RP-HPLC法测定贯叶连翘片剂中有效成分金丝桃素和金丝桃苷的含量
作者：王峰 高天兵 田金改
单位：王峰 高天兵 田金改(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：贯叶连翘；金丝桃素；金丝桃苷；RP-HPLC
药物分析杂志000210 摘要 目的：采用RP-HPLC法测定贯叶连翘片剂中有效成分金丝桃素(hypericin)和金丝桃苷(hyperoside)的含量。方法：分别使用ODS和ODS-2色谱柱，流动相分别是1.56 %磷酸二氢钠(用磷酸调pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)及甲醇-0.5%磷酸(45∶55，用三乙胺调pH至3.0)，检测波长分别为590 nm，360 nm。结果：加样回收率分别为98.32%(n=5),96.04%(n=5)。金丝桃素的进样量为0.009 8～0.16 μg、金丝桃苷的进样量为0.43～3.42 μg时，线性关系良好。结论：本方法有良好的重现性及精密度。
, 百拇医药
Determination of Effective Compounds Hypericin and Hyperoside in Hypericum perforatum Tablets by RP-HPLC
Wang Feng, Gao Tianbing and Tian Jingai
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijin 100050)
Abstract Objective：To determine hypericin and hyperoside, which are two effective constituents of Hypericum perforatum by RP-HPLC.Method:Hypericin and hyperoside were separated by ODS column with 1.56 % sodium dihydrogen phosphate (adjusted to pH=2.1 with phosphoric acid)-methanol-ethyl acetate(1∶4∶1) as mobile phase and ODS-2 column with methanol-0.5% phosphoric acid(45∶55，adjusted to pH=3.0 with triethylamine) as mobile phase, and detected with UV/ vis at 590 nm and 360 nm respectively.Result:The linear ranges of hypericin and hyperoside were 0.009 8～0.16 μg and 0.43～3.42 μg, respectively. The recoveries of them were 98.32% (n=5) and 96.04% (n=5), respectively.Conclusion:These methods had good reproducibility and sensitivity.
, 百拇医药
Key words Hypericum perforatum L., hypericin, hyperoside, RP-HPLC
贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)含有金丝桃苷(Hyperoside)、槲皮素、槲皮苷、绿原酸、咖啡酸、衣马宁(Imanin)、金丝桃素(Hypericin)等成分，传统理论认为其有清热解毒、收敛止血、利尿等功效，现代药理学研究证实有收缩血管、升高血压、利胆、抗菌、驱虫等作用，其中金丝桃素类成分还具有治疗精神抑郁的作用[1]，而近年来的研究结果进一步表明，金丝桃素对于爱滋病、肿瘤等亦有一定的治疗作用[2～4]。李星海等[5]报道了用薄层-紫外分光光度法测定3种金丝桃属植物中金丝桃苷的含量，沙明等[6]报道了采用HPLC法测定朝鲜淫羊藿中金丝桃苷的含量；Micali等[7,8]分别报道金丝桃素的测定方法；但未见采用HPLC法测定天然药物制剂中金丝桃素含量的报道。本文建立了用RP-HPLC法测定贯叶连翘片剂中有效成分金丝桃素和金丝桃苷含量，分离效果好，方法快速准确，重现性好。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
PE 200高效液相色谱仪，PE LC-295紫外可见检测器。
金丝桃素对照品(由德国Willmar Schwabe公司提供，纯度>98%)，金丝桃苷对照品(德国Carl Both公司，纯度>98%)，甲醇、醋酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸、三乙胺等均为分析纯(北京化工厂)。
样品由德国Willmar Schwabe公司提供，每粒300 mg。
2 色谱条件
2.1 金丝桃素 色谱柱：Inerteil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：1.56%磷酸二氢钠(用磷酸调pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)，流速：1 mL。min-1；检测波长：590 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。色谱图见图1。
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图1 金丝桃素对照品(A)及样品(B)色谱图
1.金丝桃素(9.36 min)
2.2 金丝桃苷 色谱柱：Inerteil ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5 %磷酸(45∶55，用三乙胺调pH至3.0)，流速：1 mL.min-1；检测波长：360 nm，柱温：35 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图2。
图2 金丝桃苷对照品(A)及样品(B)色谱图
1.金丝桃苷(8.95 min)
3 线性关系
, 百拇医药 精密称取金丝桃素对照品2.5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液0，1，2，4，8，12，16 mL，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μL，测定，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为：
