高效液相色谱法测定人血浆中酮洛芬浓度
作者：黄英 余勤 梁茂植 何晓东 秦永平 邹远高
单位：黄英 余勤 梁茂植 何晓东 秦永平 邹远高(华西医科大学附属第一医院临床药理研究所 成都 610041)
关键词：酮洛芬；高效液相色谱法；血药浓度；药代动力学
药物分析杂志000209 摘要 目的：采用高效液相色谱法测定人血浆中酮洛芬浓度。方法：用石油醚-乙醚(1∶1)提取血浆样品中酮洛芬及萘普生(内标)，在Spherisorb C18柱上，以甲醇-50 mmol*L-1 磷酸二氢钠(63∶37)为流动相进行分离，于255 nm检测。结果：线性范围为0.04～12 μg*mL-1，萃取回收率为85.2%～89.9%，加样回收率为97.0%～100.1%，日内RSD为0.45%～2.72%，日间RSD为1.31%～4.40%。结论：本法简便，准确，重现性好，用于测定12名健康志愿者口服酮洛芬胶囊后血药浓度取得良好结果。
, 百拇医药
Determination of Ketoprofen in Human Plasma by HPLC
Huang Ying,Yu Qin,Liang Maozhi,He Xiaodong,Qin Yongping and Zou Yuangao
(Institute of Clinical Pharmacology,First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract Objective：A simple HPLC method is established for the determination of ketoprofen in human plasma.Method:Ketoprofen and the internal standard(naproxen)were first extracted into the mixture of petroleum ether and ether and then separated on C18 column with a mobile phase consisting of methanol and 50 mmol*L-1 phosphate buffer(63∶37).Result:The calibration curve was linear within 0.04～12 μg*mL-1.The extraction recoveries of ketoprofen were 85.2%～89.9%.The recoveries of methodology were 97.0%～100.1%.Inter-day and intra-day RSD were 0.45%～2.72% and 1.31%～4.40% respectively.Conclusion:This method is simple,accurate and reproducible.It has been applied successfully to the determination of ketoprofen in human plasma for pharmacokinetic studies.
, 百拇医药
Key words ketoprofen,HPLC,drug concentration in plasma,pharmacokinetics
酮洛芬(Ketoprofen)是一良好非甾体抗炎药物，临床用于解热、镇痛及治疗类风湿性关节炎等。该药口服吸收迅速，但消除较快，一般口服每日需3～4次，且对胃肠道有一定刺激性[1]。国外对酮洛芬缓释制剂研制较早，国内迄今尚无酮洛芬缓释制剂产品上市。我们参考国内外文献报道[2，3]，建立人血浆酮洛芬浓度测定的反相高效液相色谱法，旨在用于研究国产酮洛芬缓释制剂的人体药动学及其相对生物利用度。
1 仪器与试药
美国Waters公司高效液相色谱仪：510型泵，486型紫外检测器。日本Shimadzu公司C-R7Ae色谱数据处理机。
酮洛芬对照品(西南合成制药股份有限公司，含量100.1%)，萘普生原料(西南合成制药二厂)。酮洛芬肠溶胶囊(西南合成制药股份有限公司，批号961101，规格为每粒50 mg)，酮洛芬缓释胶囊(成都华西药业有限公司，批号971008，规格为每粒100 mg)。其余试剂均为分析纯。
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酮洛芬标准液：精密称取酮洛芬对照品6 mg，加入0.1 mol。L-1 氢氧化钠 1 mL溶解，再用水稀释并定容至50 mL，于冰箱4 ℃保存。临用时以水稀释成24，16，8，2，0.4，0.08 μg。mL-1酮洛芬标准液。
内标工作液：精密称取萘普生5 mg，按酮洛芬标准液同法配制。临用时以水稀释成25 μg。mL-1萘普生工作液。
2 色谱条件
色谱柱：Spherisorb C18,150 mm×4.6 mm，10 μm(中科院大连化学物理所)；流动相：甲醇-50 mmol。L-1 磷酸二氢钠(63∶37,磷酸调缓冲液pH至2.2)，用前经0.45 μm滤膜过滤；流速1.0 mL。min-1；检测波长255 nm。
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3 血样处理
