细胞内抗体：抗病毒感染和肿瘤性疾病的新治疗计划
作者：郝连杰(译)
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000212Intrazelluläre Antikörper: Ein neues Therapiekonzept
gegen Virusinfektionen und Tumorerkrankungen
Hubert E.Blum
抗体(免疫球蛋白)是免疫系统的重要组成部分，长久以来由于它的特异性和高亲和力被应用于分离和纯化靶抗原。近年研究指出，抗体还能在细胞内结合其相应抗原，在细胞内以特殊的方式干扰重要的生物过程。因此，细胞内抗体在理论上可能是针对病毒感染和肿瘤疾病的特异性治疗方法。
, http://www.100md.com
抗体：结构和功能
免疫球蛋白是B淋巴细胞形成的糖蛋白，是各种哺乳动物体液免疫应答的主要成分，能与诱导抗体形成的抗原特异性结合。各种抗体均由两相同的“轻链”和相同的“重链”构成，可被不同的蛋白酶裂解。木瓜蛋白酶(papain)蛋白酶水解获得的Fab段由抗体的轻链以及重链的可变区(VH)和第一稳定区(CH1)组成。合成的单链-FV-片段(sFv)仅是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一短肽结合序列共价相连接而成。
抗体和其片段在医学基础研究和疾病的诊断及治疗中有极重要的意义。Khler 和Milstein 1975年报道从杂交瘤(浆细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤)制备特异性单克隆抗体是制备高特异性抗体制剂的关键步骤。
细胞内抗体：原理
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现在可以用基因技术方法分离和鉴定编码抗体分子多肽链的DNA序列。从杂交瘤细胞系分离细胞RNA后，首先用逆转录酶转录成cDNA，接着再用特异性寡脱氧核苷酸聚合酶链反应扩增免疫球蛋白-cDNA(所谓RT-PCR)。所得到的PCR-产物直接作序列分析，鉴定可用基因技术制备某种抗体的基因。从骨髓瘤细胞、猴肾细胞(CHS)以及细菌、酵母、昆虫细胞和植物中能成功地生产出单克隆抗体，说明许多来自微生物和细胞系统能合成有功能的免疫球蛋白分子，提示多种细胞类型可以制备出结构正确有皱叠的抗体，为细胞内抗体的广泛应用提供了先决条件。
正常情况抗体被细胞分泌到血清中或者细胞培养基中，很易纯化。对抗体分泌具有重要意义的是长约20个氨基酸短肽序列(所谓信号系列)，它提供免疫球蛋白链的遗传信息，介导合成蛋白细胞内转运进入细胞内质网内。在内质网的氧化环境内，抗体重链和轻链相互结合成为异二聚体(Heterodimeren)。接着通过高尔基器分泌出矫正过有皱叠的抗体分子。抗体的Fab-段或sFv-段在细胞内应用有其优越性，Fab-段是二硫键结合的二蛋白链，在细胞浆的还原环境中构成效率甚低。因此，Fab-段主要要求应用于内质网。而非自然形成sFv-段最适宜细胞内应用，它的功能并不要求单个肽链间的二硫键结合。
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用抗体修饰细胞内某种蛋白质的功能，首先需要确定出能结合这种蛋白质的单克隆抗体，再用RT-PCR从杂交瘤细胞系分离、鉴定出这种抗体免疫球蛋白重链和轻链可变区的编码序列。此外，也可以通过“噬菌体展现”(“phage-display”)步骤选择恰当的抗体片段和分离相应的遗传信息。含有编码免疫球蛋白重链和轻链可变区序列的分离物可借助PCR技术，用一编码短结合肽DNA序列相连接，构成sFv片段。