大鼠生后不同发育阶段下丘脑细胞凋亡的研究
http://www.100md.com
山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：李盛芳 武玉玲 郝晶 邴鲁军 张宝华 朱传菊
单位：山东医科大学组织学与胚胎学教研室
关键词：下丘脑；细胞凋亡；TdT原位末端标记；Wistar大鼠
山东医科大学学报000206
摘 要：目的：探讨大鼠生后下丘脑不同发育阶段细胞凋亡的规律及禁水对细胞凋亡的影响。方法：取生后发育不同阶段的大鼠下丘脑，①用Bouin液固定，用TUNEL染色；②用改良的Bouin液固定，核固红结晶紫染色。结果：①生后1d凋亡细胞最多，主要位于下丘脑背侧室旁核附近。生后5d，凋亡细胞明显减少。以后凋亡细胞越来越少。60d极少见到凋亡细胞。两种染色方法结果相似；②成年大鼠禁水后，未见凋亡细胞增多。结论：①细胞凋亡受基因和细胞外环境因素的共同调节；②禁水对大鼠下丘脑细胞凋亡无影响。
, http://www.100md.com
分类号：R338.2+7；Q255 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0128-03
STUDY ON APOPTOSIS OF THE WISTAR RAT HYPOTHALAMUS DURING THE DEVELOPMENT OF POSTNATAL LIFE
LI Sheng-fang,WU Yu-ling,HAO Jing
(Dept. of Histology and Embryology, Shandong Medical University)
Abstract：Objective: To study the rules of cell apoptosis in rat hypothalamus during the development of postnatal life and observe the effect of dehydration on cell apoptosis in adult rat hypothlalamus. Method:Wistar rat hypothalamus was rasected at different stages during the postnatal life and ① fixed by Bouin's fixative and stained with terminal deoxy-UTP nick end labelling technique(TUNEL)and ② fixed with modifide Bouin's solution and stained with nuclear fast red-crystal violet. Results:①The rules of apoptosis: a peak density of apoptotic cells appeared on the first day (1d) after birth chiefly in the dorsal area of the paraventricular nucleus. On 5d the apoptotic cells reduced greatly,then became fewer and fewer, and almost disappeared on 60d. Similar results were produced by staining in two ways. ②In adult rats deprived of water at different times,the number of apoptotic cells in hypothalamus was similar to that in controlled groups. Conclusion: ①The apoptotic cells were controlled by genes together with pericellular environmental factors. ②Dehydration had no effect on apoptosis.
, 百拇医药
Keywords：Apoptosis;Hypothalamus;TUNEL;Wistar rats 1992年Carieli等建立了末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeox-UTPnickendlabelling，TUNEL)检测细胞凋亡，该法敏感且特异性强。本实验用TUNEL技术对不同年龄大鼠的下丘脑进行检测，旨在研究其凋亡规律，并观察禁水对细胞凋亡的影响。
1材料与方法
1.1材料250～350g的成年雌雄Wistar大鼠75只，由本校动物实验中心提供。细胞凋亡检测试剂盒为美国Vector公司产品。NBT/BCIP购自北京中山生物技术有限公司。
核固虹、结晶紫由美国Hartman-Ledoon公司提供。
1.2方法
, 百拇医药 1.2.1标本制备Wista大鼠雌雄1：1合笼，次晨阴道查见精子为受精。出生当天定为零天(0d)，于生后1、5、10、20、30和60d各取10只鼠的下丘脑，每10只中5只用Bouin液固定，另5只固定于由饱和苦味酸85ml、甲醛lOml、冰醋酸5ml、铬酸1.0g和尿素1.0g配成的固定液(改良的Bouin液)中24h(4℃)；另取鼠15只，分为禁水组和对照组，颗粒饲料喂养。对照组(3只)正常供水。禁水组分别在禁水1、4、7、1Od各取3只鼠的下丘脑，固定方法同上。以上固定标本经70%的酒精脱色，递度酒精脱水，石蜡包埋切片，片厚6μm。在视交叉和正中隆起之间，每10片选1片染色。