空白血浆200 μL，加酮洛芬标准液100 μL(或待测血浆200 μL，加水100 μL)，加入内标工作液100 μL(含萘普生2.5 μg)，加1 mol。L-1 盐酸 100 μL，混匀，加石油醚-乙醚(1∶1)1.5 mL，混旋提取5 min，3 000 r。min-1离心5 min。将有机相转入离心管，置50 ℃水浴通空气流挥干。残渣用流动相50 μL溶解，吸取20 μL在前述色谱条件下分离测定。血浆样品色谱图见图1。酮洛芬及萘普生保留时间分别为5.3 min及6.5 min。色谱峰理论塔板数按酮洛芬计算为2 700，酮洛芬峰与萘普生峰分离度为2.25。
图1 酮洛芬血浆样品色谱图
, 百拇医药
A.空白血浆 B.血浆样品
1.酮洛芬 2.萘普生(内标)
4 线性关系
于空白血浆中加入酮洛芬标准液，使其血浆药浓分别为0.04，0.2，1，4，8，12 μg。mL-1，按前述血样处理法操作测定。以酮洛芬与内标峰高比值(Y)对酮洛芬血浆浓度(X)作回归计算，其直线方程：
Y=0.351 2 X+0.008 4 r=0.999 9
当信噪比为3时，血浆酮洛芬最低检测浓度为0.01 μg。mL-1。
5 萃取回收率
取空白血浆200 μL，加酮洛芬标准液100 μL，按血样处理法操作测定(不加内标)，所得酮洛芬峰高与同浓度酮洛芬标准液100 μL置50 ℃水浴挥干后，用流动相50 μL溶解进样之峰高比值，即萃取回收率。浓度为0.2，4，8 μg。mL-1的血浆样品，酮洛芬萃取回收率(n=6)分别为88.4%，85.2%，89.9%。
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6 加样回收率
取空白血浆200 μL，加入不同浓度的酮洛芬标准液100 μL，按血样处理法操作测定，并求出实测量与加入量之比值，即酮洛芬加样回收率(表1)。
表1 酮洛芬加样回收率(n=6) 加入量
/μg。mL-1
实测量
/μg。mL-1
回收率
/%
RSD
/%
, 百拇医药
0.2
0.194
97.0
2.67
4.0
4.004
100.1
0.88
8.0
7.923
99.0
0.46
7 方法精密度
, 百拇医药
分别取浓度为0.2，4，8 μg。mL-1的酮洛芬血浆样品各数份，按血样处理法操作于1 d内测定，其日内RSD(n=6)分别为2.72%，0.89%，0.45%；于不同日反复测定，其日间RSD(n=6)分别为4.40%，2.64%，1.31%。
8 药动学研究应用
12名男性健康志愿者单剂随机交叉口服酮洛芬肠溶胶囊或缓释胶囊100 mg，分别于服药后0，1，1.5，2，3，5，7，9，14 h采血，用本法测定血浆酮洛芬浓度。采用中国药理学会制订3P87药动学程序，计算酮洛芬药动学参数(表2)，其均值药-时曲线见图2。
表2 12名健康志愿者口服酮洛芬100 mg后药动学参数 剂型
Tmax
, http://www.100md.com
/h
Cmax
/μg。mL-1
T1/2
/h
AUC
/μg。mL-1.h
肠溶胶囊
2.29±0.54
7.75±1.13
2.42±0.58
, 百拇医药
21.90±3.75
缓释胶囊
3.08±0.67
4.99±1.16
2.55±0.64
22.13±4.90
图2 12名健康志愿者口服酮洛芬100 mg后药时曲线
1.肠溶胶囊 2.缓释胶囊
9 讨论
与文献报道[4～6]相比，本法取血量少，试剂节省，血样处理步骤简短，为国内酮洛芬新剂型人体药动学及其相对生物利用度研究提供了可靠的方法，对新药质量评价及指导临床合理用药具有实际意义。
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何晓东 贵州省安顺地区医院药剂科进修生
参考文献
1，徐传福，刘仁明，郑奇.酮基布洛芬的药物动力学研究.中国医院药学杂志，1986，6(2)：49
2，Wong Chiyin,Yeh Mingkung,Wang Dapeng.High-performance liquid chromatographic determination of ketoprofen in pharmaceutical dosage forms and plasma.J Liq Chomatogr,1992,15(8):1215
3，戚海亮，隋小平，高崇凯等.酮洛芬缓释胶囊生物利用度研究.中国医药工业杂志，1998，29(3)：108
4，Wanwimolruk S,Wanwimolruk S Z,Zoest A R.Sensitive HPLC assay for ketoprofen in human plasma and its application to pharmacokinetic study.J Liq Chromatogr,1991,14(20)：3685
5，葛庆华，张炎，陈庆华.缓释微丸及血浆中酮溶芬的HPLC测定.中国医药工业杂志，1994，25(11)：505
6，曹文瑾，屠锡德，吕万良等.酮洛芬速溶颗粒剂人体药物动力学研究.中国药科大学学报，1998，29(2)：105
(本文于1998年12月29日收到), 百拇医药
