同，具有油包水(W/O)型、双连续型(W/O～O/W) 及水包油(O/W)型的6种SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液为流动相，研究了芦丁、槲皮素和黄芩苷的微乳薄层色谱行为，并选择了含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为展开剂，聚酰胺薄膜为固定相，对槐米、黄芩等7种中药材及中药饮片，复方芦丁片、双黄连口服液等7种中成药进行了分离和鉴定,得到了理想的结果。
, http://www.100md.com
1 仪器与试药
UV-8型三用紫外分析仪(上海分析仪器厂)；层析用聚酰胺薄膜(台州路桥四青生化材料厂)；点样用定量毛细管(上海东方药品科技实业有限公司)；P-1型层析玻璃缸(上海信谊仪器厂)。
对照品：芦丁、槲皮素、黄芩苷(中国药品生物制品检定所)。样品：槐花、槐米(江苏)，黄芩(内蒙)，槐角(安徽)，炒槐米、槐角炭、酒黄芩(扬州中药饮片厂)，复方芦丁片(宁波制药厂)，银黄片、银黄口服液(山东鲁南制药厂)，牛黄解毒片(连云港康缘制药有限公司)，防风通圣丸(苏州雷允上制药厂)，清热解毒口服液( 扬州第三制药厂)，双黄连口服液(山西康宝生物制品股份有限公司)。样品中的中药材及中药饮片经李炳根主任药师鉴定。
十二烷基硫酸钠(SDS) 为上海化学试剂采购供应站日本进口分装，其它试剂均为分析纯。
2 溶液配制
, 百拇医药
2.1 微乳液展开剂的配制 在保证SDS-正丁醇-正庚烷为0.27∶0.63∶0.10(重量比)的条件下，改变水量，配制系列微乳液。 按上述重量比取SDS、正丁醇、正庚烷，加适量水搅拌溶解， 然后加水至足量,混匀,放置24 h即可。6种微乳液的成分配比及结构见表1。
表1 微乳液的成分配比及结构(总量：100 g) 含水
量/%
成分配比
微乳结构[2]
十二烷基硫酸钠
(表面活性剂)
正丁醇
(助表面
, 百拇医药
活性剂)
正庚烷
(油)
重蒸
馏水
(水)
15
22.9
53.6
8.5
15.0
W/O型
30
, http://www.100md.com
18.9
44.1
7.0
30.0
W/O型
45
14.8
34.7
5.5
45.0
W/O～O/W型
60
10.8
, http://www.100md.com
25.2
4.0
60.0
W/O～O/W型
75
6.7
15.8
2.5
75.0
O/W型
90
2.7
6.3
, http://www.100md.com
1.0
90.0
O/W型
2.2 对照品溶液的配制 称取对照品适量，分别配制成含芦丁2 mg。mL-1、槲皮素0.5 mg。mL-1、黄芩苷0.5 mg。mL-1的甲醇溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的配制 中药材及饮片粉末各称取0.5 g、 固体中成药粉末称取适量(各相当于槐米或黄芩药材0.5 g )， 各加甲醇5 mL，超声振荡提取30 min，滤过；口服液取适量，滤过，滤液作为供试品溶液。
2.1 阴性对照溶液配制 按各中成药的处方比例制备阴性对照样品，依照供试溶液的配制方法，配制各中成药的阴性对照溶液。
, http://www.100md.com
3 实验方法与结果
3.1 薄层层析 用定量毛细管吸取对照品溶液、 供试品溶液及阴性对照溶液各1～2 μL，于聚酰胺薄膜上点样,以上述各微乳液为展开剂,于室温上行法展开。 待展程约 10 cm, 取出晾干 , 均匀喷洒1% 氯化铝乙醇溶液，晾干后，置紫外光(365 nm)下检视。
3.2 展开剂的选择 由各薄层色谱可见，黄酮对照品的Rf 值随微乳液中水量的增大略有下降，而供试品的分离效果随水量的增大而显著改善。在含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)的色谱中，对照品Rf值适中(芦丁为0.64，黄芩苷为0.54，槲皮素为0.06 但能清楚辨认检出)，供试品黄酮斑点及其它成分的斑点得以完全分离。 供试品色谱所显主斑点的位置和荧光颜色与对照品相同。本文选用上述微乳体系作为展开剂。
3.3 层析结果 以含水量75%微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为展开系统，槐米类药物薄层色谱图如图1，黄芩类药物色谱图如图2。
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图1 槐米类药物薄层色谱图
1.芦丁对照品 2.槲皮素对照品 3.槐花
