p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响
作者：陈一招 徐如祥 张世忠 邹玲
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；邹玲(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)
关键词：脑肿瘤；神经胶质瘤；p16基因；顺铂
第一军医大学学报000204 摘要: 目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法 采用脂质体转染的方法，将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251，观察p16基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒 PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达，对转染后细胞生长情况 、细胞周期及细胞对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)敏感性的变化进行分析。结果 外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251细胞的生长，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了G1期阻滞，同时，细胞对顺铂 的敏感性降低，化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论 外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，同时降低U251细胞对顺铂的化疗敏感性。p16 基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。
, 百拇医药
中图分类号：R392.12；R730.264 文献标识码：A
文章编号：1000 -2588(2000) 02-0137-04
Effect of p16 gene on the chemosensitivity of human glioma cell line to cis-diamminedichloroplatinum
CHEN Yi-zhao，XU Ru-xiang，ZHANG Shi-zhong，ZOU Ling
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To determine the effect of p16/CDK4I on the cell growth and the chemosensitivity of human glioma cells to cis-diamminedichloroplutinum (CDDP). Methods p16 gene was transfected into human glioma cell line U251 and the expression of exogenous p16 gene was examined. The effect of exogenous p16 gene on the cell growth and chemosensitivity of U251 to CDDP were eobserved. Results Expression of exogenous p16 gene inhibited the growth of U251 dramatically. G1 arrest of tumor cells was observed after transfection. However, wild type p16-positive U251 cells were less sensitive to CDDP than control cells and the number of apoptotic cells following chemotherapy was reduced. Conclusion The expression of exogenous p16 gene can inhibit the growth of glioma cells, but paradoxically, the chemosensitivity of p16-positive glioma cells to CDDP is also decreased.
, 百拇医药
Key words: brain tumor; glioma; p16 gene; cis-diamminedichloroplatinum
p16基因(MTS1, CDK4I, CDKN2)是近年发现的一个重要抑癌基因，其主要作用机制是作为负性调控因子参与细胞周期调节。目前发现，在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，都有p16基因高频率缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达71%～82%[1、2]，显示了P16基因在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。本研究将外源野生型p16基因导入有p16基因纯合性缺失的U251人胶质瘤细胞系，并筛选阳性克隆，发现p16基因在抑制脑胶质瘤细胞的恶性增殖、降低细胞致瘤性的同时，也显著降低了其对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum , CDDP)的化疗敏感性。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 U251细胞系 为人胶质瘤细胞系，由湖南医科大学肿瘤研究所惠赠，其p16基因纯合性缺失，用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养。
1.1.2 质粒 人野生型p16基因质粒PCDNA3-neo-p16由国立日本香川医科大学脑神经外科惠赠。空PCDNA3载体质粒为本实验室常规保存。
1.1.3 抗体 鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。
1.1.4 试剂 G418购自 Amersham公司； DMEM、脂质体(lipofectin)为 GIBCO BRL Life Technologies产品；MTT、 PI购自Sigma公司。MTT溶于0.01 mol/L PBS中，终浓度5 g/L，4oC避光保存。DMSO为 Farco产品。
1.2 方法