1.2.2TUNEL染色每只大鼠选切片5张，二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，每张切片滴加浓度为20mg/L的蛋白酶K50μl于湿盒中，37℃15min；0.01PBS洗5min×3；90%的酒精脱水，风干，滴加地高辛标记的dUTP(APOPA)8μl，末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT，APOPB)1μl37℃2b；PBS洗5min×3；马血清封闭(1：100)37℃×20min；碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(Anti-Dig1：500)37℃1h；TSM1、TSM2各洗5min×2；NBT/BCIP(1：10TSM2配制)；室温避光显色10～20min，核固红复染。水洗，风干，中性树胶封片。阴性对照不加APOPB，用0.01PBS取代。
, 百拇医药
1.2.3核固红-结晶紫染色取改良Bouin液固定的切片，二甲苯脱蜡，系列酒精入水，1molHCl60℃12min；双蒸水洗；1%核固红/5%硫酸铝液10min；自来水洗5min；1%结晶紫30min；自来水洗；95%乙醇分色(加2滴饱和苦味酸/50ml)直到颜色不再脱落，脱水透明，树胶封固。用此种方法染色，静止期的细胞核染成红色，分裂期及凋亡的细胞核呈蓝色。
1.2.4统计学处理每张切片在下丘脑的腹侧及背侧第3脑室左右各取2个视野，用Olympus双目显微镜高倍镜下测凋亡细胞数，用计算机SAS统计软件处理系统测其均数，求
凋亡指数(凋亡细胞数/mm2)。用t检验进行组间分析。
2结果
2.1TUNEL染色结果观察生后1d下丘脑凋亡细胞多，凋亡小体呈大小不等的圆球形，周围蓝色，中央淡染，有的与胞核相连，有的已分散碎解。下丘脑背侧室旁核附近凋亡细胞明显增多(图1)。与腹侧相比差异显著(P<0.001)，见表1。5d凋亡细胞明显减少(图2)，与生后1d比较差异显著。生后10、20、30d凋亡细胞越来越少(图3)，凋亡细胞核多呈半月形或固缩成圆球形。60d凋亡细胞极少，多数视野见不到凋亡细胞。对照切片未见TUNEL阳性细胞。
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图1生后1dWistar大鼠下丘脑TUNEL阳性细胞(深染细胞)(×800)
Fig.1ThedarkstainingstructuresshowingtheTUNELposativecellsatday1ofpostanatllifeinWistarrathypothalamus(×800)
图2箭头示生后5d大鼠下丘脑TUNEL阳性细胞(×800)
Fig.2ArrowshowingtheTUNELposativecellsatday5ofpostnatallifeinrathypothalamus(×800)
表1大鼠生后不同发育阶段下丘脑细胞凋亡的TUNEL检测结果(±s)
图3生后20d下丘脑凋亡细胞明显减少，箭头示凋亡细胞(×800)
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Fig.3Thephotographshowingthatapcptoticcellsbypothalamusreducedgreatlyattheday20ofpostnatallife(×800)
图4箭头示生后1d大鼠下丘脑用核固红-结晶紫染色的凋亡细胞(×800)
Fig.4Arrowshowingtheapoptoticcellsstainedbynuclearfastred-crystalvioletinWistarrathypothalamusatthe1dofpostnatallife(×800)
2.2核固红-结晶紫染色结果观察用此法所见凋亡细胞数与TUNEL法所见相似(图4)。
2.3禁水组下丘脑凋亡细胞观察成年雄鼠分别禁水1、4、7和10d后，取下丘脑切片，分别用TUNEL和核固红-结晶紫两种方法染色，用Olympus双目显微镜及图像分析仪观察，几乎见不到凋亡细胞。禁水1d和4d的切片，见到较多变性的神经元，胞质嗜酸性，核模糊不清。组织中见到空腔。禁水7d和10d组，典型神经元明显减少，见到许多体积小而异染色质多的细胞核。
, 百拇医药
对照组下丘脑切片，几乎见不到凋亡细胞。
3讨论
3.1下丘脑的细胞凋亡观察结果表明，大鼠生后1天，凋亡细胞最多，多见凋亡小体，这与ParkJJ对雪貂研究中报道的一致[1]。生后5天凋亡细胞明显减少，以后凋亡细胞越来越减少，60天几乎见不到凋亡细胞，均与1人的结果存在显著差异(P<0.001)。结果提示，脊椎动物中枢神经系统发育中的细胞凋亡是有规律的，此规律是由基因和细胞外环境因素共同调控来完成。生后1天，下丘脑室旁核等核团刚刚形成[2]，神经元之间的突触联系尚未完全建立，由于环境的改变，使抑癌基因如p53发出抗细胞增殖的信号[3]，拮抗了癌基因产生的生长刺激信号，导致不可逆的生长停止，即细胞凋亡。5天后，由于环境的稳定，癌基因和生长因子等的共同作用，使凋亡细胞迅速减少，至60天停止。表明下丘脑发育完全成熟。
TdT介导的原位末端标记方法检测细胞凋亡敏感而且特异性强[4]，但价格昂贵。改良的Bouin液固定的标本，经核固红-结晶紫染色，分裂间期的细胞核染成红色，分裂期的染色体和凋亡细胞核染为蓝色[5]。镜下对比明显，一目了然，而且价格便宜，适宜于大标本量的研究，便于对细胞凋亡或细胞分裂进行定量分析。我们用该方法对下丘脑各发育阶段的细胞凋亡进行分析，其结果与用TUNEL技术的结果相似。
, 百拇医药