将最终的DNA匣(DNA-Kassette)插入DNA-载体，即可在靶细胞表达出抗体片段。因为正常介导抗体分泌的信号序列未与表达载体整合，新合成的抗体分子在胞浆内，与其靶抗原蛋白相整合。通过引入细胞内蛋白转运到一定细胞部位的短肽序列信息，可以指导细胞内实验抗体片段，进入根据需要与靶分子相互作用的部位，例如细胞核或者线粒体。如果仍然保留信号序列，抗体将被转运到内质网。在内质网内按需要通过特异性肽滞留信号可抑制细胞继续分泌。最后还可以分析抗体与靶抗原相互作用的效果，针对病毒感染作用的抗体可以分析抗体抑制病毒抗原的合成和复制作用；针对肿瘤的抗体可以分析抗体的细胞抑制或细胞毒性作用。
, 百拇医药
细胞内抗体：试验性应用
阻断肿瘤蛋白 ras-原癌基因p21ras是一膜相关蛋白质，在细胞生长和分化过程中具有关键性功能。多种肿瘤的形成中ras-蛋白突变起着病因性作用。用微注射将ras-特异性、编码sFv的mRNA注射入爪蟾卵子内，几乎可以完全阻断ras依赖减数分裂卵子细胞的成熟。在结肠和胰腺癌细胞系，用腺病毒转导带有ras-特异性细胞内抗体片段基因信息，可以明显降低细胞分裂。在小鼠皮下移植相应的细胞系后，肿瘤内直接注入重组腺病毒，可以使肿瘤生长降低。细胞内抗体片段也可在细胞核内发挥作用，乳腺癌细胞系细胞核内过度表达细胞周期调节蛋白Cyclin-D，通过Cyclin-D特异性sFv可明显改变细胞的显性型，并且能提高对顺铂(Cisplatin)的化学敏感性。
下调生长因子-受体 生长因子-受体往往在恶性变细胞表面表达，细胞内抗体片段可降低其表达。人类白介素-2-受体α亚单位(IL-2Rα)主要在某些T-细胞白血病过度表达。从产生IL-2Rα细胞内质网制备出的细胞内抗体片段，可以完全抑制IL-2Rα的表达，从而使细胞不能再接受白介素-2的刺激。用“上皮生长因子受体”(EGRR)稳定转导的纤维母细胞也可得到同样的结果。在这细胞内通过给予EGF，诱导EGFR磷基化，可被细胞内质网内针对EGFR的细胞内抗体 sFv显著降低。此外还可降低细胞的生长。用逆转录病毒介导EGFR-特异性sFv基因转移入人类肿瘤细胞系，可导致细胞克隆形成明显减少。
, 百拇医药
erbB-2跨膜蛋白是在肿瘤细胞表面过度表达的酪氨酸激酶受体，通过细胞内抗体在内质网内可使erbB-2的表面表达明显降低，导致生长停滞和细胞向非转化显性型逆转。通过给予用带有erbB-2-特异性细胞内抗体基因信息的腺病毒，也可使腹腔内接种人类erbB-2过度表达的卵巢癌小鼠的存活期得到显著延长，诱导程序性死亡(Apoptose，凋亡)在肿瘤细胞具有重要意义。这一体内实验的初步成果是进一步临床试验性治疗方案的依据。
抗病毒治疗 细胞内抗体的许多基础性研究工作涉及试验性抗病毒治疗，特别是人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染的治疗。最初的治疗策略是试验性干预病毒外膜蛋白gp160，gp160经过蛋白水解成为gp120和gp41。gp120是跨膜锚锭蛋白，而gp41为膜表面蛋白，二者形成复合物gp160。gp120是病毒与宿主细胞CD4受体相互作用的病毒蛋白。表面带有gp120的感染细胞能形成合胞体，此对于受累细胞的毁灭起重要作用。从产生HIV的细胞内质网中制备出的gp160特异性sFv，可降低gp160 的蛋白水解，从而可减少合胞体的形成及该细胞产生的病毒颗粒的感染性。
, 百拇医药
