诱导子在植物细胞培养中的应用研究进展
作者：赵鸿莲 于荣敏
单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：诱导子；次生代谢；细胞培养
沈阳药科大学学报000224 摘 要：对诱导子的分类、诱导子所致的过敏反应、诱导子的作用机制及其对植物组织和细胞培养中次生代谢产物的影响等方面的最新研究进展进行了综述.
分类号；Q942
Progress in the Application of Elicitors in the Plant Cell Cultures
Zhao Honglian Yu Rongmin
(Department of Pharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015)
, 百拇医药
Abstract：This paper surveys the progress of studies on elicitors in the application of plant tissue/cell culture. Besides， the classification，hypersensitive reaction (HR) and reaction mechanism of elicitors are also discussed.
Key words：elicitor; secondary metabolism; cell culture▲
自然界丰富的植物资源蕴涵着数量可观的次生代谢产物，其中包括许多珍贵的药用植物.为了开发这些宝贵的资源，除了从植物材料进行提取和进行化学合成以外, 如何利用植物细胞培养技术生产有用的次生代谢产物也是许多生物学家感兴趣的课题.许多研究结果表明, 增加植物细胞培养物中次生代谢产物产量的方法可通过改变培养基成分及其浓度、生长调节剂的选择或基因克隆等手段来实现.此外，利用诱导子进行有目的的次生代谢产物调控及生物合成也已得到越来越多国内外学者的关注，并成为大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一.
, 百拇医药
诱导子(elicitor)是植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应(hypersensitive reaction，HR，亦称抗性反应或自身防御反应self-defense reaction)的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子.诱导子在植物与微生物的相互作用中，能快速、高度专一性地诱导特定基因的表达.近年来，愈来愈多的研究证明诱导子可作为研究植物次生代谢信号识别及其细胞内信息传递的良好实验体系.
作者对诱导子的分类、诱导子所致的过敏反应、诱导子的作用机制及其对植物组织和细胞培养中次生代谢产物的影响等方面的最新研究进展进行了综述.
1 诱导子的分类
1.1 定义
植物抗毒素(phytoalexins)是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物(根据其功能又称为“后感染防御物质”).同一化合物在有些情况下可能会连续合成，但在另外一些情况下则只有被刺激时才能产生，或仅在被诱导时其产量才能增加.
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从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一种或几种反应，并形成特征性自身防御反应的分子.植物抗毒素的形成仅为几种可能的反应之一.诱导子可根据在细胞内或细胞外形成而分为内源性诱导子和外源性诱导子；或根据其来源分为生物诱导子(biotic elicitors)和非生物诱导子(abiotic elicitors).
生物诱导子是指植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子(conidia)、降解细胞壁的酶类、有机体的细胞壁碎片、有机体产生的代谢物以及培养物滤液中的成分.初生细胞壁中富含半乳糖醛酸组成的多糖成分，溶解其1%就足以诱导植物抗毒素的合成.但是，其活性一般低于外源性β-庚糖苷.所有不是植物细胞中天然成分但又能触发形成植物抗毒素信号的因子为非生物诱导子.
1.2 内源性诱导子
内源性诱导子(endogenous elicitor)主要指来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物(如复杂多糖、糖蛋白等)及沉积在细胞壁上的木质素〔1〕.
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多糖类又分为纤维素、半纤维素及果胶类.Bolanos认为多糖降解碎片中的活性分子寡糖素不仅是微生物的组成部分，同时亦存在于植物细胞壁中.柠檬(Citaes limon)果里细胞壁降解产生的不同分子大小的寡糖素亦可作为诱导子使用〔2〕；橘叶巴戟〔3〕细胞壁中果胶和果胶酸在防御反应的第一步就可促进几丁质酶和溶菌酶的增加.Huike认为果胶是橘叶巴戟中诱导花青素合成的最有效物质〔4〕.
1.3 外源性诱导子
外源性诱导子亦称真诱导子(genuine elicitor)，是指病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物.目前应用最多的是真菌诱导子，根据其结构可分为4类.
1.3.1 多糖类
脱乙酰几丁质是真菌细胞壁被几丁质酶酶解的产物〔5〕，是广泛使用的多糖类诱导子，它可诱导植保素的产生〔6〕.木质素类〔7〕及蛋白酶抑制剂〔8〕，如大雄疫霉(Phytophthora megasperma)是由大雄疫霉细胞壁分离得到的多糖类诱导子，也是最常用的诱导子之一.