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1.2.1 U251细胞的长期稳定转染与筛选 采用脂质体转染的方法，将经分光光度计定量的等量质粒转染入各细胞，500 mg/L G418筛选8周。同时设立空PCDNA3质粒转染对照组。
1.2.2 免疫组织化学 采用ABC法。
1.2.3 细胞生长曲线的描记[3] 1.2.3.1 标准曲线的描记 常规消化U251及转染了PCDNA3空质粒、p16的U251细胞系；调整细胞浓度为106/(200μl.孔)，分别接种于96孔板，倍比稀释至100/(200μl.孔)，每个浓度设3个复孔。5% CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4 h，细胞贴壁后加入20μl MTT，继续孵育4 h后，吸去培养液，加入150μl DMSO，振荡溶解后用酶标仪于570 nm处测定吸光度值。根据吸光度值与细胞浓度绘制标准曲线。
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1.2.3.2 细胞生长曲线的绘制 消化各细胞系，调整细胞浓度为5 000/(200μl.孔)分别接种于96孔板。每24 h取4孔加入20μl MTT，继续孵育4 h后依上法测定吸光度值，对应标准曲线求出细胞浓度，绘制细胞生长曲线。
1.2.4 化疗药敏实验[4] 消化各细胞系，调整细胞浓度为10 000/(200μl.孔)分别接种入96孔板，孵育24 h，吸去培养液，分别加入含一定浓度CDDP的培养液，倍比稀释。空白对照孔加入等容积培养液，37℃、5% CO2培养48 h后，加入20μl MTT，37℃孵育4 h，弃培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测定其D(λ)值，测定波长570 nm。细胞抑制率按下列公式计算：
[对照孔测定的平均D(λ)值 - 加药组测定的平均D(λ)值] /对照孔测定的平均D(λ)值×100%
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1.2.5 流式细胞仪分析 按Nicoletti的方法[5]，常规消化各细胞系后，400目网过滤，200×g离心后将细胞重悬于PI染液中(含PI 50 mg/L，0.1%柠檬酸钠， 0.1% Triton X-100 )，避光4℃过夜后上机检测。
1.2.6 统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析。各细胞对化疗药物的肿瘤杀伤率比较及周期分布的比较采用t检验。
2 结果
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系U251的转染和筛选
用脂质体转染的方法分别将经分光光度计定量后的等量PCDNA3-p16及空质粒转入U251细胞系，用500 mg/L G418筛选。加药约7 d后，大部分细胞死亡。14 d后，转染PCDNA3空质粒的U251细胞组开始出现克隆，26 d后，p16基因转染的两细胞组才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空PCDNA3质粒转染组(图1)。筛选5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，用流式细胞仪筛选高表达克隆。
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图1 U251细胞系p16基因及PCDNA3空质粒转染后G418 500 mg/L筛选27d的克隆形成数比较
Fig.1 Comparison of clone efficiency of U251after transfection and selection (G418 500 mg/L, 27 d)A. PCDNA3 transduced U251; B. p16 transduced U251
2.2 转染后外源p16基因的表达
p16基因免疫组化示，经G418筛选的长期稳定转染p16基因的U251细胞免疫组化呈强阳性，对照组呈阴性(图2)。
图2 p16在人胶质瘤细胞系U251中表达的免疫组化分析 IH×200
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Fig.2 Immunohistochemistry assay of expression of p16 IH×200
A.Positive expression of p16 on p16 transduced U251
B.Negative expression of p16 on PCDNA3 transduced U251
图3 p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
Fig.3 Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of U251
Concentration of CDDP(g/L)
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图 4 p16基因在U251细胞中的表达对顺铂敏感性的影响
Fig.4 Effect of expression of p16 on CDDP sensitivity of U25
2.3 外源p16基因长期稳定表达对U251细胞的抑制作用
图3显示U251-p16(+)与U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的U251细胞系相比，生长速度明显减慢。流式细胞仪分析可见p16基因转染的胶质瘤细胞系二倍体峰后细胞及四倍体细胞明显减少，无明显的亚G1峰(凋亡峰，图5)。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显上升(P<0.01)。
图5 U251, U251-p16及化疗后的流式细胞仪分析 PI染色
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Fig.5 Comparison of flow cytometric DNA fluorescence profiles of U251 cells PI fluorescence stainig
A. U251
B. p16 transduced U251-p16
C. U251 after treatment of CDDP(50(g/ml)
D.U251-p16 after treatment of CDDP(50 g/ml)
2.4 外源p16基因转染对U251细胞CDDP敏感性的影响