3.2禁水对细胞凋亡的影响对成年大鼠不同时间禁水，用TUNEL技术和核固红-结晶紫染色，下丘脑凋亡细胞数与对照组极为相似。说明禁水对下丘脑细胞凋亡没有影响。
基金项目：山东省科委资助课题(No 9756)
参考文献： [1]Par.JJ, et al. Cell death in the sexually dimorphic dorsal preoptic areal/anterior hypothalamus of perinatal male and remal ferret[J].J Neurobiol,1998,34:3242
[2]李盛芳，郝晶，宋卫华，等.大鼠下丘脑VP神经元及相关核团的生后发育及免疫细胞化学研究[J].山东医科大学学报，1998，37(2)：103
[3]Sanders EJ. Programmed cell death in development[J]. Int Revcyto,1995,163:105
, 百拇医药
[4]Garili Y, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fregmentation[J].J Cell Biol,1992, (3):493
[5]马金龙，高英茂，刘凯，等高温致金黄地鼠神经管畸形中细胞凋亡的组织学观察[J].解剖学报，1998，29(3)：299
[6]Purlmuter LS, et al. Neuronal/glial plasticity in the supro ptic dendrit in respons to acute and chronic dehydration[J]. Brain Res,1985,361:225
收稿日期：1999-04-18, 百拇医药
单位：山东医科大学组织学与胚胎学教研室
关键词：下丘脑；细胞凋亡；TdT原位末端标记；Wistar大鼠
山东医科大学学报000206
摘 要：目的：探讨大鼠生后下丘脑不同发育阶段细胞凋亡的规律及禁水对细胞凋亡的影响。方法：取生后发育不同阶段的大鼠下丘脑，①用Bouin液固定，用TUNEL染色；②用改良的Bouin液固定，核固红结晶紫染色。结果：①生后1d凋亡细胞最多，主要位于下丘脑背侧室旁核附近。生后5d，凋亡细胞明显减少。以后凋亡细胞越来越少。60d极少见到凋亡细胞。两种染色方法结果相似；②成年大鼠禁水后，未见凋亡细胞增多。结论：①细胞凋亡受基因和细胞外环境因素的共同调节；②禁水对大鼠下丘脑细胞凋亡无影响。
, http://www.100md.com
分类号：R338.2+7；Q255 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0128-03
STUDY ON APOPTOSIS OF THE WISTAR RAT HYPOTHALAMUS DURING THE DEVELOPMENT OF POSTNATAL LIFE
LI Sheng-fang,WU Yu-ling,HAO Jing
(Dept. of Histology and Embryology, Shandong Medical University)
Abstract：Objective: To study the rules of cell apoptosis in rat hypothalamus during the development of postnatal life and observe the effect of dehydration on cell apoptosis in adult rat hypothlalamus. Method:Wistar rat hypothalamus was rasected at different stages during the postnatal life and ① fixed by Bouin's fixative and stained with terminal deoxy-UTP nick end labelling technique(TUNEL)and ② fixed with modifide Bouin's solution and stained with nuclear fast red-crystal violet. Results:①The rules of apoptosis: a peak density of apoptotic cells appeared on the first day (1d) after birth chiefly in the dorsal area of the paraventricular nucleus. On 5d the apoptotic cells reduced greatly,then became fewer and fewer, and almost disappeared on 60d. Similar results were produced by staining in two ways. ②In adult rats deprived of water at different times,the number of apoptotic cells in hypothalamus was similar to that in controlled groups. Conclusion: ①The apoptotic cells were controlled by genes together with pericellular environmental factors. ②Dehydration had no effect on apoptosis.