Y=-1 345.2+2 639 612.0 X r=0.999 9
说明金丝桃素的进样量在0.009 8～0.16 μg范围内呈良好线性。
精密称取金丝桃苷对照品10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液1，2，4，6，8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10 μL，测定，求得回归方程为：
Y=-30 822.0+2 343 235.8X r=0.999 9
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说明金丝桃苷的进样量在0.43～3.42 μg范围内呈良好线性。
4 回收率试验
取样品0.05 g，精密称定，精密加入4.88 μg.mL-1金丝桃素对照品溶液3.0 mL，金丝桃苷对照品1 mg，其余操作同样品测定，测定回收率(n=5)。测得金丝桃素、金丝桃苷的平均回收率分别为98.32%、96.04%，RSD分别为1.4%，1.2%。说明2种成分互不干扰。
5 精密度试验
分别精密吸取9.76 μg.mL-1金丝桃素对照品溶液20 μL，0.214 mg.mL-1金丝桃苷对照品溶液10 μL，连续进样5次，测得峰面积，结果金丝桃素和金丝桃苷的RSD分别为0.71%和1.2%。
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6 重现性试验
取同一份样品，按样品测定方法分别制备5份样品溶液，分别在各自的色谱条件下测定含量。结果金丝桃素和金丝桃苷的RSD分别为1.2 %和2.2 %。
7 样品测定
取样品研细，精密称取0.1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理10 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，置室内放置2 h，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，分别在各自的色谱条件下测定(n=6)。结果见表1。
8 讨论
8.1 检测波长的选择 据文献报道[9]，金丝桃素在284，331，375，473，508.5，548，590 nm处均有吸收。其中590 nm处为最大吸收；金丝桃苷在256(257)，358(361)nm处均有吸收。经试验结果证明金丝桃素在590 nm处、金丝桃苷在360 nm处测得样品干扰较少，且分离效果良好，故选用此波长。
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表1 样品测定结果(n=6) 样品
金丝桃素
金丝桃苷
含量/mg.g-1
RSD/%
含量/mg.g-1
RSD/%
1
0.18
0.21
46.58
, 百拇医药
0.5
2
0.46
1.7
28.76
1.6
3
0.34
0.38
36.11
1.4
8.2 稳定性试验
8.2.1 光稳定性试验 实验中发现，光照对样品溶液中金丝桃素含量有一定的影响，因此将新制备的样品溶液分别置日光及室内自然光下放置0，0.5，1，1.5，2 h，测定，结果表明见光放置1.5 h后，金丝桃素峰面积基本稳定。
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8.2.2 热稳定性试验 为考察温度对金丝桃素的影响，将样品室温下测定及置50，70，90 ℃水浴中加热1 h，试验过程中注意避光，放置室温后测定，结果表明温度对金丝桃素影响不大。
8.3 提取时间的选择 实验中，分别将样品超声处理5，10，15，20，30 min，分别在各自的色谱条件下测定金丝桃苷和金丝桃素含量。结果表明，超声处理10 min后，金丝桃苷和金丝桃素基本提取完全。
8.4 普通ODS柱与ODS-2柱不同之处在于，普通ODS柱所用填料含有较多的自由硅醇基团，易与呈酸碱性的化合物发生作用，而ODS-2则为采用封尾技术，自由硅醇基团水平极低的填料，基本不与呈酸碱性的化合物发生作用，使呈酸碱性的化合物能够得到理想的峰形。
参考文献
1，江苏新医学院. 中药大辞典. 上海：上海科技出版社, 1986. 1448
, http://www.100md.com
2，Vlietinck AJ, De Bruyne, Apers S, et al. Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med, 1998, 64(2)：97
3，赵晶，张致平，陈鸿珊. 金丝桃素和乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷逆转录酶的抑制活性. 药学学报， 1998, 33(1)：67
4，Vander Werf QM, Saxton RE, Chang A, et al. Hypericin：a new laser phototargeting agent for human cancer cells. Laryngoscope, 1996, 106(4)：479
5，李星海，王军宪，唐有明. 秦岭三种金丝桃属植物中金丝桃苷的含量测定. 西北药学杂志， 1994, 9(1)：18
, 百拇医药
6，沙明，曹爱民，杨松松. 高效液相色谱法测定朝鲜淫羊藿中金丝桃苷的含量. 中国中药杂志， 1995, 20(6)：357
7，Micali G, Lanuzza F, Gurro P. High-performance liquid chromatographic determination of the biologically active principle hypericin in phytotherapeutic vegetable extracts and alcoholic beverages. J Chromatogr A, 1996, 731(1-2):336
8，Liebes L, Mazur R, Freeman D, et al. A method for the quantitation of Hypericin, an antiviral agent, in biological fluids by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 1991, 195(1)：77
9，国家医药管理局中草药情报中心站. 植物药有效成分手册. 北京：人民卫生出版社，1986. 596