图4示不同浓度CDDP对U251-p16、U251-PCDNA3的肿瘤细胞杀伤率。转染p16基因的U251-p16细胞对CDDP的敏感性明显降低，与U251-PCDNA3相比，差异有显著意义(P<0.01)。
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2.5 CDDP对U251-PCDNA3，U251-p16细胞作用的流式细胞仪分析
图5为U251-p16，U251-PCDNA3在50 mg/L CDDP作用48 h后的流式细胞仪分析图。CDDP作用48 h后，U251-PCDNA3各周期细胞数急剧减少，只可见一孤立的亚G1峰，与此对比，U251-p16在CDDP作用下亚G1峰明显较小(P<0.01)，各周期细胞仍部分存留。
3 讨论
p16基因是目前脑胶质瘤研究中所发现的缺失率、突变率最高的基因。据统计，在目前所研究的胶质瘤细胞株中，其缺失率达82%[1]，而在原发性脑胶质瘤中也多达71%[2]，充分显示了p16基因异常与脑胶质瘤发生发展的密切关系。目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)-细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体(cyclin D-CDK)，从而达到对细胞由G1期到S期的调控。当细胞由于某种原因使p16基因缺失或失活后，cyclin D-CDK复合体持续高活性存在于细胞内，进而导致pRb基因的磷酸化而释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期失控[6]。本实验将p16基因导入胶质瘤细胞株U251，结果胶质瘤细胞的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可能导致细胞的恶性增殖。
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p16基因与胶质瘤细胞化疗敏感性间的关系是目前研究较少的一个问题。我们的研究发现，将p16基因导入U251细胞后，U251细胞对CDDP的敏感性降低。流式细胞仪分析提示，U251细胞经p16基因稳定转染后，在等剂量的CDDP作用下，其凋亡细胞数明显减少。我们认为，p16基因发挥抑制CDDP诱导细胞凋亡这一作用的机制可能主要有以下几个方面：首先，p16基因通过诱导肿瘤细胞的G1期阻滞，将大多数细胞阻滞在G1期，减少了S、G2、M期的细胞数，进而使以S、G2为主要作用时相的周期特异性化疗药难以有效发挥其杀伤与诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而降低了细胞的敏感性；另一方面，在p16基因的作用下，大多数细胞发生了G1期阻滞，有利于细胞在损伤刺激下对损伤的DNA进行修复，增加细胞对DNA损伤的耐受性，这两方面共同作用，使肿瘤细胞对CDDP的敏感性降低。最近，Datta、Kaufmann相继报道[7、8]，VP-16，CDDP等在诱导肿瘤细胞凋亡时，均激活了一系列白介素-1β转换酶(caspase)的活性。另外，Kasibhatla[9]发现，某些化疗药物如VM-26还可以通过增加FasL的表达诱导细胞凋亡。然而，p16基因与这些凋亡相关基因的关系及相互作用仍不十分清楚， p16基因是否能通过这些途径影响细胞凋亡，尚有待进一步深入研究。
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p16基因与脑胶质瘤恶性转化的密切关系及其相对分子量小、易于操作等诸多优点，使之成为人们进行脑胶质瘤基因治疗的良好靶基因之一。但我们认为，在肿瘤得到有效根治之前，肿瘤治疗仍然靠手术、化疗、放疗、生物治疗等措施的综合运用。因此，在我们分析某一因素对肿瘤治疗作用的同时，必须考虑它与其他治疗措施的关系及相互作用，只有这样，才能获得肿瘤治疗的最佳疗效。
基金项目：国家自然科学基金(39700143)
作者简介：陈一招(1974-)，男，湖南长沙人，第一军医大学珠江医院神经外科在读研究生，电话：85143642，E-mail: Chenyizhao@163. net
参考文献
1，Kamb A, Gruis NA, Weaver Feidhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J]. Science, 1994, 15:264(5157):436～40.
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2，Walker. DG, Duan W, Popovic EA et al. Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytoma[J]. Cancer Res, 1995, 55:20～23.
3，郝新保, 张利朝. MTT 法测定细胞生长曲线[J]. 第四军医大学学报, 1997, 18 (4):190～3.
4，李杰, 刘玉琴. MTT 法在肿瘤研究中的改良及应用进展[J].中国肿瘤临床, 1998, 25 (4):312～3.
5，Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry[J].J Immunol Methods, 1991, 139:271～9.
, http://www.100md.com
6，Peter B, Dirksk JT, Rutka et al. Current concepts in neuro-oncology: the cell cycle a review[J]. Neurosurgery, 1997, 40 (5) :1000～13; discussion 1013～5.
7，Datta R, Banach D, Kojima H et al. Activation of the CPP32 protease in apoptosis induced by 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine and other DNA-damaging agents[J]. Blood, 1996, 88(6):1936～43.
8，Kaufmann SH, Desnoyers S, Ottavianoy et al. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis[J].Cancer Res, 1993, 53(17):3976～85.
9，Kasibhatla S, Brunner T, Genestier L et al. DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation of NF-kappa B and AP-1[J]. Mol Cell. 1998, 1(4):543～51.