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1.3.2 糖蛋白类
作为微生物细胞壁组成成分之一的糖蛋白类，可诱导引发防御反应，此点已在植物细胞培养中得到证实，如在Lucene悬浮培养细胞中加入来源于植物病原性真菌的α和β-糖蛋白可产生具抗菌作用的次生代谢产物〔9〕.
1.3.3 蛋白质类
包括一些酶类及具蛋白性质的物质如绿色木霉(Trichoderma viride)中的纤维素酶作为诱导子在Grapnine的悬浮培养中可引起HR反应〔10〕，另一来源于隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)的具有蛋白质性质的诱导子亦能诱导HR反应并大量积累植保素cryptogeion.
1.3.4 不饱和脂肪酸类
不饱和脂肪酸类作为一种诱导抗性反应的诱导子，对其研究不是很充分，但已发现多聚不饱和脂肪酸(花生四烯酸)及其部分酯类可诱导马铃薯植保素risnitin和lubimin的产生〔11〕.
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2 诱导子的作用机制
虽然诱导子在植物中的具体作用机制尚未形成一套详尽的理论体系，但目前对该领域的研究却非常活跃.相信诱导子的详尽作用机制会随着植物组织和细胞培养技术的不断进步而最终得以阐明.
在系统研究来源于苯丙烷代谢作用的植物抗毒素〔如呋喃香豆素、黄酮体、1,2-二苯乙烯(stilbenes)、紫檀烷、木质素等〕的过程中，人们发现了很多有关的生化和分子证据.如在研究园欧芹悬浮细胞培养时光诱导对黄酮体合成的作用时发现一个基本事实，即非生物诱导子(外部培养条件)协同诱导可增加特征酶群活性.
一般来说，在特征酶诱导活性和次级代谢产物累积之间具有直接相关性，相应酶活可能增加.但目前人们也证实了非活性状态酶的活化，如菜豆细胞中查尔酮异构酶(chalcone-isomerase,CHI).同时，尚发现了苯丙氨酸解氨酶(PAL)的产物和其它苯丙烷代谢酶类也作为调节剂相互作用.如在鹰嘴豆悬浮细胞培养中，酵母提取物的加入可最大限度的诱导PAL的活性，导致异黄酮、7-羟基-4′-甲氧基异黄酮、biochanin A以及两种相互独立的微粒体细胞色素P450氧化酶(2′和3′-氧化酶)的累积，进而引起紫檀烷、美迪紫檀素(medicarpin)和高丽槐素(maackiaine)含量的增加；异黄酮氧化还原酶(isoflavone-oxidoreductase, IFR)的活性增加了15倍.此外，某些诱导子(如Ascochyta rabiei)可显著提高初级代谢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性.
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研究证明，培养过程中化合物诱导所致的基因活化并不是开始就有的.除了豆科植物具有合成喹喏里西啶类生物碱的特征基因以外，人们尚发现了羽扁豆碱(lupanine)转录基因的存在.最明显的例子是仅在真菌进攻时才产生的几丁质降解酶(chitinase)的形成.一般来说，加入诱导子后培养物停止生长，氮的吸收亦停止并开始合成特异性mRNAs.当在长春花悬浮培养细胞中加入经过灭菌的瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)诱导子后，培养细胞能快速响应色氨酸脱羧酶(TDC)的诱导，产生色胺，并导致strictosidine合成酶(SS)的活化.这两种酶都是早于短暂出现的mRNAs而形成的.在菜豆细胞中，加入诱导子后，开始出现的PAL和查尔酮合成酶(chalcone-synthase, CHS)转录时间约持续5 min之久；在落花生中，CHI和1,2-二苯乙烯合成酶基因的转录要在诱导3～4 h后独立进行最大限度的转录.在菜豆属植物细胞培养中，仅仅一种多基因CHI家族中的同功酶(isoenzymes)基因被转录〔12〕.
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在植物抗病生理过程中生物诱导子除引起植物在其局部浸染部位做出迅速的过敏反应，即一种或几种生理生化反应外，还诱导植物产生植保素，植物得以免遭病原微生物的侵染和破坏.对诱导子所引起的生理生化反应(或防御反应)，Dixon〔13〕作了如下概括：
(1)膜脂超氧化和膜结构功能的改变. 其结果是使膜的通透性增加和流动性改变并出现细胞浸润现象.这一性质在植物细胞培养中得以应用，如加入脱乙酰几丁质就可以使植物细胞膜的通透性得以改变，且其胶化亦使植物细胞膜的流动性降低.通常所说的氧化作用突跃是迅速释放H2O2，Chen〔14〕认为H2O2及活性氧在烟草抗性系统中起重要作用.