4.槐米 5.炒槐米 6.槐角 7.槐角炭
8.复方芦丁片 8′.复方芦丁片阴性对照
3.4 与常用展开剂系统分离效果的比较 本实验所选择的微乳展开系统与药品标准及文献报道方法分离效果的比较见表2。
4 讨论
4.1 根据胶束色谱理论[7，8]， 当流动相中存在胶束及两性表面活性剂，展开系统即具增溶、降低界面张力作用，并且因静电、疏水及立体等效应，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质，对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离差别很小的物质。微乳液与胶束同属低粘度的缔和胶体，且与胶束相比，具有更大的增溶量和超低界面张力，更有利于提高色谱效率。在O/W微乳色谱中，溶质的分配可能是在固定相、 微乳液的水连续相及油核和界面膜数相之间进行。由于微乳液的富集增溶作用，极性大的分子分配于微乳水连续相中，极性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性剂与助表面活性剂组成的膜栅栏中。由于分配、吸附、静电、疏水、立体等可能的效应，供试品中各组分在微乳液中展开时迁移速度不同，而使结构和性质差别细微的复杂组分得以较理想地分离。
, 百拇医药
图2 黄芩类药物薄层色谱图
1.黄芩苷对照品 2.黄芩 3.酒黄芩 4.银黄片 5.银黄口服液
6.牛黄解毒片 7.防风通圣丸 8.清热解毒口服液
9.双黄连口服液 4′～9′. 4～9的阴性对照
表2 微乳展开系统与黄酮类成分
常用展开系统分离效果的比较 序号
品名
薄层色谱中分离出的斑点数(n=3)
药品质量标准
方法[3，4]
, 百拇医药
文献报道
方法[5，6]
本法
1
槐花
2
4
16
2
槐米
2
4
17
, http://www.100md.com
3
炒槐米
2
2
15
4
槐角
无此项目
6
17
5
槐角炭
无此项目
5
, 百拇医药
14
6
复方芦丁片
无此项目
3
8
7
黄芩
无此项目
9
18
8
酒黄芩
无此项目
, 百拇医药
9
17
9
银黄片
无此项目
9
13
10
银黄口服液
无此项目
9
12
11
牛黄解毒片
, 百拇医药
无此项目
3
13
12
防风通圣丸
无此项目
6
17
13
清热解毒口服液
无此项目
5
13
, 百拇医药
14
双黄连口服液
8
-
14
4.3 实验结果表明，以W/O型微乳液为展开剂，供试品色谱中斑点不规则且分离效果不好；以油水双连续型微乳液为展开剂，层析结果有所改善；以O/W型微乳液为展开剂， 供试品中众多的组分达到完全分离，且斑点规则集中。由于含水量90%的微乳液极性太大，槲皮素对照品的Rf值过低而选择含水量75%的O/W型微乳液。 黄酮分子中多有酚羟基，调节展开系统为酸性更有利于其层析。未加甲酸时，有少量斑点拖尾，加甲酸后，有效地抑制了拖尾现象。甲酸浓度为5%与10%结果基本一致，本实验选择加入体积分数为5%的甲酸。此外，实验结果还表明，温度(室温)和湿度对本法的薄层色谱无显著影响。
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4.4 以本法微乳液展开剂与药品标准或文献报道的展开系统比较，分离效果显著提高，能分离的斑点数大大增加，而且斑点清晰，圆而集中，不拖尾，Rf值大于0.8的组分斑点不扩散，Rf值小于0.2的组分仍能清楚辨认。此外，与常用展开剂相比，微乳液使斑点的荧光强度得到肯定的增强，因而检测的灵敏度也得以提高。
4.5 本研究以微乳液作为一种全新的色谱流动相，成功地用于14种中药的分离鉴定，操作简便，分离效果理想，检出灵敏。部分含黄酮类有效成分中成药的质量标准中，因处方组成复杂，检出困难而无此鉴别。本研究建立了一种新型的色谱技术，为分离鉴定黄酮类药物提供了一种简便、准确、高效的分析方法，并为薄层色谱定量分析提供了较理想的分离手段。
江苏省“333”工程科研基金资助项目
参考文献
1，李干佐，郭荣.微乳液理论及其应用.北京：石油工业出版社，1995.59
, 百拇医药
2，郭荣，朱霞石. 微乳液介质中硫氰酸铁的分光光度测定.高等学校化学学报， 1987, 8(6):508
3，中国药典. 1995. 一部：270，311，312，440，594，604
4，卫生部药品标准.WS1-68(B)-89，WS3-136(Z-42)-96(Z)
5，刘训红，王玉玺，房克慧等.中药材薄层色谱鉴别. 天津：天津科学技术出版社，1990.181，311，328，389
6，吕武清，龙新华.中成药中的药材薄层色谱鉴别. 北京：人民卫生出版社，1997.457，459，461，465，466