HIV-Tat-蛋白是细胞内抗体干预非常适合的目标，Tat在感染细胞胞浆内合成，转运到细胞核内发挥作用。在细胞核内能使HIV-1启动子的转录功能增加百倍以上。Tat-特异性sFv在转化的细胞浆内，可阻断报导基因的Tat-依赖性转录和Tat的白细胞内转运。推测对于转运的抑制起着决定性作用。稳定转染的淋巴细胞因为Tat-特异性sFv的表达，对HIV感染出现耐受现象，逆转录病毒介导的Tat-特异性sFv-阳性淋巴细胞显示对病毒的阻断作用显著强于gp160-特异性sFv。现在正在进行Tat-特异性sFv 转导自身CD4阳性淋巴细胞，再输入给无症状病人的Ⅰ期临床研究，研究细胞内抗体的安全性和基因转导抗体的效果。
作用于转录后的调节蛋白Rev也可用做细胞内抗体的靶目标。与Tat-蛋白相似，Rev-特异性sFv可使病毒蛋白停滞在细胞浆内，并阻止它向细胞核内转移。通过转导Rev-特异性sFv基因信息给T淋巴细胞或肺泡巨噬细胞，可以使这些细胞获得保护，不受HIV感染的侵犯。试验证实对于病毒复制和形态形成起作用的病毒蛋白质还有逆转录酶、整合酶、基质蛋白p17以及核衣壳蛋白p7。
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应用细胞内抗体片段治疗其它病毒性感染现今也在积极地研究。针对乙型肝炎病毒(HBV)膜蛋白(HBsAg)的sFv可以降低转染肝癌细胞的HBsAg分泌5%～10%。并可在细胞的内质网内检出sFv-抗原复合物。针对HBV-聚合酶、核蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)以及16型人类乳突瘤病毒E7肿瘤蛋白的sFv复合物作为抗病毒治疗策略也在进行评价中。
总结和展望
针对病毒或肿瘤的细胞内抗体是高度特异性基因治疗策略，其生物学基础研究日益增多，可以通过细胞内抗体影响酶功能、蛋白质的相互作用和定位。目前仅是对细胞内抗体的初步临床研究，常规应用基因治疗还有许多问题待解决，除转基因的疗效外，还有其间期、强度和免疫原性等问题。细胞内抗体在临床常规应用尚有待时日。, 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院
关键词：
德国医学000212Intrazelluläre Antikörper: Ein neues Therapiekonzept
gegen Virusinfektionen und Tumorerkrankungen
Hubert E.Blum
抗体(免疫球蛋白)是免疫系统的重要组成部分，长久以来由于它的特异性和高亲和力被应用于分离和纯化靶抗原。近年研究指出，抗体还能在细胞内结合其相应抗原，在细胞内以特殊的方式干扰重要的生物过程。因此，细胞内抗体在理论上可能是针对病毒感染和肿瘤疾病的特异性治疗方法。
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抗体：结构和功能
免疫球蛋白是B淋巴细胞形成的糖蛋白，是各种哺乳动物体液免疫应答的主要成分，能与诱导抗体形成的抗原特异性结合。各种抗体均由两相同的“轻链”和相同的“重链”构成，可被不同的蛋白酶裂解。木瓜蛋白酶(papain)蛋白酶水解获得的Fab段由抗体的轻链以及重链的可变区(VH)和第一稳定区(CH1)组成。合成的单链-FV-片段(sFv)仅是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一短肽结合序列共价相连接而成。
抗体和其片段在医学基础研究和疾病的诊断及治疗中有极重要的意义。Khler 和Milstein 1975年报道从杂交瘤(浆细胞和骨髓瘤细胞的杂交瘤)制备特异性单克隆抗体是制备高特异性抗体制剂的关键步骤。
细胞内抗体：原理