(2)形成和积累抗微生物的低分子量植保素. 如Morris等在培养Lotus corniculatus的根时加入生物诱导子和非生物诱导子均可导致异黄酮类植保素vestitol和sativanin的生成和积累〔15〕.
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(3)蛋白酶抑制物的积累可抑制病原微生物在侵染植物过程中分泌裂解植物细胞壁的蛋白酶.
(4)合成和分泌降解微生物细胞壁的酶，从而抑制微生物生长. 如几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶沉积于细胞壁上，可分泌木质素和富含羟脯氨酸蛋白(HRGP)等物质.由于大多数植物病原微生物不能分解木质素，故木质化细胞壁就成为防止寄生物入侵植物细胞并致病的“分子障碍”或“分子屏障”，如禾本科中，阿魏酸和p-香豆酸的酯化形成二种类似木质素的物质可沉积在细胞壁上.
上述生理生化反应，导致了植物对病原微生物的抗性防御，而引起这些生理生化反应(或过敏反应)的诱导子通常是激活了植物体内产生这些过敏反应生合成代谢途径中关键酶的活性，并诱导活化这些酶的mRNA的转录、翻译和蛋白质的生物合成，进而重新合成植保素.
在激活过程中，诱导子与细胞膜上受体的结合，改变了膜离子通道，促使诱导过程迅速完成.如人们对欧芹的研究初步建立了诱导子作用钙离子信号传递机制模型，指出诱导子与其受体高度亲合，引起原生质膜活性的改变，即位于原生质膜上的离子通道改变，引起Ca2+、H+内流，K+、Cl-外流，同时迅速发生H2O2胞内依赖Ca2+的蛋白质磷酸化作用〔16〕，激活核内的防御基因，引起防御反应，诱导合成植保素的酶以合成植保素，最后完成信号传递作用.
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另有证据表明，植物的细胞膜上确实存在能与真菌诱导子高度亲合的受体.有时穿过细胞膜的离子流可在一些植物和病毒相互作用时，作为特异性诱导子诱导信号传递，从而引起植物防御反应.Sabine〔17〕认为植物细胞膜对病原体识别可引起多组防御反应，瞬间Ca2+流过原生质膜被假定为反应起始信号的一部分.胡萝卜素增加Ca2+内流和K+外流，Ca2+通道阻滞剂的加入则抑制植保素的转录和合成〔18〕.
Chen还认为H2O2及活性氧在烟草的抗性系统中起着重要作用〔19〕.此外，在拟南芥菜细胞悬浮培养实验中发现超氧化物产生活性氧系统的存在〔20〕.
不同的诱导子可通过植物表面的不同部位而起作用，也是激活反应中有关基因的表现.一些靶向基因的存在已经得到证明，包括合成高羟脯氨酸糖蛋白的基因、糖蛋白翻译后的修饰酶的基因、水解酶的基因、决定病毒产生的相关蛋白质的基因及负责合成植保素及与细胞壁相连的酚类化合物的酶的基因等.Arabidopsis悬浮培养细胞用细菌Erwinca及Arotoora pv粗提物处理3 h后mRNA含量开始提高，8 h后相关酶含量达到最大值，表明信号传递到核内，并进行了基因表达.
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3 诱导子在组织和细胞培养及其次生代谢产物生合成研究中的应用
植物次生代谢产物合成的多代谢途径性使得人们通过不同的方法来刺激代谢途径以增加次生物的合成量(如改变培养基的组分、调整生长调节剂的浓度及基因克隆等)成为可能.