(本文于1998年12月29日收到), 百拇医药
单位：王峰 高天兵 田金改(中国药品生物制品检定所 北京 100050)
关键词：贯叶连翘；金丝桃素；金丝桃苷；RP-HPLC
药物分析杂志000210 摘要 目的：采用RP-HPLC法测定贯叶连翘片剂中有效成分金丝桃素(hypericin)和金丝桃苷(hyperoside)的含量。方法：分别使用ODS和ODS-2色谱柱，流动相分别是1.56 %磷酸二氢钠(用磷酸调pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)及甲醇-0.5%磷酸(45∶55，用三乙胺调pH至3.0)，检测波长分别为590 nm，360 nm。结果：加样回收率分别为98.32%(n=5),96.04%(n=5)。金丝桃素的进样量为0.009 8～0.16 μg、金丝桃苷的进样量为0.43～3.42 μg时，线性关系良好。结论：本方法有良好的重现性及精密度。
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Determination of Effective Compounds Hypericin and Hyperoside in Hypericum perforatum Tablets by RP-HPLC
Wang Feng, Gao Tianbing and Tian Jingai
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijin 100050)
Abstract Objective：To determine hypericin and hyperoside, which are two effective constituents of Hypericum perforatum by RP-HPLC.Method:Hypericin and hyperoside were separated by ODS column with 1.56 % sodium dihydrogen phosphate (adjusted to pH=2.1 with phosphoric acid)-methanol-ethyl acetate(1∶4∶1) as mobile phase and ODS-2 column with methanol-0.5% phosphoric acid(45∶55，adjusted to pH=3.0 with triethylamine) as mobile phase, and detected with UV/ vis at 590 nm and 360 nm respectively.Result:The linear ranges of hypericin and hyperoside were 0.009 8～0.16 μg and 0.43～3.42 μg, respectively. The recoveries of them were 98.32% (n=5) and 96.04% (n=5), respectively.Conclusion:These methods had good reproducibility and sensitivity.
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Key words Hypericum perforatum L., hypericin, hyperoside, RP-HPLC
贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)含有金丝桃苷(Hyperoside)、槲皮素、槲皮苷、绿原酸、咖啡酸、衣马宁(Imanin)、金丝桃素(Hypericin)等成分，传统理论认为其有清热解毒、收敛止血、利尿等功效，现代药理学研究证实有收缩血管、升高血压、利胆、抗菌、驱虫等作用，其中金丝桃素类成分还具有治疗精神抑郁的作用[1]，而近年来的研究结果进一步表明，金丝桃素对于爱滋病、肿瘤等亦有一定的治疗作用[2～4]。李星海等[5]报道了用薄层-紫外分光光度法测定3种金丝桃属植物中金丝桃苷的含量，沙明等[6]报道了采用HPLC法测定朝鲜淫羊藿中金丝桃苷的含量；Micali等[7,8]分别报道金丝桃素的测定方法；但未见采用HPLC法测定天然药物制剂中金丝桃素含量的报道。本文建立了用RP-HPLC法测定贯叶连翘片剂中有效成分金丝桃素和金丝桃苷含量，分离效果好，方法快速准确，重现性好。
, 百拇医药
1 仪器与试剂
PE 200高效液相色谱仪，PE LC-295紫外可见检测器。
金丝桃素对照品(由德国Willmar Schwabe公司提供，纯度>98%)，金丝桃苷对照品(德国Carl Both公司，纯度>98%)，甲醇、醋酸乙酯、磷酸二氢钠、磷酸、三乙胺等均为分析纯(北京化工厂)。
样品由德国Willmar Schwabe公司提供，每粒300 mg。
2 色谱条件
2.1 金丝桃素 色谱柱：Inerteil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：1.56%磷酸二氢钠(用磷酸调pH至2.1)-甲醇-醋酸乙酯(1∶4∶1)，流速：1 mL。min-1；检测波长：590 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。色谱图见图1。
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图1 金丝桃素对照品(A)及样品(B)色谱图
1.金丝桃素(9.36 min)
2.2 金丝桃苷 色谱柱：Inerteil ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.5 %磷酸(45∶55，用三乙胺调pH至3.0)，流速：1 mL.min-1；检测波长：360 nm，柱温：35 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图2。
图2 金丝桃苷对照品(A)及样品(B)色谱图
1.金丝桃苷(8.95 min)
3 线性关系
, 百拇医药 精密称取金丝桃素对照品2.5 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液0，1，2，4，8，12，16 mL，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20 μL，测定，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程为：