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现在可以用基因技术方法分离和鉴定编码抗体分子多肽链的DNA序列。从杂交瘤细胞系分离细胞RNA后，首先用逆转录酶转录成cDNA，接着再用特异性寡脱氧核苷酸聚合酶链反应扩增免疫球蛋白-cDNA(所谓RT-PCR)。所得到的PCR-产物直接作序列分析，鉴定可用基因技术制备某种抗体的基因。从骨髓瘤细胞、猴肾细胞(CHS)以及细菌、酵母、昆虫细胞和植物中能成功地生产出单克隆抗体，说明许多来自微生物和细胞系统能合成有功能的免疫球蛋白分子，提示多种细胞类型可以制备出结构正确有皱叠的抗体，为细胞内抗体的广泛应用提供了先决条件。
正常情况抗体被细胞分泌到血清中或者细胞培养基中，很易纯化。对抗体分泌具有重要意义的是长约20个氨基酸短肽序列(所谓信号系列)，它提供免疫球蛋白链的遗传信息，介导合成蛋白细胞内转运进入细胞内质网内。在内质网的氧化环境内，抗体重链和轻链相互结合成为异二聚体(Heterodimeren)。接着通过高尔基器分泌出矫正过有皱叠的抗体分子。抗体的Fab-段或sFv-段在细胞内应用有其优越性，Fab-段是二硫键结合的二蛋白链，在细胞浆的还原环境中构成效率甚低。因此，Fab-段主要要求应用于内质网。而非自然形成sFv-段最适宜细胞内应用，它的功能并不要求单个肽链间的二硫键结合。
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用抗体修饰细胞内某种蛋白质的功能，首先需要确定出能结合这种蛋白质的单克隆抗体，再用RT-PCR从杂交瘤细胞系分离、鉴定出这种抗体免疫球蛋白重链和轻链可变区的编码序列。此外，也可以通过“噬菌体展现”(“phage-display”)步骤选择恰当的抗体片段和分离相应的遗传信息。含有编码免疫球蛋白重链和轻链可变区序列的分离物可借助PCR技术，用一编码短结合肽DNA序列相连接，构成sFv片段。将最终的DNA匣(DNA-Kassette)插入DNA-载体，即可在靶细胞表达出抗体片段。因为正常介导抗体分泌的信号序列未与表达载体整合，新合成的抗体分子在胞浆内，与其靶抗原蛋白相整合。通过引入细胞内蛋白转运到一定细胞部位的短肽序列信息，可以指导细胞内实验抗体片段，进入根据需要与靶分子相互作用的部位，例如细胞核或者线粒体。如果仍然保留信号序列，抗体将被转运到内质网。在内质网内按需要通过特异性肽滞留信号可抑制细胞继续分泌。最后还可以分析抗体与靶抗原相互作用的效果，针对病毒感染作用的抗体可以分析抗体抑制病毒抗原的合成和复制作用；针对肿瘤的抗体可以分析抗体的细胞抑制或细胞毒性作用。
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细胞内抗体：试验性应用
阻断肿瘤蛋白 ras-原癌基因p21ras是一膜相关蛋白质，在细胞生长和分化过程中具有关键性功能。多种肿瘤的形成中ras-蛋白突变起着病因性作用。用微注射将ras-特异性、编码sFv的mRNA注射入爪蟾卵子内，几乎可以完全阻断ras依赖减数分裂卵子细胞的成熟。在结肠和胰腺癌细胞系，用腺病毒转导带有ras-特异性细胞内抗体片段基因信息，可以明显降低细胞分裂。在小鼠皮下移植相应的细胞系后，肿瘤内直接注入重组腺病毒，可以使肿瘤生长降低。细胞内抗体片段也可在细胞核内发挥作用，乳腺癌细胞系细胞核内过度表达细胞周期调节蛋白Cyclin-D，通过Cyclin-D特异性sFv可明显改变细胞的显性型，并且能提高对顺铂(Cisplatin)的化学敏感性。
下调生长因子-受体 生长因子-受体往往在恶性变细胞表面表达，细胞内抗体片段可降低其表达。人类白介素-2-受体α亚单位(IL-2Rα)主要在某些T-细胞白血病过度表达。从产生IL-2Rα细胞内质网制备出的细胞内抗体片段，可以完全抑制IL-2Rα的表达，从而使细胞不能再接受白介素-2的刺激。用“上皮生长因子受体”(EGRR)稳定转导的纤维母细胞也可得到同样的结果。在这细胞内通过给予EGF，诱导EGFR磷基化，可被细胞内质网内针对EGFR的细胞内抗体 sFv显著降低。此外还可降低细胞的生长。用逆转录病毒介导EGFR-特异性sFv基因转移入人类肿瘤细胞系，可导致细胞克隆形成明显减少。