近年来，人们利用诱导子的作用特点，不断尝试、探索次生代谢物生合成的途径及提高代谢产物含量的方法，以寻找新的活性成分.20世纪90年代初，美国PHYTON CATALYTIE公司用短叶红豆杉树诱导愈伤组织并进行细胞悬浮培养，发现新培养的细胞能够合成紫杉醇等化合物并有少量的紫杉醇(3～5 mg/L)分泌至培养基中.而在培养基中加入各种诱导子(如加入灭活的座线孢属Cytoospora abiotis和青霉菌属Penicillium minioluteum的孢子)可促使紫杉醇从细胞中分泌出来，并有可能进行连续培养〔21〕.我国也有人用真菌桔青霉菌菌丝体的粗提物作为诱导子来提高红豆杉悬浮培养细胞中紫杉醇的含量〔22〕.Strinivasan等在红豆杉细胞培养基中加入代谢物抑制剂、诱导子和前体作为考察紫杉醇产量的工具，在考察中还对紫杉醇生合成途径进行了研究.结果发现，紫杉醇的产量受到细胞将苯丙氨酸转变为苯基异丝氨酸的转化能力的限制，而不是受合成途径分支点上酰基转移酶的限制.此实验为考察植物细胞次生代谢复杂情况提供了有用的方法〔23〕.
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将诱导子应用于植物细胞培养中以提高目的产物产量已成为国内外研究热点，并取得了一些成绩.这些诱导子包括：
(1)糖蛋白类：如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白(BSA)和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加10倍〔24〕.
(2)蛋白质类诱导子：Jonathan等〔25〕为了解酪胺代谢途径中某些酶的活性，使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导子来考察烟草细胞悬浮培养情况.
(3)多糖类诱导子：Daizo等用不同种诱导子分别作用于多种代表单子叶植物和双子叶植物的模型植物上，所用的诱导子有镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖.结果表明用植物病原体镰刀酶感染植株可诱导产生几丁质酶及其同工酶，并表达了强效抗病原体的细胞溶解活性，说明植物可识别病原体并可被诱导产生抗病原体的几丁质酶.而且天然多糖如几丁质、脱乙酰几丁质及其低聚糖也可诱导抗病原体的几丁质酶及其同工酶.说明上述物质具有强效细胞溶解活性的几丁质酶及其同工酶的各种功能〔26〕.另外，多糖类诱导子除诱导改善植物次生代谢产物的产量外，还可通过多糖的胶化性质改变植物细胞膜的通透性及流动性，如几丁质50可刺激Morinda citrifolia植物产生蒽酮；脱乙酰几丁质可诱导植物Chenopodium rubrum中苋菜素的形成〔27〕.
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(4)微生物类诱导子：通常是真菌诱导子，方法是将其悬浮培养的菌球匀浆处理，再将浆液高压灭菌处理，弃去残渣，得提取物或无菌真菌菌丝体粗提物.在无菌条件下将匀化产物加入到来源于不同组织、器官的细胞悬浮培养物中，同时作出作用时间曲线.
在紫杉属植物细胞培养物中为提高紫杉醇、紫杉碱的产量而向培养基中添加的诱导子为灰黄霉素、灰葡萄孢、大丽轮枝孢和融黏带酶的混合培养滤液〔28〕.还有人用葡萄孢属的无菌菌丝体匀化产物诱导处理罂粟细胞培养物来积累血根碱.Fachimi等通过此实验还对培养物中PAL及酪氨酸脱羧酶/多巴脱羧酶(TYDC)的活性进行了研究，结果显示：罂粟细胞中上述两种酶的活性机制与原来的血根碱生合成中的酶并非偶联〔29〕.不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物，可见从植物抗病生理角度来看，这些次生代谢产物多为植保素(植物抗病物质)，而在人类生活中，这些代谢产物也多为有益于人类健康的活性成分.
, http://www.100md.com 另一方面，诱导子运用于植物组织培养中亦存在一些问题，如内源性诱导子及酵母提取物是无毒的，而来源于真菌的诱导子多有很强的毒性.随着植保素的诱导合成，植物病原性真菌也诱导了一个过敏反应，就是病毒与宿主细胞相互作用部位细胞的坏死，从而使细胞生长率下降，并可能影响次生代谢产物的产量.
另外，降低诱导子浓度可以减少生长的停止状态，然而在诱导子作用下形成次生代谢产物的过程中，低浓度的诱导子只能引起部分诱导，所以诱导的剂量不同，引起的效应也不同.Ballica提出诱导子在达指数生长期之前加入效果是最好的，当然诱导子在不同的作用时间都将在一定程度上影响次生代谢产物的含量，如桔青霉诱导子对红豆杉培养细胞中紫杉醇生合成的影响实验显示，在红豆杉细胞中指数生长期末期时加入诱导子，对紫杉醇合成的促进作用最大〔22〕.
