PCR-SSCP技术检测原发性胃腺癌石蜡标本p53第七外显子基因突变的初步研究
作者：丁守怡 郭成浩 肖德钢 任晓丹 张敏
单位：丁守怡 郭成浩 张敏(山东省青岛大学医学院 青岛市 266021)；肖德钢(吉林医学院 吉林市 132001)；任晓丹(美国密歇根大学医学院)
关键词：原发性胃腺癌；p53蛋白；基因突变；PCR-SSCP
肿瘤防治杂志000204 【摘要】目的：研究PCR-SSCP技术检测原发性胃腺癌石蜡标本中p53第7外显子基因突变，探讨其与肿瘤发展的关系。方法：应用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)技术检测37例原发性胃腺癌标本中p53第7外显子的基因突变，同时应用免疫组织化学技术检测p53蛋白的表达。探讨其与肿瘤发展的关系。结果：37例原发性胃腺癌标本中，p53第7外显子基因突变率为19%(7/37)，7例发生突变的标本，其p53蛋白表达亦呈阳性，低分化腺癌突变率高于高、中分化腺癌(P=0.0006)，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组(P=0.0003)。结论：临床检测胃腺癌原发灶中是否存在p53第7外显子基因突变，有助于识别高度恶性的胃腺癌。
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中图分类号：R734.2；R730.231 文献标识码：A 文章编号：1009-4571(2000)02-0120-03
The study of p53 gene mutation in exon7 measured by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphsm(PCR-SSCP)and in primary gastric adencarcinomas
DING Shou-yi,GUO Cheng-hao,XIAO De-gang,et al.
(Department of Microbiology,Qingdao Medical College,Qingdao 266021)
【Abstract】Objective:To investigate the mutation of p53 gene in exon 7 and expression of p53 protein in primary gastric adenocarcinomas,and to study its relation with tumor′s development.Methods:The mutation of p53 gene in exon 7 in 37 cases of primary gastric adenocarcinomas were detected by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and the expression of p53 protein in 37 cases of primary gastric adenocarcinomas was analyzed by immunohistochemistry.Results:In 37 cases of primary gastric adenocarcinomas,7cases (19%) showed mutation of p53 gene in exon 7 and positive p53 expression.The mutational rate of p53 gene in exon 7 and positive p53 expression.The mutational rate of poorly differentiated adenocarcinomas was higher than that of well/moderately differentiated ones(P=0.0006).The mutational rate of those with lymph node metastasis was higer than that of those without lymph node mdtastasis(P=0.0003).Conclusions:It is useful to recognize highly malignant primary gastric adenocarcinomas by detecting the mutation of p53 gene in exon 7.
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【Key words】primary gastric adenocarcinomas；p53 proten；p53 gene mutation；PCR-SSCP
肿瘤抑制基因p53被认为是目前人类肿瘤中最常变化的肿瘤基因，其异常蛋白表达可促进细胞增殖和转化，同时抑制细胞凋亡，与多种肿瘤的形成和发展有关。肿瘤的浸润转移是恶性肿瘤最重要的特征，是肿瘤病人死亡的直接原因。它是一个复杂而有序的多阶段生物学过程，受细胞内多个基因的调控。石蜡标本的分子水平研究是一个难点。本文采用结合PCR-SSCP技术和LSAB免疫组化方法对原发性胃腺癌石蜡标本联合检测p53第7外显子基因突变及p53蛋白表达，同时对基因突变与浸润转移的相关性作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择青岛医学院附属医院病理科1996～1997年经病理诊断为原发性胃腺癌患者的手术切除标本37例及正常胃粘膜10例。其中，高分化腺癌17例，中分化腺癌10例，低分化腺癌10例；早期胃腺癌18例，进展期胃腺癌19例；发生淋巴结转移者14例，未发生淋巴结转移者23例；男21例，女16例。患者术前均未进行过化疗及放疗。