7，戈早川，林辉概，李志良.胶束色谱与包合色谱的概况与进展.分析化学，1991，19(9):1092
8，Armotrong DW，Nome F.Selectivity in pseudophase liquid chromatography.Anal Chem,1983,55:2317
(本文于1999年5月11日收到), 百拇医药
单位：康纯 闻莉毓 丁仲伯(扬州市药品检验所 扬州 225009)
关键词：微乳液；展开剂；黄酮类药物；薄层色谱
药物分析杂志000218 摘要 目的：探讨微乳薄层色谱法在分离鉴定黄酮类成分中的应用。方法：以6种SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液作为展开剂，通过聚酰胺薄层层析，分离和检测14种中药材、 饮片及中成药的黄酮类成分，考察了微乳液类型、酸度等因素对分离效果的影响。结果：含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为适宜的展开剂。与常用展开剂比较，分离效果及检测灵敏度显著提高，且斑点圆而集中，Rf值高的组分亦无扩散现象。结论：建立了一种新型的色谱技术，可以简便、准确、高效地分离和鉴定芦丁、槲皮素、黄芩苷等黄酮类成分。
Studies on Separation and Identification of Flavonoid
, http://www.100md.com
Compositions with Microemulsion Thin Layer Chromatography
Kang Chun,Wen Liyu and Ding Zhongbo
(Yangzhou Institute for Drug Control,Yangzhou 225009)
Abstract Objective：To investigate the use of microemulsion TLC on the separation and identification of flavonoid drugs.Methods:Fourteen kinds of flavonoid drugs were separated and identified by six kinds of SDS/n-C4H9 OH/n-C7H16/H2O microemulsions as mobile phase on polyamide film TLC.Affection on separation by the kinds of microemulsions and acidity were investigated.Results:The best mobile phase was the O/W microemulsion(containing 75% water)-formic acid(9.5∶0.5).Compared with general mobile phases, the spot effects of microemulsion mobile phase could be improved.Conclusion:This new method is simple,accurate and efficient for the separation and identification of flavonoid drugs.
, 百拇医药
Key words microemulsion,mobile phase,flavonoid drugs,thin layer chromatography
薄层色谱法是药物分析中广为应用的经典方法，展开剂多为有机溶剂。近年来，胶束薄层色谱已有研究，但以微乳液为流动相，用薄层层析来分离和鉴定药物的有效成分尚未见报道。微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发生成的无色透明、各向同性、低粘度的热力学稳定体系，与胶束体系皆属缔和胶体，但在基本特性上存在着明显的差别。微乳体系与胶束体系相比，具有更大的增溶量(增溶量：胶束体系5%～20%，微乳体系60%～70%) 和超低界面张力[界面张力(mN。m-1)：油水界面72，胶束体系20，微乳体系10-2～10-4][1]。微乳体系的以上优势更有利于提高色谱的效率。本文继微乳液在生物碱薄层色谱中的应用研究(另文发表)之后，对中药中广泛存在的有效成分黄酮化合物的微乳薄层色谱进行了研究。以含水量不同，具有油包水(W/O)型、双连续型(W/O～O/W) 及水包油(O/W)型的6种SDS-正丁醇-正庚烷-水微乳液为流动相，研究了芦丁、槲皮素和黄芩苷的微乳薄层色谱行为，并选择了含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为展开剂，聚酰胺薄膜为固定相，对槐米、黄芩等7种中药材及中药饮片，复方芦丁片、双黄连口服液等7种中成药进行了分离和鉴定,得到了理想的结果。