收稿日期：1999-11-05, http://www.100md.com
单位：陈一招(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；徐如祥(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；张世忠(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)；邹玲(第一军医大学珠江医院神经外科，广东 广州 510282)
关键词：脑肿瘤；神经胶质瘤；p16基因；顺铂
第一军医大学学报000204 摘要: 目的 探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法 采用脂质体转染的方法，将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251，观察p16基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用，并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒 PCDNA3为对照。免疫组化、Northern杂交检测p16基因表达，对转染后细胞生长情况 、细胞周期及细胞对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)敏感性的变化进行分析。结果 外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251细胞的生长，克隆形成率减少，肿瘤细胞发生了G1期阻滞，同时，细胞对顺铂 的敏感性降低，化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论 外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖，同时降低U251细胞对顺铂的化疗敏感性。p16 基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。
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中图分类号：R392.12；R730.264 文献标识码：A
文章编号：1000 -2588(2000) 02-0137-04
Effect of p16 gene on the chemosensitivity of human glioma cell line to cis-diamminedichloroplatinum
CHEN Yi-zhao，XU Ru-xiang，ZHANG Shi-zhong，ZOU Ling
(Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To determine the effect of p16/CDK4I on the cell growth and the chemosensitivity of human glioma cells to cis-diamminedichloroplutinum (CDDP). Methods p16 gene was transfected into human glioma cell line U251 and the expression of exogenous p16 gene was examined. The effect of exogenous p16 gene on the cell growth and chemosensitivity of U251 to CDDP were eobserved. Results Expression of exogenous p16 gene inhibited the growth of U251 dramatically. G1 arrest of tumor cells was observed after transfection. However, wild type p16-positive U251 cells were less sensitive to CDDP than control cells and the number of apoptotic cells following chemotherapy was reduced. Conclusion The expression of exogenous p16 gene can inhibit the growth of glioma cells, but paradoxically, the chemosensitivity of p16-positive glioma cells to CDDP is also decreased.
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Key words: brain tumor; glioma; p16 gene; cis-diamminedichloroplatinum
p16基因(MTS1, CDK4I, CDKN2)是近年发现的一个重要抑癌基因，其主要作用机制是作为负性调控因子参与细胞周期调节。目前发现，在多种肿瘤细胞系及临床肿瘤标本中，都有p16基因高频率缺失及突变，尤其以脑胶质瘤细胞为最高，达71%～82%[1、2]，显示了P16基因在脑胶质瘤恶性转化中的重要作用。本研究将外源野生型p16基因导入有p16基因纯合性缺失的U251人胶质瘤细胞系，并筛选阳性克隆，发现p16基因在抑制脑胶质瘤细胞的恶性增殖、降低细胞致瘤性的同时，也显著降低了其对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum , CDDP)的化疗敏感性。