单位：黄英 余勤 梁茂植 何晓东 秦永平 邹远高(华西医科大学附属第一医院临床药理研究所 成都 610041)
关键词：酮洛芬；高效液相色谱法；血药浓度；药代动力学
药物分析杂志000209 摘要 目的：采用高效液相色谱法测定人血浆中酮洛芬浓度。方法：用石油醚-乙醚(1∶1)提取血浆样品中酮洛芬及萘普生(内标)，在Spherisorb C18柱上，以甲醇-50 mmol*L-1 磷酸二氢钠(63∶37)为流动相进行分离，于255 nm检测。结果：线性范围为0.04～12 μg*mL-1，萃取回收率为85.2%～89.9%，加样回收率为97.0%～100.1%，日内RSD为0.45%～2.72%，日间RSD为1.31%～4.40%。结论：本法简便，准确，重现性好，用于测定12名健康志愿者口服酮洛芬胶囊后血药浓度取得良好结果。
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Determination of Ketoprofen in Human Plasma by HPLC
Huang Ying,Yu Qin,Liang Maozhi,He Xiaodong,Qin Yongping and Zou Yuangao
(Institute of Clinical Pharmacology,First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract Objective：A simple HPLC method is established for the determination of ketoprofen in human plasma.Method:Ketoprofen and the internal standard(naproxen)were first extracted into the mixture of petroleum ether and ether and then separated on C18 column with a mobile phase consisting of methanol and 50 mmol*L-1 phosphate buffer(63∶37).Result:The calibration curve was linear within 0.04～12 μg*mL-1.The extraction recoveries of ketoprofen were 85.2%～89.9%.The recoveries of methodology were 97.0%～100.1%.Inter-day and intra-day RSD were 0.45%～2.72% and 1.31%～4.40% respectively.Conclusion:This method is simple,accurate and reproducible.It has been applied successfully to the determination of ketoprofen in human plasma for pharmacokinetic studies.
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Key words ketoprofen,HPLC,drug concentration in plasma,pharmacokinetics
酮洛芬(Ketoprofen)是一良好非甾体抗炎药物，临床用于解热、镇痛及治疗类风湿性关节炎等。该药口服吸收迅速，但消除较快，一般口服每日需3～4次，且对胃肠道有一定刺激性[1]。国外对酮洛芬缓释制剂研制较早，国内迄今尚无酮洛芬缓释制剂产品上市。我们参考国内外文献报道[2，3]，建立人血浆酮洛芬浓度测定的反相高效液相色谱法，旨在用于研究国产酮洛芬缓释制剂的人体药动学及其相对生物利用度。
1 仪器与试药
美国Waters公司高效液相色谱仪：510型泵，486型紫外检测器。日本Shimadzu公司C-R7Ae色谱数据处理机。
酮洛芬对照品(西南合成制药股份有限公司，含量100.1%)，萘普生原料(西南合成制药二厂)。酮洛芬肠溶胶囊(西南合成制药股份有限公司，批号961101，规格为每粒50 mg)，酮洛芬缓释胶囊(成都华西药业有限公司，批号971008，规格为每粒100 mg)。其余试剂均为分析纯。
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酮洛芬标准液：精密称取酮洛芬对照品6 mg，加入0.1 mol。L-1 氢氧化钠 1 mL溶解，再用水稀释并定容至50 mL，于冰箱4 ℃保存。临用时以水稀释成24，16，8，2，0.4，0.08 μg。mL-1酮洛芬标准液。
内标工作液：精密称取萘普生5 mg，按酮洛芬标准液同法配制。临用时以水稀释成25 μg。mL-1萘普生工作液。
2 色谱条件
色谱柱：Spherisorb C18,150 mm×4.6 mm，10 μm(中科院大连化学物理所)；流动相：甲醇-50 mmol。L-1 磷酸二氢钠(63∶37,磷酸调缓冲液pH至2.2)，用前经0.45 μm滤膜过滤；流速1.0 mL。min-1；检测波长255 nm。
, 百拇医药