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1.2 PCR-SSCP方法
1.2.1 引物合成 两对p53基因第7外显子引物：一对外侧引物和一对内侧引物。外侧引物序列为sense 5′ CTA GGT TGG CTC TGA CTG TAC CA 3′;anti-sense 5′ GTG TGA CCT TCT GAG GTC CAG T 3′。内侧引物sense 5′ AGG TTG GCT CTG ACT GTA CC 3′;anti-sense 5′ GTG ATG ATG GTG AGG ATG G 3′由北京医科大学分子病理室合成。扩增片段长度分别为119 bp和97 bp。
1.2.2 石蜡组织中的DNA提取(酚-氯仿抽提法)
显微镜下观察HE切片后尽量去除石蜡块上的非癌组织，切10 μm厚的5～7张后放入1.5 ml离心管中；加入1.5 ml二甲苯脱蜡，室温静置2 h，10 000～12 000转/min 离心5 min，弃上清，重复2次；加入1.5 ml无水乙醇充分混匀，10 000～12 000转/min 离心5 min，弃上清，重复2次；室温下干燥半小时；加入lysis buffer 800 μl，10 mg/ml蛋白酶k 16 μl，37℃消化过液(经常震荡)，离心12 000转/min×5 min，取上清液至另一离心管中，用酚、氯仿、异戊醇法常规提取DNA。用作PCR模板。
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1.2.3 PCR扩增
(1)巢式PCR(Nested-PCR)反应体系：第1次PCR：DNA模板2 μl，上、下游外引物各0.5 μl，dNTP 3 μl，Taq DNA聚合酶1u，10×buffer 5 μl，三蒸水39 μl，总体积50 μl；第2次PCR：PCR产物模板1 μl，上、下游内引物各0.5 μl，dNTP 3 μl，Taq DNA聚合酶 1u，10×buffer 5 μl，三蒸水40 μl，总体积50 μl。
(2)PCR反应条件：95℃预变性2 min；然后95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；30个循环；最后72℃延伸2 min，每组PCR反应均设无模板DNA的阴性对照。
(3)琼脂糖凝胶电泳：反应完成后，取5 μl巢式PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于254 nm波长紫外透射仪上观察PCR产物的扩增情况，观察在97 bp位置上有无清晰之条带并照相。
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1.2.4 PCR产物的SSCP分析 取8 μl巢式PCR产物加入12 μl SSCP上样缓冲液，置100℃煮沸10 min变性后，冰浴中骤冷，立即上样。恒压50 V，恒温15℃，电泳10 h。电泳结束后，小心将胶取下，放入30%乙醇和10%乙酸组成的固定液中固定10 h。0.1%硝酸银染色30 min用三蒸水漂洗后于2.5%碳酸钠和0.02%甲醛组成的显色液中显色，至条带清晰可见时加1%乙酸中止反应。
结果判定：每次SSCP电泳都以正常胃组织扩增产物做对照，若待测样品与正常相比出现条带的增加、减少或位置移动，则说明该样品存在基因突变。每个样本至少进行2次检测，以保证存在泳动变位结果的重复性。
1.3 p53蛋白LSAB免疫组化检测技术
标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，行LSAB法染色。鼠抗人p53，bcl-2,nm23-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司，稀释度1∶50；鼠抗人LSAB试剂盒购自DAKO公司，三抗工作浓度1∶300，经微波修复抗原，具体操作按说明书进行，显色剂为DAB。每次实验均设阳性及阴性对照：以胃癌组织表达阳性的切片做阳性对照；省略一抗，以PBS代替做阴性对照。
, 百拇医药
免疫组化结果判断标准：p53阳性细胞数<10%者为(-)，10%～25%者为(+)，25%～50%者为(++)，>50%者为(+++)。
1.4 统计学分析
统计学处理分别采用χ2检验、Ridit分析(a=0.05)。
2 结果
2.1 p53蛋白免疫组化结果
在37例标本中，p53蛋白阳性者29例。
2.2 p53基因突变
p53蛋白阳性者29例，检出7例基因突变，而在p53蛋白阴性的8例中，未检出基因突变。低分化腺癌p53第7外显子因突变率高于高、中分化腺癌，二者差异具有显著性(P=0.000 6)，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组，二者差异具有显著性(P=0.000 3)，p53第7外显子基因突变与浸润深度无关(P>0.05)见表1。
, 百拇医药
3 讨论