1 材料和方法
1.1 材料
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1.1.1 U251细胞系 为人胶质瘤细胞系，由湖南医科大学肿瘤研究所惠赠，其p16基因纯合性缺失，用含10%小牛血清的DMEM高糖培养基培养。
1.1.2 质粒 人野生型p16基因质粒PCDNA3-neo-p16由国立日本香川医科大学脑神经外科惠赠。空PCDNA3载体质粒为本实验室常规保存。
1.1.3 抗体 鼠抗p16单克隆抗体购自武汉博士德公司。免疫组化ABC试剂盒为VECTOR产品。
1.1.4 试剂 G418购自 Amersham公司； DMEM、脂质体(lipofectin)为 GIBCO BRL Life Technologies产品；MTT、 PI购自Sigma公司。MTT溶于0.01 mol/L PBS中，终浓度5 g/L，4oC避光保存。DMSO为 Farco产品。
1.2 方法
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1.2.1 U251细胞的长期稳定转染与筛选 采用脂质体转染的方法，将经分光光度计定量的等量质粒转染入各细胞，500 mg/L G418筛选8周。同时设立空PCDNA3质粒转染对照组。
1.2.2 免疫组织化学 采用ABC法。
1.2.3 细胞生长曲线的描记[3] 1.2.3.1 标准曲线的描记 常规消化U251及转染了PCDNA3空质粒、p16的U251细胞系；调整细胞浓度为106/(200μl.孔)，分别接种于96孔板，倍比稀释至100/(200μl.孔)，每个浓度设3个复孔。5% CO2、37℃二氧化碳孵箱中培养4 h，细胞贴壁后加入20μl MTT，继续孵育4 h后，吸去培养液，加入150μl DMSO，振荡溶解后用酶标仪于570 nm处测定吸光度值。根据吸光度值与细胞浓度绘制标准曲线。
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1.2.3.2 细胞生长曲线的绘制 消化各细胞系，调整细胞浓度为5 000/(200μl.孔)分别接种于96孔板。每24 h取4孔加入20μl MTT，继续孵育4 h后依上法测定吸光度值，对应标准曲线求出细胞浓度，绘制细胞生长曲线。
1.2.4 化疗药敏实验[4] 消化各细胞系，调整细胞浓度为10 000/(200μl.孔)分别接种入96孔板，孵育24 h，吸去培养液，分别加入含一定浓度CDDP的培养液，倍比稀释。空白对照孔加入等容积培养液，37℃、5% CO2培养48 h后，加入20μl MTT，37℃孵育4 h，弃培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测定其D(λ)值，测定波长570 nm。细胞抑制率按下列公式计算：
[对照孔测定的平均D(λ)值 - 加药组测定的平均D(λ)值] /对照孔测定的平均D(λ)值×100%
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1.2.5 流式细胞仪分析 按Nicoletti的方法[5]，常规消化各细胞系后，400目网过滤，200×g离心后将细胞重悬于PI染液中(含PI 50 mg/L，0.1%柠檬酸钠， 0.1% Triton X-100 )，避光4℃过夜后上机检测。
1.2.6 统计学分析 曲线之间的比较采用方差分析。各细胞对化疗药物的肿瘤杀伤率比较及周期分布的比较采用t检验。
2 结果
2.1 表达p16基因的胶质瘤细胞系U251的转染和筛选
用脂质体转染的方法分别将经分光光度计定量后的等量PCDNA3-p16及空质粒转入U251细胞系，用500 mg/L G418筛选。加药约7 d后，大部分细胞死亡。14 d后，转染PCDNA3空质粒的U251细胞组开始出现克隆，26 d后，p16基因转染的两细胞组才开始有克隆形成，且p16基因转染组的克隆形成数目明显少于空PCDNA3质粒转染组(图1)。筛选5周后，从每株细胞中挑取2～4个克隆进行单克隆化，用流式细胞仪筛选高表达克隆。
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图1 U251细胞系p16基因及PCDNA3空质粒转染后G418 500 mg/L筛选27d的克隆形成数比较
Fig.1 Comparison of clone efficiency of U251after transfection and selection (G418 500 mg/L, 27 d)A. PCDNA3 transduced U251; B. p16 transduced U251
2.2 转染后外源p16基因的表达
p16基因免疫组化示，经G418筛选的长期稳定转染p16基因的U251细胞免疫组化呈强阳性，对照组呈阴性(图2)。
图2 p16在人胶质瘤细胞系U251中表达的免疫组化分析 IH×200
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Fig.2 Immunohistochemistry assay of expression of p16 IH×200
A.Positive expression of p16 on p16 transduced U251
B.Negative expression of p16 on PCDNA3 transduced U251
图3 p16基因表达对脑胶质瘤细胞系U251生长的影响
Fig.3 Effect of expression of wild-type p16 on the growth rate of U251
Concentration of CDDP(g/L)