3 血样处理
空白血浆200 μL，加酮洛芬标准液100 μL(或待测血浆200 μL，加水100 μL)，加入内标工作液100 μL(含萘普生2.5 μg)，加1 mol。L-1 盐酸 100 μL，混匀，加石油醚-乙醚(1∶1)1.5 mL，混旋提取5 min，3 000 r。min-1离心5 min。将有机相转入离心管，置50 ℃水浴通空气流挥干。残渣用流动相50 μL溶解，吸取20 μL在前述色谱条件下分离测定。血浆样品色谱图见图1。酮洛芬及萘普生保留时间分别为5.3 min及6.5 min。色谱峰理论塔板数按酮洛芬计算为2 700，酮洛芬峰与萘普生峰分离度为2.25。
图1 酮洛芬血浆样品色谱图
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A.空白血浆 B.血浆样品
1.酮洛芬 2.萘普生(内标)
4 线性关系
于空白血浆中加入酮洛芬标准液，使其血浆药浓分别为0.04，0.2，1，4，8，12 μg。mL-1，按前述血样处理法操作测定。以酮洛芬与内标峰高比值(Y)对酮洛芬血浆浓度(X)作回归计算，其直线方程：
Y=0.351 2 X+0.008 4 r=0.999 9
当信噪比为3时，血浆酮洛芬最低检测浓度为0.01 μg。mL-1。
5 萃取回收率
取空白血浆200 μL，加酮洛芬标准液100 μL，按血样处理法操作测定(不加内标)，所得酮洛芬峰高与同浓度酮洛芬标准液100 μL置50 ℃水浴挥干后，用流动相50 μL溶解进样之峰高比值，即萃取回收率。浓度为0.2，4，8 μg。mL-1的血浆样品，酮洛芬萃取回收率(n=6)分别为88.4%，85.2%，89.9%。
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6 加样回收率
取空白血浆200 μL，加入不同浓度的酮洛芬标准液100 μL，按血样处理法操作测定，并求出实测量与加入量之比值，即酮洛芬加样回收率(表1)。
表1 酮洛芬加样回收率(n=6) 加入量
/μg。mL-1
实测量
/μg。mL-1
回收率
/%
RSD
/%
, 百拇医药
0.2
0.194
97.0
2.67
4.0
4.004
100.1
0.88
8.0
7.923
99.0
0.46
7 方法精密度
, 百拇医药
分别取浓度为0.2，4，8 μg。mL-1的酮洛芬血浆样品各数份，按血样处理法操作于1 d内测定，其日内RSD(n=6)分别为2.72%，0.89%，0.45%；于不同日反复测定，其日间RSD(n=6)分别为4.40%，2.64%，1.31%。
8 药动学研究应用
12名男性健康志愿者单剂随机交叉口服酮洛芬肠溶胶囊或缓释胶囊100 mg，分别于服药后0，1，1.5，2，3，5，7，9，14 h采血，用本法测定血浆酮洛芬浓度。采用中国药理学会制订3P87药动学程序，计算酮洛芬药动学参数(表2)，其均值药-时曲线见图2。
表2 12名健康志愿者口服酮洛芬100 mg后药动学参数 剂型
Tmax
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/h
Cmax
/μg。mL-1
T1/2
/h
AUC
/μg。mL-1.h
肠溶胶囊
2.29±0.54
7.75±1.13
2.42±0.58
, 百拇医药
21.90±3.75
缓释胶囊
3.08±0.67
4.99±1.16
2.55±0.64
22.13±4.90
图2 12名健康志愿者口服酮洛芬100 mg后药时曲线
1.肠溶胶囊 2.缓释胶囊
9 讨论
与文献报道[4～6]相比，本法取血量少，试剂节省，血样处理步骤简短，为国内酮洛芬新剂型人体药动学及其相对生物利用度研究提供了可靠的方法，对新药质量评价及指导临床合理用药具有实际意义。
, http://www.100md.com
何晓东 贵州省安顺地区医院药剂科进修生
参考文献
1，徐传福，刘仁明，郑奇.酮基布洛芬的药物动力学研究.中国医院药学杂志，1986，6(2)：49
2，Wong Chiyin,Yeh Mingkung,Wang Dapeng.High-performance liquid chromatographic determination of ketoprofen in pharmaceutical dosage forms and plasma.J Liq Chomatogr,1992,15(8):1215
3，戚海亮，隋小平，高崇凯等.酮洛芬缓释胶囊生物利用度研究.中国医药工业杂志，1998，29(3)：108
4，Wanwimolruk S,Wanwimolruk S Z,Zoest A R.Sensitive HPLC assay for ketoprofen in human plasma and its application to pharmacokinetic study.J Liq Chromatogr,1991,14(20)：3685
5，葛庆华，张炎，陈庆华.缓释微丸及血浆中酮溶芬的HPLC测定.中国医药工业杂志，1994，25(11)：505
6，曹文瑾，屠锡德，吕万良等.酮洛芬速溶颗粒剂人体药物动力学研究.中国药科大学学报，1998，29(2)：105
(本文于1998年12月29日收到), 百拇医药