对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素，所以在培养过程中要不断的加以平衡和研究.同时植物有机体是各不相同的，具有其本身的特殊性. 因此对一种植物细胞或一种次生代谢产物适合的条件不一定适合于其它的次生代谢产物和细胞.总之，诱导子在植物细胞培养物中对次生代谢产物的作用还有待于更进一步的系统研究.
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收稿日期：1999-05-04
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单位：沈阳药科大学制药系，沈阳 110015
关键词：诱导子；次生代谢；细胞培养
沈阳药科大学学报000224 摘 要：对诱导子的分类、诱导子所致的过敏反应、诱导子的作用机制及其对植物组织和细胞培养中次生代谢产物的影响等方面的最新研究进展进行了综述.
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Abstract：This paper surveys the progress of studies on elicitors in the application of plant tissue/cell culture. Besides， the classification，hypersensitive reaction (HR) and reaction mechanism of elicitors are also discussed.
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作者对诱导子的分类、诱导子所致的过敏反应、诱导子的作用机制及其对植物组织和细胞培养中次生代谢产物的影响等方面的最新研究进展进行了综述.
1 诱导子的分类
1.1 定义
植物抗毒素(phytoalexins)是指在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物(根据其功能又称为“后感染防御物质”).同一化合物在有些情况下可能会连续合成，但在另外一些情况下则只有被刺激时才能产生，或仅在被诱导时其产量才能增加.
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从广义上讲，诱导子是能够诱导植物细胞中一种或几种反应，并形成特征性自身防御反应的分子.植物抗毒素的形成仅为几种可能的反应之一.诱导子可根据在细胞内或细胞外形成而分为内源性诱导子和外源性诱导子；或根据其来源分为生物诱导子(biotic elicitors)和非生物诱导子(abiotic elicitors).
生物诱导子是指植物在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，主要包括分生孢子(conidia)、降解细胞壁的酶类、有机体的细胞壁碎片、有机体产生的代谢物以及培养物滤液中的成分.初生细胞壁中富含半乳糖醛酸组成的多糖成分，溶解其1%就足以诱导植物抗毒素的合成.但是，其活性一般低于外源性β-庚糖苷.所有不是植物细胞中天然成分但又能触发形成植物抗毒素信号的因子为非生物诱导子.
1.2 内源性诱导子
内源性诱导子(endogenous elicitor)主要指来自植物细胞的分子，多为植物细胞壁在微生物作用下的降解产物(如复杂多糖、糖蛋白等)及沉积在细胞壁上的木质素〔1〕.
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多糖类又分为纤维素、半纤维素及果胶类.Bolanos认为多糖降解碎片中的活性分子寡糖素不仅是微生物的组成部分，同时亦存在于植物细胞壁中.柠檬(Citaes limon)果里细胞壁降解产生的不同分子大小的寡糖素亦可作为诱导子使用〔2〕；橘叶巴戟〔3〕细胞壁中果胶和果胶酸在防御反应的第一步就可促进几丁质酶和溶菌酶的增加.Huike认为果胶是橘叶巴戟中诱导花青素合成的最有效物质〔4〕.
1.3 外源性诱导子
外源性诱导子亦称真诱导子(genuine elicitor)，是指病源微生物在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物.目前应用最多的是真菌诱导子，根据其结构可分为4类.
1.3.1 多糖类
脱乙酰几丁质是真菌细胞壁被几丁质酶酶解的产物〔5〕，是广泛使用的多糖类诱导子，它可诱导植保素的产生〔6〕.木质素类〔7〕及蛋白酶抑制剂〔8〕，如大雄疫霉(Phytophthora megasperma)是由大雄疫霉细胞壁分离得到的多糖类诱导子，也是最常用的诱导子之一.
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1.3.2 糖蛋白类
作为微生物细胞壁组成成分之一的糖蛋白类，可诱导引发防御反应，此点已在植物细胞培养中得到证实，如在Lucene悬浮培养细胞中加入来源于植物病原性真菌的α和β-糖蛋白可产生具抗菌作用的次生代谢产物〔9〕.
1.3.3 蛋白质类
包括一些酶类及具蛋白性质的物质如绿色木霉(Trichoderma viride)中的纤维素酶作为诱导子在Grapnine的悬浮培养中可引起HR反应〔10〕，另一来源于隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)的具有蛋白质性质的诱导子亦能诱导HR反应并大量积累植保素cryptogeion.