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图 4 p16基因在U251细胞中的表达对顺铂敏感性的影响
Fig.4 Effect of expression of p16 on CDDP sensitivity of U25
2.3 外源p16基因长期稳定表达对U251细胞的抑制作用
图3显示U251-p16(+)与U251亲代及分别转染PCDNA3空质粒的U251细胞系相比，生长速度明显减慢。流式细胞仪分析可见p16基因转染的胶质瘤细胞系二倍体峰后细胞及四倍体细胞明显减少，无明显的亚G1峰(凋亡峰，图5)。细胞周期分析提示p16基因转染后胶质瘤G1/G0期细胞比例明显上升(P<0.01)。
图5 U251, U251-p16及化疗后的流式细胞仪分析 PI染色
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Fig.5 Comparison of flow cytometric DNA fluorescence profiles of U251 cells PI fluorescence stainig
A. U251
B. p16 transduced U251-p16
C. U251 after treatment of CDDP(50(g/ml)
D.U251-p16 after treatment of CDDP(50 g/ml)
2.4 外源p16基因转染对U251细胞CDDP敏感性的影响
图4示不同浓度CDDP对U251-p16、U251-PCDNA3的肿瘤细胞杀伤率。转染p16基因的U251-p16细胞对CDDP的敏感性明显降低，与U251-PCDNA3相比，差异有显著意义(P<0.01)。
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2.5 CDDP对U251-PCDNA3，U251-p16细胞作用的流式细胞仪分析
图5为U251-p16，U251-PCDNA3在50 mg/L CDDP作用48 h后的流式细胞仪分析图。CDDP作用48 h后，U251-PCDNA3各周期细胞数急剧减少，只可见一孤立的亚G1峰，与此对比，U251-p16在CDDP作用下亚G1峰明显较小(P<0.01)，各周期细胞仍部分存留。
3 讨论
p16基因是目前脑胶质瘤研究中所发现的缺失率、突变率最高的基因。据统计，在目前所研究的胶质瘤细胞株中，其缺失率达82%[1]，而在原发性脑胶质瘤中也多达71%[2]，充分显示了p16基因异常与脑胶质瘤发生发展的密切关系。目前认为，p16基因的主要作用是特异性的抑制细胞周期素D(cyclin D)-细胞周期素依赖性激酶(CDK)复合体(cyclin D-CDK)，从而达到对细胞由G1期到S期的调控。当细胞由于某种原因使p16基因缺失或失活后，cyclin D-CDK复合体持续高活性存在于细胞内，进而导致pRb基因的磷酸化而释放转录因子E2F等，从而激活其他细胞增殖相关基因，导致细胞从G1期到S期失控[6]。本实验将p16基因导入胶质瘤细胞株U251，结果胶质瘤细胞的生长速度明显减慢，肿瘤细胞被阻滞在G1/G0期，充分证实了野生型p16基因能抑制肿瘤生长，其缺失及突变可能导致细胞的恶性增殖。
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p16基因与胶质瘤细胞化疗敏感性间的关系是目前研究较少的一个问题。我们的研究发现，将p16基因导入U251细胞后，U251细胞对CDDP的敏感性降低。流式细胞仪分析提示，U251细胞经p16基因稳定转染后，在等剂量的CDDP作用下，其凋亡细胞数明显减少。我们认为，p16基因发挥抑制CDDP诱导细胞凋亡这一作用的机制可能主要有以下几个方面：首先，p16基因通过诱导肿瘤细胞的G1期阻滞，将大多数细胞阻滞在G1期，减少了S、G2、M期的细胞数，进而使以S、G2为主要作用时相的周期特异性化疗药难以有效发挥其杀伤与诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而降低了细胞的敏感性；另一方面，在p16基因的作用下，大多数细胞发生了G1期阻滞，有利于细胞在损伤刺激下对损伤的DNA进行修复，增加细胞对DNA损伤的耐受性，这两方面共同作用，使肿瘤细胞对CDDP的敏感性降低。最近，Datta、Kaufmann相继报道[7、8]，VP-16，CDDP等在诱导肿瘤细胞凋亡时，均激活了一系列白介素-1β转换酶(caspase)的活性。另外，Kasibhatla[9]发现，某些化疗药物如VM-26还可以通过增加FasL的表达诱导细胞凋亡。然而，p16基因与这些凋亡相关基因的关系及相互作用仍不十分清楚， p16基因是否能通过这些途径影响细胞凋亡，尚有待进一步深入研究。
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p16基因与脑胶质瘤恶性转化的密切关系及其相对分子量小、易于操作等诸多优点，使之成为人们进行脑胶质瘤基因治疗的良好靶基因之一。但我们认为，在肿瘤得到有效根治之前，肿瘤治疗仍然靠手术、化疗、放疗、生物治疗等措施的综合运用。因此，在我们分析某一因素对肿瘤治疗作用的同时，必须考虑它与其他治疗措施的关系及相互作用，只有这样，才能获得肿瘤治疗的最佳疗效。
基金项目：国家自然科学基金(39700143)
作者简介：陈一招(1974-)，男，湖南长沙人，第一军医大学珠江医院神经外科在读研究生，电话：85143642，E-mail: Chenyizhao@163. net
参考文献
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收稿日期：1999-11-05, http://www.100md.com