p53基因是主要的肿瘤抑制基因，参与细胞生长的正常调控，将DNA受损的细胞阻滞在G1期，使细胞赢得时间，在进入S期前修复损伤的DNA，阻止突变的形成[1]。因此，p53基因在监视细胞基因组的完整性、修复细胞DNA的损伤方面起重要作用。若wtp53(野生型)基因发生突变，使细胞因遗传的不稳定性而产生染色体畸变，引起细胞癌变[2]。此时，p53基因转变为癌基因。p53基因突变失活是人类肿瘤发生最常见的遗传学改变。Tohdo[3]等认为p53基因突变与原发性胃腺癌的发生有关，是胃腺癌发生过程中的早期事件，其中错义突变在胃腺癌癌变过程中发挥重要作用。p53突变在肿瘤的发生、发展及预后中有重要作用，人类恶性肿瘤中90%以上的p53基因突变发生在外显子5、6、7、8这4个进化上高度保守的区域[4]。一些学者研究表明，在不同肿瘤中p53基因的改变呈多种形式，可能与不同肿瘤在致癌过程中不同的内源性和外源性致突变剂参与有关。
, 百拇医药
表1 p53基因突变与分化程度、分期、转移的关系 参数
例数
突变(+)
突变(-)
P值
分化程度
高/中分化
27
1
26
0.0006
低分化
10
, 百拇医药
6
4
分期
早期
18
3
15
1
进展期
19
4
15
淋巴结转移
有
, 百拇医药
14
7
7
0.0003
无
23
0
23
SSCP方法检测基因突变是1989年由Orita[5,6]等首先报道，现已成为最广泛应用的基因突变筛查技术。该方法原理是：在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下，单链DNA的构象决定于其碱基序列，长度相同但碱基序列不同，甚至单个碱基改变的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时因构象的差异形成迁移率不同的条带，即呈现泳动变位(mobility shift)，分析SSCP结果较为复杂。一般而言，与正常序列相比呈现泳动变位的DNA分子即提示有突变存在。用PCR-SSCP可以检出肿瘤细胞仅占10%的标本中的突变。因此，该法主要优点是具有简单性及较高的敏感性[7]。
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本研究37例原发性胃腺癌标本中，20%(7/37)的癌组织中存在p53第7外显子基因突变，7例p53突变的标本，其p53蛋白表达也呈阳性，其中低分化腺癌突变率高于高、中分化腺癌，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组。结果提示，临床检测胃腺癌原发灶中是否存在p53基因第7外显子基因突变，有助于识别高度恶性和容易发生淋巴结转移的胃腺癌。
参考文献：
[1]Waldman V,kinzler KW,Vogelstrin B.P21 is necessatry for the p53-mediated Gl arrest in human cancer cells[J].Cancer Res,1995,55:5187-5190.
[2]Fritsche M,Haessler C,Brandner G.Induction of nuclear accumulation of the tumorsuppressor protein p53 by DNA-damaging agents[J].Oncogene,1993,8:307-310.
, 百拇医药
[3]Tohdo H,Yokozaki H,Haruma K,et al.p53 gene mutations in gaetric adenomas[J].Virchows Arch B-cell Pathol Zncl Mol Pathol,1993,63(3):191-195.
[4]Levine AJ,Momand J,Finlay CA,et al.The p53 tumor suppressor gene[J].Nature(Lond),1991,351:453-456.
[5]Orita M,Suzuki Y,Sekiya T,et al.Rapid and sensitive detection of point mutation and DNA polymorphisms using the polymerase chain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,87:874-878.
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[6]Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as sing-strand conformation polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as single-strand conformation polymorphidmd[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:2766-2768.
[7]Spagnolo DV,Turbett GR,Dix B,et al.polymerase chain reation and single-strand comformation ploymorphism analysis(PCR-SSCP),a nouel means of detecting DNA mutations[J].Adv Anat Pathol,1994,1:61-65.