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erbB-2跨膜蛋白是在肿瘤细胞表面过度表达的酪氨酸激酶受体，通过细胞内抗体在内质网内可使erbB-2的表面表达明显降低，导致生长停滞和细胞向非转化显性型逆转。通过给予用带有erbB-2-特异性细胞内抗体基因信息的腺病毒，也可使腹腔内接种人类erbB-2过度表达的卵巢癌小鼠的存活期得到显著延长，诱导程序性死亡(Apoptose，凋亡)在肿瘤细胞具有重要意义。这一体内实验的初步成果是进一步临床试验性治疗方案的依据。
抗病毒治疗 细胞内抗体的许多基础性研究工作涉及试验性抗病毒治疗，特别是人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染的治疗。最初的治疗策略是试验性干预病毒外膜蛋白gp160，gp160经过蛋白水解成为gp120和gp41。gp120是跨膜锚锭蛋白，而gp41为膜表面蛋白，二者形成复合物gp160。gp120是病毒与宿主细胞CD4受体相互作用的病毒蛋白。表面带有gp120的感染细胞能形成合胞体，此对于受累细胞的毁灭起重要作用。从产生HIV的细胞内质网中制备出的gp160特异性sFv，可降低gp160 的蛋白水解，从而可减少合胞体的形成及该细胞产生的病毒颗粒的感染性。
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HIV-Tat-蛋白是细胞内抗体干预非常适合的目标，Tat在感染细胞胞浆内合成，转运到细胞核内发挥作用。在细胞核内能使HIV-1启动子的转录功能增加百倍以上。Tat-特异性sFv在转化的细胞浆内，可阻断报导基因的Tat-依赖性转录和Tat的白细胞内转运。推测对于转运的抑制起着决定性作用。稳定转染的淋巴细胞因为Tat-特异性sFv的表达，对HIV感染出现耐受现象，逆转录病毒介导的Tat-特异性sFv-阳性淋巴细胞显示对病毒的阻断作用显著强于gp160-特异性sFv。现在正在进行Tat-特异性sFv 转导自身CD4阳性淋巴细胞，再输入给无症状病人的Ⅰ期临床研究，研究细胞内抗体的安全性和基因转导抗体的效果。
作用于转录后的调节蛋白Rev也可用做细胞内抗体的靶目标。与Tat-蛋白相似，Rev-特异性sFv可使病毒蛋白停滞在细胞浆内，并阻止它向细胞核内转移。通过转导Rev-特异性sFv基因信息给T淋巴细胞或肺泡巨噬细胞，可以使这些细胞获得保护，不受HIV感染的侵犯。试验证实对于病毒复制和形态形成起作用的病毒蛋白质还有逆转录酶、整合酶、基质蛋白p17以及核衣壳蛋白p7。
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应用细胞内抗体片段治疗其它病毒性感染现今也在积极地研究。针对乙型肝炎病毒(HBV)膜蛋白(HBsAg)的sFv可以降低转染肝癌细胞的HBsAg分泌5%～10%。并可在细胞的内质网内检出sFv-抗原复合物。针对HBV-聚合酶、核蛋白、丙型肝炎病毒(HCV)以及16型人类乳突瘤病毒E7肿瘤蛋白的sFv复合物作为抗病毒治疗策略也在进行评价中。
总结和展望
针对病毒或肿瘤的细胞内抗体是高度特异性基因治疗策略，其生物学基础研究日益增多，可以通过细胞内抗体影响酶功能、蛋白质的相互作用和定位。目前仅是对细胞内抗体的初步临床研究，常规应用基因治疗还有许多问题待解决，除转基因的疗效外，还有其间期、强度和免疫原性等问题。细胞内抗体在临床常规应用尚有待时日。, 百拇医药