用液相色谱-质谱联用法测定滨蒿中的茵陈色原酮
作者：孙秀燕 邢山闽 李明慧 王立群 苑健
单位：孙秀燕(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳 110015)；邢山闽(解放军210医院，大连 116021)；李明慧(哈尔滨制药总厂)；王立群(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳110015)；苑健(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳 110015)
关键词：滨蒿；茵陈色原酮；高效液相色谱；液相色谱-质谱联用仪
沈阳药科大学学报000211 摘 要：以薄层色谱、高效液相色谱、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，采用液相色谱-质谱联用仪、电喷雾离子阱质谱对其结构进行鉴定.结果表明：滨蒿中的利胆有效成分除含有绿原酸、对羟基苯乙酮、 6,7-二甲氧基香豆素外，还首次分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮.
分类号：R914.1
, http://www.100md.com
The Determination of Capillarisin in Artemisia Scoparia by LC/MS
Sun Xiuyan Xing Shanmin Li Minghui Wang Liqun Yuan Jian
(Research Center for Determination and Testing,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：Analyses and isolation for the choleretic constituents in Artemisia scoparia by TLC , HPLC and 3D-HPLC, and the identification of choleretic constituents were performed by HPLC-ESI/MS. The results showed that besides chlorogenic acid, p-hydroxyacetophenone and 6,7-dimethylesculetin as the choleretic constituents in Artemisia scoparia, it was for the first time that a higher choleretic constituent-capillarisin was isolated and identified.
, 百拇医药
Key words：Artemisia scoparia; capillarisia; HPLC; HPLC-MS▲
茵陈自古以来是中医治疗各种肝胆疾病的要药〔1～3〕.近几年，现代药理研究又进一步阐明茵陈其保肝、利胆和护胰机理，此外尚发现其调血脂、降血压、抗肿瘤和抗病毒性反应等新的药理作用〔4～5〕,使得茵陈活性成分的追踪越来越引起人们的重视.《中国药典》1995版规定茵陈的植物基源有两种：滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.，并有大量文献报道其主要有效成分为绿原酸(chlorogenic acid)、6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethylesculetin，DE)、对羟基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone)〔6～8〕.1976年，日本学者小宫威弥等人从茵陈蒿中分离出保肝活性比6,7-二甲氧基香豆素更强的物质茵陈色原酮(capillarisin，CAP)〔9〕，滨蒿中是否含有，至今未见报道.作者对沈阳郊区野生滨蒿，分别采用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，用离子阱质谱(ESI/MS)对待测物准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级全扫描质谱测定.首次从滨蒿中分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮.
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1 仪器与试药
日本岛津LC-10AD高效液相色谱仪；SPD-M10A二极管阵列检测器；CLASS-10A色谱工作站；美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，ESI(电喷雾电离)源及LCQ数据处理系统.甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯).标准品：6,7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮由中国中医研究院提供.对照品：对羟基苯乙酮由本校有机教研室提供.药材：采自沈阳郊区，经本校中药鉴定室许春泉老师鉴定为滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.
2 方法与结果
2.1 样品制备
精密称取干燥、恒重样品5 g，分别用10倍、8倍、6倍量的水煎煮2、1.5、1 h.合并煎液，减压浓缩至20 mL，转移至125 mL分液漏斗中，用氯仿萃取3次(每次20 mL)，合并氯仿液，减压回收氯仿，残渣用甲醇溶解，定量转移至10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混匀，作为待测液.
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2.2 TLC法
滨蒿待测液中CAP的TLC分析条件见表1.
Tab.1 Analytical conditions of capillarisin in Artemisia scoparia by TLC Solid phase
Developing agent
Standard
Color-developing agent
Rf value
Silica G
benzene-methanol-water(35∶5∶5)
, 百拇医药
CAP
FeCl3
0.63
Silica G
toluene-ethylformate-formic acid (7∶3∶1)
CAP
FeCl3
0.50
Polyamide film
water-ethanol-acetylacetone(4∶2∶1)
, 百拇医药 CAP
FeCl3
0.23
实验结果表明，样品在与对照品相应的位置上显相同的灰色斑点.