收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-12-18, http://www.100md.com
单位：丁守怡 郭成浩 张敏(山东省青岛大学医学院 青岛市 266021)；肖德钢(吉林医学院 吉林市 132001)；任晓丹(美国密歇根大学医学院)
关键词：原发性胃腺癌；p53蛋白；基因突变；PCR-SSCP
肿瘤防治杂志000204 【摘要】目的：研究PCR-SSCP技术检测原发性胃腺癌石蜡标本中p53第7外显子基因突变，探讨其与肿瘤发展的关系。方法：应用PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性)技术检测37例原发性胃腺癌标本中p53第7外显子的基因突变，同时应用免疫组织化学技术检测p53蛋白的表达。探讨其与肿瘤发展的关系。结果：37例原发性胃腺癌标本中，p53第7外显子基因突变率为19%(7/37)，7例发生突变的标本，其p53蛋白表达亦呈阳性，低分化腺癌突变率高于高、中分化腺癌(P=0.0006)，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组(P=0.0003)。结论：临床检测胃腺癌原发灶中是否存在p53第7外显子基因突变，有助于识别高度恶性的胃腺癌。
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中图分类号：R734.2；R730.231 文献标识码：A 文章编号：1009-4571(2000)02-0120-03
The study of p53 gene mutation in exon7 measured by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphsm(PCR-SSCP)and in primary gastric adencarcinomas
DING Shou-yi,GUO Cheng-hao,XIAO De-gang,et al.
(Department of Microbiology,Qingdao Medical College,Qingdao 266021)
【Abstract】Objective:To investigate the mutation of p53 gene in exon 7 and expression of p53 protein in primary gastric adenocarcinomas,and to study its relation with tumor′s development.Methods:The mutation of p53 gene in exon 7 in 37 cases of primary gastric adenocarcinomas were detected by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and the expression of p53 protein in 37 cases of primary gastric adenocarcinomas was analyzed by immunohistochemistry.Results:In 37 cases of primary gastric adenocarcinomas,7cases (19%) showed mutation of p53 gene in exon 7 and positive p53 expression.The mutational rate of p53 gene in exon 7 and positive p53 expression.The mutational rate of poorly differentiated adenocarcinomas was higher than that of well/moderately differentiated ones(P=0.0006).The mutational rate of those with lymph node metastasis was higer than that of those without lymph node mdtastasis(P=0.0003).Conclusions:It is useful to recognize highly malignant primary gastric adenocarcinomas by detecting the mutation of p53 gene in exon 7.
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【Key words】primary gastric adenocarcinomas；p53 proten；p53 gene mutation；PCR-SSCP
肿瘤抑制基因p53被认为是目前人类肿瘤中最常变化的肿瘤基因，其异常蛋白表达可促进细胞增殖和转化，同时抑制细胞凋亡，与多种肿瘤的形成和发展有关。肿瘤的浸润转移是恶性肿瘤最重要的特征，是肿瘤病人死亡的直接原因。它是一个复杂而有序的多阶段生物学过程，受细胞内多个基因的调控。石蜡标本的分子水平研究是一个难点。本文采用结合PCR-SSCP技术和LSAB免疫组化方法对原发性胃腺癌石蜡标本联合检测p53第7外显子基因突变及p53蛋白表达，同时对基因突变与浸润转移的相关性作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料来源
选择青岛医学院附属医院病理科1996～1997年经病理诊断为原发性胃腺癌患者的手术切除标本37例及正常胃粘膜10例。其中，高分化腺癌17例，中分化腺癌10例，低分化腺癌10例；早期胃腺癌18例，进展期胃腺癌19例；发生淋巴结转移者14例，未发生淋巴结转移者23例；男21例，女16例。患者术前均未进行过化疗及放疗。