1.3.4 不饱和脂肪酸类
不饱和脂肪酸类作为一种诱导抗性反应的诱导子，对其研究不是很充分，但已发现多聚不饱和脂肪酸(花生四烯酸)及其部分酯类可诱导马铃薯植保素risnitin和lubimin的产生〔11〕.
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2 诱导子的作用机制
虽然诱导子在植物中的具体作用机制尚未形成一套详尽的理论体系，但目前对该领域的研究却非常活跃.相信诱导子的详尽作用机制会随着植物组织和细胞培养技术的不断进步而最终得以阐明.
在系统研究来源于苯丙烷代谢作用的植物抗毒素〔如呋喃香豆素、黄酮体、1,2-二苯乙烯(stilbenes)、紫檀烷、木质素等〕的过程中，人们发现了很多有关的生化和分子证据.如在研究园欧芹悬浮细胞培养时光诱导对黄酮体合成的作用时发现一个基本事实，即非生物诱导子(外部培养条件)协同诱导可增加特征酶群活性.
一般来说，在特征酶诱导活性和次级代谢产物累积之间具有直接相关性，相应酶活可能增加.但目前人们也证实了非活性状态酶的活化，如菜豆细胞中查尔酮异构酶(chalcone-isomerase,CHI).同时，尚发现了苯丙氨酸解氨酶(PAL)的产物和其它苯丙烷代谢酶类也作为调节剂相互作用.如在鹰嘴豆悬浮细胞培养中，酵母提取物的加入可最大限度的诱导PAL的活性，导致异黄酮、7-羟基-4′-甲氧基异黄酮、biochanin A以及两种相互独立的微粒体细胞色素P450氧化酶(2′和3′-氧化酶)的累积，进而引起紫檀烷、美迪紫檀素(medicarpin)和高丽槐素(maackiaine)含量的增加；异黄酮氧化还原酶(isoflavone-oxidoreductase, IFR)的活性增加了15倍.此外，某些诱导子(如Ascochyta rabiei)可显著提高初级代谢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性.
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研究证明，培养过程中化合物诱导所致的基因活化并不是开始就有的.除了豆科植物具有合成喹喏里西啶类生物碱的特征基因以外，人们尚发现了羽扁豆碱(lupanine)转录基因的存在.最明显的例子是仅在真菌进攻时才产生的几丁质降解酶(chitinase)的形成.一般来说，加入诱导子后培养物停止生长，氮的吸收亦停止并开始合成特异性mRNAs.当在长春花悬浮培养细胞中加入经过灭菌的瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)诱导子后，培养细胞能快速响应色氨酸脱羧酶(TDC)的诱导，产生色胺，并导致strictosidine合成酶(SS)的活化.这两种酶都是早于短暂出现的mRNAs而形成的.在菜豆细胞中，加入诱导子后，开始出现的PAL和查尔酮合成酶(chalcone-synthase, CHS)转录时间约持续5 min之久；在落花生中，CHI和1,2-二苯乙烯合成酶基因的转录要在诱导3～4 h后独立进行最大限度的转录.在菜豆属植物细胞培养中，仅仅一种多基因CHI家族中的同功酶(isoenzymes)基因被转录〔12〕.
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在植物抗病生理过程中生物诱导子除引起植物在其局部浸染部位做出迅速的过敏反应，即一种或几种生理生化反应外，还诱导植物产生植保素，植物得以免遭病原微生物的侵染和破坏.对诱导子所引起的生理生化反应(或防御反应)，Dixon〔13〕作了如下概括：
(1)膜脂超氧化和膜结构功能的改变. 其结果是使膜的通透性增加和流动性改变并出现细胞浸润现象.这一性质在植物细胞培养中得以应用，如加入脱乙酰几丁质就可以使植物细胞膜的通透性得以改变，且其胶化亦使植物细胞膜的流动性降低.通常所说的氧化作用突跃是迅速释放H2O2，Chen〔14〕认为H2O2及活性氧在烟草抗性系统中起重要作用.
(2)形成和积累抗微生物的低分子量植保素. 如Morris等在培养Lotus corniculatus的根时加入生物诱导子和非生物诱导子均可导致异黄酮类植保素vestitol和sativanin的生成和积累〔15〕.
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(3)蛋白酶抑制物的积累可抑制病原微生物在侵染植物过程中分泌裂解植物细胞壁的蛋白酶.