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1 仪器与试药
UV-8型三用紫外分析仪(上海分析仪器厂)；层析用聚酰胺薄膜(台州路桥四青生化材料厂)；点样用定量毛细管(上海东方药品科技实业有限公司)；P-1型层析玻璃缸(上海信谊仪器厂)。
对照品：芦丁、槲皮素、黄芩苷(中国药品生物制品检定所)。样品：槐花、槐米(江苏)，黄芩(内蒙)，槐角(安徽)，炒槐米、槐角炭、酒黄芩(扬州中药饮片厂)，复方芦丁片(宁波制药厂)，银黄片、银黄口服液(山东鲁南制药厂)，牛黄解毒片(连云港康缘制药有限公司)，防风通圣丸(苏州雷允上制药厂)，清热解毒口服液( 扬州第三制药厂)，双黄连口服液(山西康宝生物制品股份有限公司)。样品中的中药材及中药饮片经李炳根主任药师鉴定。
十二烷基硫酸钠(SDS) 为上海化学试剂采购供应站日本进口分装，其它试剂均为分析纯。
2 溶液配制
, 百拇医药
2.1 微乳液展开剂的配制 在保证SDS-正丁醇-正庚烷为0.27∶0.63∶0.10(重量比)的条件下，改变水量，配制系列微乳液。 按上述重量比取SDS、正丁醇、正庚烷，加适量水搅拌溶解， 然后加水至足量,混匀,放置24 h即可。6种微乳液的成分配比及结构见表1。
表1 微乳液的成分配比及结构(总量：100 g) 含水
量/%
成分配比
微乳结构[2]
十二烷基硫酸钠
(表面活性剂)
正丁醇
(助表面
, 百拇医药
活性剂)
正庚烷
(油)
重蒸
馏水
(水)
15
22.9
53.6
8.5
15.0
W/O型
30
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18.9
44.1
7.0
30.0
W/O型
45
14.8
34.7
5.5
45.0
W/O～O/W型
60
10.8
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25.2
4.0
60.0
W/O～O/W型
75
6.7
15.8
2.5
75.0
O/W型
90
2.7
6.3
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1.0
90.0
O/W型
2.2 对照品溶液的配制 称取对照品适量，分别配制成含芦丁2 mg。mL-1、槲皮素0.5 mg。mL-1、黄芩苷0.5 mg。mL-1的甲醇溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的配制 中药材及饮片粉末各称取0.5 g、 固体中成药粉末称取适量(各相当于槐米或黄芩药材0.5 g )， 各加甲醇5 mL，超声振荡提取30 min，滤过；口服液取适量，滤过，滤液作为供试品溶液。
2.1 阴性对照溶液配制 按各中成药的处方比例制备阴性对照样品，依照供试溶液的配制方法，配制各中成药的阴性对照溶液。
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3 实验方法与结果
3.1 薄层层析 用定量毛细管吸取对照品溶液、 供试品溶液及阴性对照溶液各1～2 μL，于聚酰胺薄膜上点样,以上述各微乳液为展开剂,于室温上行法展开。 待展程约 10 cm, 取出晾干 , 均匀喷洒1% 氯化铝乙醇溶液，晾干后，置紫外光(365 nm)下检视。
3.2 展开剂的选择 由各薄层色谱可见，黄酮对照品的Rf 值随微乳液中水量的增大略有下降，而供试品的分离效果随水量的增大而显著改善。在含水量75%(O/W型)微乳液-甲酸(9.5∶0.5)的色谱中，对照品Rf值适中(芦丁为0.64，黄芩苷为0.54，槲皮素为0.06 但能清楚辨认检出)，供试品黄酮斑点及其它成分的斑点得以完全分离。 供试品色谱所显主斑点的位置和荧光颜色与对照品相同。本文选用上述微乳体系作为展开剂。
3.3 层析结果 以含水量75%微乳液-甲酸(9.5∶0.5)为展开系统，槐米类药物薄层色谱图如图1，黄芩类药物色谱图如图2。
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图1 槐米类药物薄层色谱图
1.芦丁对照品 2.槲皮素对照品 3.槐花