Y=-1 345.2+2 639 612.0 X r=0.999 9
说明金丝桃素的进样量在0.009 8～0.16 μg范围内呈良好线性。
精密称取金丝桃苷对照品10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取此溶液1，2，4，6，8 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10 μL，测定，求得回归方程为：
Y=-30 822.0+2 343 235.8X r=0.999 9
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说明金丝桃苷的进样量在0.43～3.42 μg范围内呈良好线性。
4 回收率试验
取样品0.05 g，精密称定，精密加入4.88 μg.mL-1金丝桃素对照品溶液3.0 mL，金丝桃苷对照品1 mg，其余操作同样品测定，测定回收率(n=5)。测得金丝桃素、金丝桃苷的平均回收率分别为98.32%、96.04%，RSD分别为1.4%，1.2%。说明2种成分互不干扰。
5 精密度试验
分别精密吸取9.76 μg.mL-1金丝桃素对照品溶液20 μL，0.214 mg.mL-1金丝桃苷对照品溶液10 μL，连续进样5次，测得峰面积，结果金丝桃素和金丝桃苷的RSD分别为0.71%和1.2%。
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6 重现性试验
取同一份样品，按样品测定方法分别制备5份样品溶液，分别在各自的色谱条件下测定含量。结果金丝桃素和金丝桃苷的RSD分别为1.2 %和2.2 %。
7 样品测定
取样品研细，精密称取0.1 g，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理10 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，置室内放置2 h，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，分别在各自的色谱条件下测定(n=6)。结果见表1。
8 讨论
8.1 检测波长的选择 据文献报道[9]，金丝桃素在284，331，375，473，508.5，548，590 nm处均有吸收。其中590 nm处为最大吸收；金丝桃苷在256(257)，358(361)nm处均有吸收。经试验结果证明金丝桃素在590 nm处、金丝桃苷在360 nm处测得样品干扰较少，且分离效果良好，故选用此波长。
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表1 样品测定结果(n=6) 样品
金丝桃素
金丝桃苷
含量/mg.g-1
RSD/%
含量/mg.g-1
RSD/%
1
0.18
0.21
46.58
, 百拇医药
0.5
2
0.46
1.7
28.76
1.6
3
0.34
0.38
36.11
1.4
8.2 稳定性试验
8.2.1 光稳定性试验 实验中发现，光照对样品溶液中金丝桃素含量有一定的影响，因此将新制备的样品溶液分别置日光及室内自然光下放置0，0.5，1，1.5，2 h，测定，结果表明见光放置1.5 h后，金丝桃素峰面积基本稳定。
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8.2.2 热稳定性试验 为考察温度对金丝桃素的影响，将样品室温下测定及置50，70，90 ℃水浴中加热1 h，试验过程中注意避光，放置室温后测定，结果表明温度对金丝桃素影响不大。
8.3 提取时间的选择 实验中，分别将样品超声处理5，10，15，20，30 min，分别在各自的色谱条件下测定金丝桃苷和金丝桃素含量。结果表明，超声处理10 min后，金丝桃苷和金丝桃素基本提取完全。
8.4 普通ODS柱与ODS-2柱不同之处在于，普通ODS柱所用填料含有较多的自由硅醇基团，易与呈酸碱性的化合物发生作用，而ODS-2则为采用封尾技术，自由硅醇基团水平极低的填料，基本不与呈酸碱性的化合物发生作用，使呈酸碱性的化合物能够得到理想的峰形。
参考文献
1，江苏新医学院. 中药大辞典. 上海：上海科技出版社, 1986. 1448
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2，Vlietinck AJ, De Bruyne, Apers S, et al. Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Planta Med, 1998, 64(2)：97
3，赵晶，张致平，陈鸿珊. 金丝桃素和乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷逆转录酶的抑制活性. 药学学报， 1998, 33(1)：67
4，Vander Werf QM, Saxton RE, Chang A, et al. Hypericin：a new laser phototargeting agent for human cancer cells. Laryngoscope, 1996, 106(4)：479
5，李星海，王军宪，唐有明. 秦岭三种金丝桃属植物中金丝桃苷的含量测定. 西北药学杂志， 1994, 9(1)：18
, 百拇医药
6，沙明，曹爱民，杨松松. 高效液相色谱法测定朝鲜淫羊藿中金丝桃苷的含量. 中国中药杂志， 1995, 20(6)：357
7，Micali G, Lanuzza F, Gurro P. High-performance liquid chromatographic determination of the biologically active principle hypericin in phytotherapeutic vegetable extracts and alcoholic beverages. J Chromatogr A, 1996, 731(1-2):336
8，Liebes L, Mazur R, Freeman D, et al. A method for the quantitation of Hypericin, an antiviral agent, in biological fluids by high-performance liquid chromatography. Anal Biochem, 1991, 195(1)：77
9，国家医药管理局中草药情报中心站. 植物药有效成分手册. 北京：人民卫生出版社，1986. 596
(本文于1998年12月29日收到), 百拇医药