2.3 HPLC法
HPLC分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm)；流动相：乙腈-水(V∶V=20∶80～90∶10)；梯度洗脱〔10〕，洗脱时间：80 min；流速：1 mL/min；柱温：40℃.
结果：将上述待测液注入液相色谱仪中，HPLC图谱及三维HPLC图谱见图1～3.
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Fig.1 HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6，7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin
Fig.2 HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin
, 百拇医药
Fig.3 3D-HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylesculetin;C—Capillarisin
2.4 HPLC-MSn法
HPLC-MSn分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm)；流动相：甲醇；流速：0.5 mL/min；柱温：20℃；进样量：20 μL；质谱参数设置：离子源喷射电压4.25 kV；毛细管温度：180℃；毛细管电压30 V；鞘气(N2)流速0.75 L/min；辅助气流速0.15 L/min.
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结果：以ESI为离子源采用正离子方式检测，测得标准品准分子离子峰[M+H]+m/z 317.4，然后同时选择m/z 317.4准分子离子峰进行二级全扫描质谱(full scan MS2)分析，并选择m/z 317.4→302.1进行三级全扫描质谱(full scan MS3)分析.获得标准品和待测物相应的子离子质谱图.测定结果见图4～6. CAP的(+)ESI-MS2、ESI-MS3的碎片主要断裂过程见图7.
Fig.4 TIC chromatogram of capillarisin
A—Standard;B—Sample
, 百拇医药
Fig.5 Full scan MS2 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample
Fig.6 Full scan MS3 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample
Fig.7 The main proposed fragmentation process for capillarisin
3 讨论
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a.HPLC测定中发现保留时间为22.82 min的色谱峰和CAP的色谱峰部分重叠.经ESI/MS检测，其准分子离子峰m/z也为317.4，但选择离子MS2、MS3子离子质谱图与CAP的明显不同.其结构鉴定有待于进一步研究.
b.对滨蒿水煎煮液有效成分提取的工艺筛选中，曾用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇4种不同极性的溶剂分别萃取.经HPLC跟踪监测，氯仿两次萃取液中有效成分含量已占90%以上，故选用水煎煮后氯仿萃取.该法与甲醇超声法比较，干扰物质少.
c.据文献报道〔6〕，在8月下旬至10月中旬采割的茵陈中CAP的含量较高，作者所用样品只是对一个地区、选了二次采割时间(8月20日、8月27日).经HPLC初步测得6,7-二甲氧基香豆素约0.5%，对羟基苯乙酮约0.09%.
致谢 HPLC-MS质谱图由本室李雪庆、陈笑艳测试，对羟基苯乙酮由有机教研室胡春老师提供，本文承许春泉、高光恩教授给予指导帮助，特此致谢.■
, 百拇医药
参考文献：
[1]李时珍.本草纲目：草部第十五卷.北京：人民卫生出版社，1982.941～943
[2]孙星衍，孙冯翼.神农本草经：卷一.台北：五州出版社，1981.32～33
[3]王占玺，张荣显，许华，等.张仲景药法研究.北京：科学技术出版社，1984.242～244
[4]蒋洁云，徐强，王蓉，等.茵陈抗肿瘤成分的研究.中国药科大学学报，1992， 23(5)：283～286
[5]潘克将，刘惠纯.茵陈蒿汤和茵陈药理研究近况及展望.中成药，1997，19(10)：46～47
[6]徐起初，杨连菊，杨春澍.茵陈的质量研究.中草药，1983，14(1)：35～40
, 百拇医药
[7]张启伟，章育中.滨蒿利胆有效成分的含量测定.药学学报，1986， 21(12)：922～927
[8]胡润生，李宝珍，陈玫.滨蒿利胆有效成分的研究.药学学报，1965，12(5)：289～294
[9]小宫威弥.茵陈蒿的研究(第一报)新利胆成分Capillarisin.药学杂志，1976,(7)：841～854
[10]王喜军，孙晖，刘中申.茵陈蒿及其复方制剂中6，7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮的定量研究.中国中药杂志，1994，19(11)：667～670
收稿日期：1999-06-07, 百拇医药
单位：孙秀燕(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳 110015)；邢山闽(解放军210医院，大连 116021)；李明慧(哈尔滨制药总厂)；王立群(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳110015)；苑健(沈阳药科大学分析测试中心,沈阳 110015)
关键词：滨蒿；茵陈色原酮；高效液相色谱；液相色谱-质谱联用仪
沈阳药科大学学报000211 摘 要：以薄层色谱、高效液相色谱、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，采用液相色谱-质谱联用仪、电喷雾离子阱质谱对其结构进行鉴定.结果表明：滨蒿中的利胆有效成分除含有绿原酸、对羟基苯乙酮、 6,7-二甲氧基香豆素外，还首次分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮.