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1.2 PCR-SSCP方法
1.2.1 引物合成 两对p53基因第7外显子引物：一对外侧引物和一对内侧引物。外侧引物序列为sense 5′ CTA GGT TGG CTC TGA CTG TAC CA 3′;anti-sense 5′ GTG TGA CCT TCT GAG GTC CAG T 3′。内侧引物sense 5′ AGG TTG GCT CTG ACT GTA CC 3′;anti-sense 5′ GTG ATG ATG GTG AGG ATG G 3′由北京医科大学分子病理室合成。扩增片段长度分别为119 bp和97 bp。
1.2.2 石蜡组织中的DNA提取(酚-氯仿抽提法)
显微镜下观察HE切片后尽量去除石蜡块上的非癌组织，切10 μm厚的5～7张后放入1.5 ml离心管中；加入1.5 ml二甲苯脱蜡，室温静置2 h，10 000～12 000转/min 离心5 min，弃上清，重复2次；加入1.5 ml无水乙醇充分混匀，10 000～12 000转/min 离心5 min，弃上清，重复2次；室温下干燥半小时；加入lysis buffer 800 μl，10 mg/ml蛋白酶k 16 μl，37℃消化过液(经常震荡)，离心12 000转/min×5 min，取上清液至另一离心管中，用酚、氯仿、异戊醇法常规提取DNA。用作PCR模板。
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1.2.3 PCR扩增
(1)巢式PCR(Nested-PCR)反应体系：第1次PCR：DNA模板2 μl，上、下游外引物各0.5 μl，dNTP 3 μl，Taq DNA聚合酶1u，10×buffer 5 μl，三蒸水39 μl，总体积50 μl；第2次PCR：PCR产物模板1 μl，上、下游内引物各0.5 μl，dNTP 3 μl，Taq DNA聚合酶 1u，10×buffer 5 μl，三蒸水40 μl，总体积50 μl。
(2)PCR反应条件：95℃预变性2 min；然后95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；30个循环；最后72℃延伸2 min，每组PCR反应均设无模板DNA的阴性对照。
(3)琼脂糖凝胶电泳：反应完成后，取5 μl巢式PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于254 nm波长紫外透射仪上观察PCR产物的扩增情况，观察在97 bp位置上有无清晰之条带并照相。
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1.2.4 PCR产物的SSCP分析 取8 μl巢式PCR产物加入12 μl SSCP上样缓冲液，置100℃煮沸10 min变性后，冰浴中骤冷，立即上样。恒压50 V，恒温15℃，电泳10 h。电泳结束后，小心将胶取下，放入30%乙醇和10%乙酸组成的固定液中固定10 h。0.1%硝酸银染色30 min用三蒸水漂洗后于2.5%碳酸钠和0.02%甲醛组成的显色液中显色，至条带清晰可见时加1%乙酸中止反应。
结果判定：每次SSCP电泳都以正常胃组织扩增产物做对照，若待测样品与正常相比出现条带的增加、减少或位置移动，则说明该样品存在基因突变。每个样本至少进行2次检测，以保证存在泳动变位结果的重复性。
1.3 p53蛋白LSAB免疫组化检测技术
标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，行LSAB法染色。鼠抗人p53，bcl-2,nm23-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司，稀释度1∶50；鼠抗人LSAB试剂盒购自DAKO公司，三抗工作浓度1∶300，经微波修复抗原，具体操作按说明书进行，显色剂为DAB。每次实验均设阳性及阴性对照：以胃癌组织表达阳性的切片做阳性对照；省略一抗，以PBS代替做阴性对照。
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免疫组化结果判断标准：p53阳性细胞数<10%者为(-)，10%～25%者为(+)，25%～50%者为(++)，>50%者为(+++)。
1.4 统计学分析
统计学处理分别采用χ2检验、Ridit分析(a=0.05)。
2 结果
2.1 p53蛋白免疫组化结果
在37例标本中，p53蛋白阳性者29例。
2.2 p53基因突变
p53蛋白阳性者29例，检出7例基因突变，而在p53蛋白阴性的8例中，未检出基因突变。低分化腺癌p53第7外显子因突变率高于高、中分化腺癌，二者差异具有显著性(P=0.000 6)，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组，二者差异具有显著性(P=0.000 3)，p53第7外显子基因突变与浸润深度无关(P>0.05)见表1。
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3 讨论