(4)合成和分泌降解微生物细胞壁的酶，从而抑制微生物生长. 如几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶沉积于细胞壁上，可分泌木质素和富含羟脯氨酸蛋白(HRGP)等物质.由于大多数植物病原微生物不能分解木质素，故木质化细胞壁就成为防止寄生物入侵植物细胞并致病的“分子障碍”或“分子屏障”，如禾本科中，阿魏酸和p-香豆酸的酯化形成二种类似木质素的物质可沉积在细胞壁上.
上述生理生化反应，导致了植物对病原微生物的抗性防御，而引起这些生理生化反应(或过敏反应)的诱导子通常是激活了植物体内产生这些过敏反应生合成代谢途径中关键酶的活性，并诱导活化这些酶的mRNA的转录、翻译和蛋白质的生物合成，进而重新合成植保素.
在激活过程中，诱导子与细胞膜上受体的结合，改变了膜离子通道，促使诱导过程迅速完成.如人们对欧芹的研究初步建立了诱导子作用钙离子信号传递机制模型，指出诱导子与其受体高度亲合，引起原生质膜活性的改变，即位于原生质膜上的离子通道改变，引起Ca2+、H+内流，K+、Cl-外流，同时迅速发生H2O2胞内依赖Ca2+的蛋白质磷酸化作用〔16〕，激活核内的防御基因，引起防御反应，诱导合成植保素的酶以合成植保素，最后完成信号传递作用.
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另有证据表明，植物的细胞膜上确实存在能与真菌诱导子高度亲合的受体.有时穿过细胞膜的离子流可在一些植物和病毒相互作用时，作为特异性诱导子诱导信号传递，从而引起植物防御反应.Sabine〔17〕认为植物细胞膜对病原体识别可引起多组防御反应，瞬间Ca2+流过原生质膜被假定为反应起始信号的一部分.胡萝卜素增加Ca2+内流和K+外流，Ca2+通道阻滞剂的加入则抑制植保素的转录和合成〔18〕.
Chen还认为H2O2及活性氧在烟草的抗性系统中起着重要作用〔19〕.此外，在拟南芥菜细胞悬浮培养实验中发现超氧化物产生活性氧系统的存在〔20〕.
不同的诱导子可通过植物表面的不同部位而起作用，也是激活反应中有关基因的表现.一些靶向基因的存在已经得到证明，包括合成高羟脯氨酸糖蛋白的基因、糖蛋白翻译后的修饰酶的基因、水解酶的基因、决定病毒产生的相关蛋白质的基因及负责合成植保素及与细胞壁相连的酚类化合物的酶的基因等.Arabidopsis悬浮培养细胞用细菌Erwinca及Arotoora pv粗提物处理3 h后mRNA含量开始提高，8 h后相关酶含量达到最大值，表明信号传递到核内，并进行了基因表达.
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3 诱导子在组织和细胞培养及其次生代谢产物生合成研究中的应用
植物次生代谢产物合成的多代谢途径性使得人们通过不同的方法来刺激代谢途径以增加次生物的合成量(如改变培养基的组分、调整生长调节剂的浓度及基因克隆等)成为可能.
近年来，人们利用诱导子的作用特点，不断尝试、探索次生代谢物生合成的途径及提高代谢产物含量的方法，以寻找新的活性成分.20世纪90年代初，美国PHYTON CATALYTIE公司用短叶红豆杉树诱导愈伤组织并进行细胞悬浮培养，发现新培养的细胞能够合成紫杉醇等化合物并有少量的紫杉醇(3～5 mg/L)分泌至培养基中.而在培养基中加入各种诱导子(如加入灭活的座线孢属Cytoospora abiotis和青霉菌属Penicillium minioluteum的孢子)可促使紫杉醇从细胞中分泌出来，并有可能进行连续培养〔21〕.我国也有人用真菌桔青霉菌菌丝体的粗提物作为诱导子来提高红豆杉悬浮培养细胞中紫杉醇的含量〔22〕.Strinivasan等在红豆杉细胞培养基中加入代谢物抑制剂、诱导子和前体作为考察紫杉醇产量的工具，在考察中还对紫杉醇生合成途径进行了研究.结果发现，紫杉醇的产量受到细胞将苯丙氨酸转变为苯基异丝氨酸的转化能力的限制，而不是受合成途径分支点上酰基转移酶的限制.此实验为考察植物细胞次生代谢复杂情况提供了有用的方法〔23〕.