分类号：R914.1
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The Determination of Capillarisin in Artemisia Scoparia by LC/MS
Sun Xiuyan Xing Shanmin Li Minghui Wang Liqun Yuan Jian
(Research Center for Determination and Testing,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015)
Abstract：Analyses and isolation for the choleretic constituents in Artemisia scoparia by TLC , HPLC and 3D-HPLC, and the identification of choleretic constituents were performed by HPLC-ESI/MS. The results showed that besides chlorogenic acid, p-hydroxyacetophenone and 6,7-dimethylesculetin as the choleretic constituents in Artemisia scoparia, it was for the first time that a higher choleretic constituent-capillarisin was isolated and identified.
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Key words：Artemisia scoparia; capillarisia; HPLC; HPLC-MS▲
茵陈自古以来是中医治疗各种肝胆疾病的要药〔1～3〕.近几年，现代药理研究又进一步阐明茵陈其保肝、利胆和护胰机理，此外尚发现其调血脂、降血压、抗肿瘤和抗病毒性反应等新的药理作用〔4～5〕,使得茵陈活性成分的追踪越来越引起人们的重视.《中国药典》1995版规定茵陈的植物基源有两种：滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.，并有大量文献报道其主要有效成分为绿原酸(chlorogenic acid)、6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethylesculetin，DE)、对羟基苯乙酮(p-hydroxyacetophenone)〔6～8〕.1976年，日本学者小宫威弥等人从茵陈蒿中分离出保肝活性比6,7-二甲氧基香豆素更强的物质茵陈色原酮(capillarisin，CAP)〔9〕，滨蒿中是否含有，至今未见报道.作者对沈阳郊区野生滨蒿，分别采用薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、三维高效液相色谱对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离分析，用离子阱质谱(ESI/MS)对待测物准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级全扫描质谱测定.首次从滨蒿中分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮.
, 百拇医药
1 仪器与试药
日本岛津LC-10AD高效液相色谱仪；SPD-M10A二极管阵列检测器；CLASS-10A色谱工作站；美国Finnigan公司LCQ型液相色谱-质谱联用仪，ESI(电喷雾电离)源及LCQ数据处理系统.甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯).标准品：6,7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮由中国中医研究院提供.对照品：对羟基苯乙酮由本校有机教研室提供.药材：采自沈阳郊区，经本校中药鉴定室许春泉老师鉴定为滨蒿Artemisia scoparia Waldst. et Kitag.
2 方法与结果
2.1 样品制备
精密称取干燥、恒重样品5 g，分别用10倍、8倍、6倍量的水煎煮2、1.5、1 h.合并煎液，减压浓缩至20 mL，转移至125 mL分液漏斗中，用氯仿萃取3次(每次20 mL)，合并氯仿液，减压回收氯仿，残渣用甲醇溶解，定量转移至10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，混匀，作为待测液.
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2.2 TLC法
滨蒿待测液中CAP的TLC分析条件见表1.
Tab.1 Analytical conditions of capillarisin in Artemisia scoparia by TLC Solid phase
Developing agent
Standard
Color-developing agent
Rf value
Silica G
benzene-methanol-water(35∶5∶5)
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CAP
FeCl3
0.63
Silica G
toluene-ethylformate-formic acid (7∶3∶1)
CAP
FeCl3
0.50
Polyamide film
water-ethanol-acetylacetone(4∶2∶1)
, 百拇医药 CAP
FeCl3
0.23
实验结果表明，样品在与对照品相应的位置上显相同的灰色斑点.
2.3 HPLC法
HPLC分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm)；流动相：乙腈-水(V∶V=20∶80～90∶10)；梯度洗脱〔10〕，洗脱时间：80 min；流速：1 mL/min；柱温：40℃.