4.槐米 5.炒槐米 6.槐角 7.槐角炭
8.复方芦丁片 8′.复方芦丁片阴性对照
3.4 与常用展开剂系统分离效果的比较 本实验所选择的微乳展开系统与药品标准及文献报道方法分离效果的比较见表2。
4 讨论
4.1 根据胶束色谱理论[7，8]， 当流动相中存在胶束及两性表面活性剂，展开系统即具增溶、降低界面张力作用，并且因静电、疏水及立体等效应，使其具有独特的选择性，可同时分离亲水物质和疏水物质，对带电成分和非带电成分亦有较好的分离选择，适用于分离差别很小的物质。微乳液与胶束同属低粘度的缔和胶体，且与胶束相比，具有更大的增溶量和超低界面张力，更有利于提高色谱效率。在O/W微乳色谱中，溶质的分配可能是在固定相、 微乳液的水连续相及油核和界面膜数相之间进行。由于微乳液的富集增溶作用，极性大的分子分配于微乳水连续相中，极性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性剂与助表面活性剂组成的膜栅栏中。由于分配、吸附、静电、疏水、立体等可能的效应，供试品中各组分在微乳液中展开时迁移速度不同，而使结构和性质差别细微的复杂组分得以较理想地分离。
, 百拇医药
图2 黄芩类药物薄层色谱图
1.黄芩苷对照品 2.黄芩 3.酒黄芩 4.银黄片 5.银黄口服液
6.牛黄解毒片 7.防风通圣丸 8.清热解毒口服液
9.双黄连口服液 4′～9′. 4～9的阴性对照
表2 微乳展开系统与黄酮类成分
常用展开系统分离效果的比较 序号
品名
薄层色谱中分离出的斑点数(n=3)
药品质量标准
方法[3，4]
, 百拇医药
文献报道
方法[5，6]
本法
1
槐花
2
4
16
2
槐米
2
4
17
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3
炒槐米
2
2
15
4
槐角
无此项目
6
17
5
槐角炭
无此项目
5
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14
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复方芦丁片
无此项目
3
8
7
黄芩
无此项目
9
18
8
酒黄芩
无此项目
, 百拇医药
9
17
9
银黄片
无此项目
9
13
10
银黄口服液
无此项目
9
12
11
牛黄解毒片
, 百拇医药
无此项目
3
13
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防风通圣丸
无此项目
6
17
13
清热解毒口服液
无此项目
5
13
, 百拇医药
14
双黄连口服液
8
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14
4.3 实验结果表明，以W/O型微乳液为展开剂，供试品色谱中斑点不规则且分离效果不好；以油水双连续型微乳液为展开剂，层析结果有所改善；以O/W型微乳液为展开剂， 供试品中众多的组分达到完全分离，且斑点规则集中。由于含水量90%的微乳液极性太大，槲皮素对照品的Rf值过低而选择含水量75%的O/W型微乳液。 黄酮分子中多有酚羟基，调节展开系统为酸性更有利于其层析。未加甲酸时，有少量斑点拖尾，加甲酸后，有效地抑制了拖尾现象。甲酸浓度为5%与10%结果基本一致，本实验选择加入体积分数为5%的甲酸。此外，实验结果还表明，温度(室温)和湿度对本法的薄层色谱无显著影响。
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4.4 以本法微乳液展开剂与药品标准或文献报道的展开系统比较，分离效果显著提高，能分离的斑点数大大增加，而且斑点清晰，圆而集中，不拖尾，Rf值大于0.8的组分斑点不扩散，Rf值小于0.2的组分仍能清楚辨认。此外，与常用展开剂相比，微乳液使斑点的荧光强度得到肯定的增强，因而检测的灵敏度也得以提高。
4.5 本研究以微乳液作为一种全新的色谱流动相，成功地用于14种中药的分离鉴定，操作简便，分离效果理想，检出灵敏。部分含黄酮类有效成分中成药的质量标准中，因处方组成复杂，检出困难而无此鉴别。本研究建立了一种新型的色谱技术，为分离鉴定黄酮类药物提供了一种简便、准确、高效的分析方法，并为薄层色谱定量分析提供了较理想的分离手段。
江苏省“333”工程科研基金资助项目
参考文献
1，李干佐，郭荣.微乳液理论及其应用.北京：石油工业出版社，1995.59
, 百拇医药
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(本文于1999年5月11日收到), 百拇医药