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将诱导子应用于植物细胞培养中以提高目的产物产量已成为国内外研究热点，并取得了一些成绩.这些诱导子包括：
(1)糖蛋白类：如在培养基中加入糖基化的氧化牛血清白蛋白(BSA)和氧化溶菌酶可使烟草叶产生抗原性尼克碱次生代谢产物的产量增加10倍〔24〕.
(2)蛋白质类诱导子：Jonathan等〔25〕为了解酪胺代谢途径中某些酶的活性，使用果胶酶及链状蛋白酶作为诱导子来考察烟草细胞悬浮培养情况.
(3)多糖类诱导子：Daizo等用不同种诱导子分别作用于多种代表单子叶植物和双子叶植物的模型植物上，所用的诱导子有镰刀霉菌丝体、乙烯、水杨酸、几丁质和脱乙酰几丁质及其低聚糖.结果表明用植物病原体镰刀酶感染植株可诱导产生几丁质酶及其同工酶，并表达了强效抗病原体的细胞溶解活性，说明植物可识别病原体并可被诱导产生抗病原体的几丁质酶.而且天然多糖如几丁质、脱乙酰几丁质及其低聚糖也可诱导抗病原体的几丁质酶及其同工酶.说明上述物质具有强效细胞溶解活性的几丁质酶及其同工酶的各种功能〔26〕.另外，多糖类诱导子除诱导改善植物次生代谢产物的产量外，还可通过多糖的胶化性质改变植物细胞膜的通透性及流动性，如几丁质50可刺激Morinda citrifolia植物产生蒽酮；脱乙酰几丁质可诱导植物Chenopodium rubrum中苋菜素的形成〔27〕.
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(4)微生物类诱导子：通常是真菌诱导子，方法是将其悬浮培养的菌球匀浆处理，再将浆液高压灭菌处理，弃去残渣，得提取物或无菌真菌菌丝体粗提物.在无菌条件下将匀化产物加入到来源于不同组织、器官的细胞悬浮培养物中，同时作出作用时间曲线.
在紫杉属植物细胞培养物中为提高紫杉醇、紫杉碱的产量而向培养基中添加的诱导子为灰黄霉素、灰葡萄孢、大丽轮枝孢和融黏带酶的混合培养滤液〔28〕.还有人用葡萄孢属的无菌菌丝体匀化产物诱导处理罂粟细胞培养物来积累血根碱.Fachimi等通过此实验还对培养物中PAL及酪氨酸脱羧酶/多巴脱羧酶(TYDC)的活性进行了研究，结果显示：罂粟细胞中上述两种酶的活性机制与原来的血根碱生合成中的酶并非偶联〔29〕.不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物，可见从植物抗病生理角度来看，这些次生代谢产物多为植保素(植物抗病物质)，而在人类生活中，这些代谢产物也多为有益于人类健康的活性成分.
, http://www.100md.com 另一方面，诱导子运用于植物组织培养中亦存在一些问题，如内源性诱导子及酵母提取物是无毒的，而来源于真菌的诱导子多有很强的毒性.随着植保素的诱导合成，植物病原性真菌也诱导了一个过敏反应，就是病毒与宿主细胞相互作用部位细胞的坏死，从而使细胞生长率下降，并可能影响次生代谢产物的产量.
另外，降低诱导子浓度可以减少生长的停止状态，然而在诱导子作用下形成次生代谢产物的过程中，低浓度的诱导子只能引起部分诱导，所以诱导的剂量不同，引起的效应也不同.Ballica提出诱导子在达指数生长期之前加入效果是最好的，当然诱导子在不同的作用时间都将在一定程度上影响次生代谢产物的含量，如桔青霉诱导子对红豆杉培养细胞中紫杉醇生合成的影响实验显示，在红豆杉细胞中指数生长期末期时加入诱导子，对紫杉醇合成的促进作用最大〔22〕.
对于影响植物细胞培养物的生物量的增长和次生代谢产物的积累因素的变化，可因某一因素的调整而影响其他因素，所以在培养过程中要不断的加以平衡和研究.同时植物有机体是各不相同的，具有其本身的特殊性. 因此对一种植物细胞或一种次生代谢产物适合的条件不一定适合于其它的次生代谢产物和细胞.总之，诱导子在植物细胞培养物中对次生代谢产物的作用还有待于更进一步的系统研究.
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收稿日期：1999-05-04
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