结果：将上述待测液注入液相色谱仪中，HPLC图谱及三维HPLC图谱见图1～3.
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Fig.1 HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6，7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin
Fig.2 HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylescu-letin;C—Capillarisin
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Fig.3 3D-HPLC chromatogram of the standards and its retention time (min)
A—p-Hydroxyacetophenone;B—6,7-Dimethylesculetin;C—Capillarisin
2.4 HPLC-MSn法
HPLC-MSn分析条件：色谱柱：Kromasil C18不锈钢柱(200 mm×4.6 mm I.D，粒径：5 μm)；流动相：甲醇；流速：0.5 mL/min；柱温：20℃；进样量：20 μL；质谱参数设置：离子源喷射电压4.25 kV；毛细管温度：180℃；毛细管电压30 V；鞘气(N2)流速0.75 L/min；辅助气流速0.15 L/min.
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结果：以ESI为离子源采用正离子方式检测，测得标准品准分子离子峰[M+H]+m/z 317.4，然后同时选择m/z 317.4准分子离子峰进行二级全扫描质谱(full scan MS2)分析，并选择m/z 317.4→302.1进行三级全扫描质谱(full scan MS3)分析.获得标准品和待测物相应的子离子质谱图.测定结果见图4～6. CAP的(+)ESI-MS2、ESI-MS3的碎片主要断裂过程见图7.
Fig.4 TIC chromatogram of capillarisin
A—Standard;B—Sample
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Fig.5 Full scan MS2 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample
Fig.6 Full scan MS3 spectra of capillarisin
A—Standard;B—Sample
Fig.7 The main proposed fragmentation process for capillarisin
3 讨论
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a.HPLC测定中发现保留时间为22.82 min的色谱峰和CAP的色谱峰部分重叠.经ESI/MS检测，其准分子离子峰m/z也为317.4，但选择离子MS2、MS3子离子质谱图与CAP的明显不同.其结构鉴定有待于进一步研究.
b.对滨蒿水煎煮液有效成分提取的工艺筛选中，曾用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇4种不同极性的溶剂分别萃取.经HPLC跟踪监测，氯仿两次萃取液中有效成分含量已占90%以上，故选用水煎煮后氯仿萃取.该法与甲醇超声法比较，干扰物质少.
c.据文献报道〔6〕，在8月下旬至10月中旬采割的茵陈中CAP的含量较高，作者所用样品只是对一个地区、选了二次采割时间(8月20日、8月27日).经HPLC初步测得6,7-二甲氧基香豆素约0.5%，对羟基苯乙酮约0.09%.
致谢 HPLC-MS质谱图由本室李雪庆、陈笑艳测试，对羟基苯乙酮由有机教研室胡春老师提供，本文承许春泉、高光恩教授给予指导帮助，特此致谢.■
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参考文献：
[1]李时珍.本草纲目：草部第十五卷.北京：人民卫生出版社，1982.941～943
[2]孙星衍，孙冯翼.神农本草经：卷一.台北：五州出版社，1981.32～33
[3]王占玺，张荣显，许华，等.张仲景药法研究.北京：科学技术出版社，1984.242～244
[4]蒋洁云，徐强，王蓉，等.茵陈抗肿瘤成分的研究.中国药科大学学报，1992， 23(5)：283～286
[5]潘克将，刘惠纯.茵陈蒿汤和茵陈药理研究近况及展望.中成药，1997，19(10)：46～47
[6]徐起初，杨连菊，杨春澍.茵陈的质量研究.中草药，1983，14(1)：35～40
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[7]张启伟，章育中.滨蒿利胆有效成分的含量测定.药学学报，1986， 21(12)：922～927
[8]胡润生，李宝珍，陈玫.滨蒿利胆有效成分的研究.药学学报，1965，12(5)：289～294
[9]小宫威弥.茵陈蒿的研究(第一报)新利胆成分Capillarisin.药学杂志，1976,(7)：841～854
[10]王喜军，孙晖，刘中申.茵陈蒿及其复方制剂中6，7-二甲氧基香豆素和茵陈色原酮的定量研究.中国中药杂志，1994，19(11)：667～670
收稿日期：1999-06-07, 百拇医药