p53基因是主要的肿瘤抑制基因，参与细胞生长的正常调控，将DNA受损的细胞阻滞在G1期，使细胞赢得时间，在进入S期前修复损伤的DNA，阻止突变的形成[1]。因此，p53基因在监视细胞基因组的完整性、修复细胞DNA的损伤方面起重要作用。若wtp53(野生型)基因发生突变，使细胞因遗传的不稳定性而产生染色体畸变，引起细胞癌变[2]。此时，p53基因转变为癌基因。p53基因突变失活是人类肿瘤发生最常见的遗传学改变。Tohdo[3]等认为p53基因突变与原发性胃腺癌的发生有关，是胃腺癌发生过程中的早期事件，其中错义突变在胃腺癌癌变过程中发挥重要作用。p53突变在肿瘤的发生、发展及预后中有重要作用，人类恶性肿瘤中90%以上的p53基因突变发生在外显子5、6、7、8这4个进化上高度保守的区域[4]。一些学者研究表明，在不同肿瘤中p53基因的改变呈多种形式，可能与不同肿瘤在致癌过程中不同的内源性和外源性致突变剂参与有关。
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表1 p53基因突变与分化程度、分期、转移的关系 参数
例数
突变(+)
突变(-)
P值
分化程度
高/中分化
27
1
26
0.0006
低分化
10
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6
4
分期
早期
18
3
15
1
进展期
19
4
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淋巴结转移
有
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14
7
7
0.0003
无
23
0
23
SSCP方法检测基因突变是1989年由Orita[5,6]等首先报道，现已成为最广泛应用的基因突变筛查技术。该方法原理是：在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下，单链DNA的构象决定于其碱基序列，长度相同但碱基序列不同，甚至单个碱基改变的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时因构象的差异形成迁移率不同的条带，即呈现泳动变位(mobility shift)，分析SSCP结果较为复杂。一般而言，与正常序列相比呈现泳动变位的DNA分子即提示有突变存在。用PCR-SSCP可以检出肿瘤细胞仅占10%的标本中的突变。因此，该法主要优点是具有简单性及较高的敏感性[7]。
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本研究37例原发性胃腺癌标本中，20%(7/37)的癌组织中存在p53第7外显子基因突变，7例p53突变的标本，其p53蛋白表达也呈阳性，其中低分化腺癌突变率高于高、中分化腺癌，发生淋巴结转移组突变率高于未发生淋巴结转移组。结果提示，临床检测胃腺癌原发灶中是否存在p53基因第7外显子基因突变，有助于识别高度恶性和容易发生淋巴结转移的胃腺癌。
参考文献：
[1]Waldman V,kinzler KW,Vogelstrin B.P21 is necessatry for the p53-mediated Gl arrest in human cancer cells[J].Cancer Res,1995,55:5187-5190.
[2]Fritsche M,Haessler C,Brandner G.Induction of nuclear accumulation of the tumorsuppressor protein p53 by DNA-damaging agents[J].Oncogene,1993,8:307-310.
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[3]Tohdo H,Yokozaki H,Haruma K,et al.p53 gene mutations in gaetric adenomas[J].Virchows Arch B-cell Pathol Zncl Mol Pathol,1993,63(3):191-195.
[4]Levine AJ,Momand J,Finlay CA,et al.The p53 tumor suppressor gene[J].Nature(Lond),1991,351:453-456.
[5]Orita M,Suzuki Y,Sekiya T,et al.Rapid and sensitive detection of point mutation and DNA polymorphisms using the polymerase chain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,87:874-878.
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[6]Orita M,Iwahana H,Kanazawa H,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as sing-strand conformation polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as single-strand conformation polymorphidmd[J].Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:2766-2768.
[7]Spagnolo DV,Turbett GR,Dix B,et al.polymerase chain reation and single-strand comformation ploymorphism analysis(PCR-SSCP),a nouel means of detecting DNA mutations[J].Adv Anat Pathol,1994,1:61-65.
收稿日期：1999-09-17
修回日期：1999-12-18, http://www.100md.com