, 百拇医药
Keywords：Apoptosis;Hypothalamus;TUNEL;Wistar rats 1992年Carieli等建立了末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeox-UTPnickendlabelling，TUNEL)检测细胞凋亡，该法敏感且特异性强。本实验用TUNEL技术对不同年龄大鼠的下丘脑进行检测，旨在研究其凋亡规律，并观察禁水对细胞凋亡的影响。
1材料与方法
1.1材料250～350g的成年雌雄Wistar大鼠75只，由本校动物实验中心提供。细胞凋亡检测试剂盒为美国Vector公司产品。NBT/BCIP购自北京中山生物技术有限公司。
核固虹、结晶紫由美国Hartman-Ledoon公司提供。
1.2方法
, 百拇医药 1.2.1标本制备Wista大鼠雌雄1：1合笼，次晨阴道查见精子为受精。出生当天定为零天(0d)，于生后1、5、10、20、30和60d各取10只鼠的下丘脑，每10只中5只用Bouin液固定，另5只固定于由饱和苦味酸85ml、甲醛lOml、冰醋酸5ml、铬酸1.0g和尿素1.0g配成的固定液(改良的Bouin液)中24h(4℃)；另取鼠15只，分为禁水组和对照组，颗粒饲料喂养。对照组(3只)正常供水。禁水组分别在禁水1、4、7、1Od各取3只鼠的下丘脑，固定方法同上。以上固定标本经70%的酒精脱色，递度酒精脱水，石蜡包埋切片，片厚6μm。在视交叉和正中隆起之间，每10片选1片染色。
1.2.2TUNEL染色每只大鼠选切片5张，二甲苯脱蜡，梯度酒精入水，每张切片滴加浓度为20mg/L的蛋白酶K50μl于湿盒中，37℃15min；0.01PBS洗5min×3；90%的酒精脱水，风干，滴加地高辛标记的dUTP(APOPA)8μl，末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT，APOPB)1μl37℃2b；PBS洗5min×3；马血清封闭(1：100)37℃×20min；碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(Anti-Dig1：500)37℃1h；TSM1、TSM2各洗5min×2；NBT/BCIP(1：10TSM2配制)；室温避光显色10～20min，核固红复染。水洗，风干，中性树胶封片。阴性对照不加APOPB，用0.01PBS取代。
, 百拇医药
1.2.3核固红-结晶紫染色取改良Bouin液固定的切片，二甲苯脱蜡，系列酒精入水，1molHCl60℃12min；双蒸水洗；1%核固红/5%硫酸铝液10min；自来水洗5min；1%结晶紫30min；自来水洗；95%乙醇分色(加2滴饱和苦味酸/50ml)直到颜色不再脱落，脱水透明，树胶封固。用此种方法染色，静止期的细胞核染成红色，分裂期及凋亡的细胞核呈蓝色。
1.2.4统计学处理每张切片在下丘脑的腹侧及背侧第3脑室左右各取2个视野，用Olympus双目显微镜高倍镜下测凋亡细胞数，用计算机SAS统计软件处理系统测其均数，求
凋亡指数(凋亡细胞数/mm2)。用t检验进行组间分析。
2结果
2.1TUNEL染色结果观察生后1d下丘脑凋亡细胞多，凋亡小体呈大小不等的圆球形，周围蓝色，中央淡染，有的与胞核相连，有的已分散碎解。下丘脑背侧室旁核附近凋亡细胞明显增多(图1)。与腹侧相比差异显著(P<0.001)，见表1。5d凋亡细胞明显减少(图2)，与生后1d比较差异显著。生后10、20、30d凋亡细胞越来越少(图3)，凋亡细胞核多呈半月形或固缩成圆球形。60d凋亡细胞极少，多数视野见不到凋亡细胞。对照切片未见TUNEL阳性细胞。
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图1生后1dWistar大鼠下丘脑TUNEL阳性细胞(深染细胞)(×800)
Fig.1ThedarkstainingstructuresshowingtheTUNELposativecellsatday1ofpostanatllifeinWistarrathypothalamus(×800)
图2箭头示生后5d大鼠下丘脑TUNEL阳性细胞(×800)
Fig.2ArrowshowingtheTUNELposativecellsatday5ofpostnatallifeinrathypothalamus(×800)
表1大鼠生后不同发育阶段下丘脑细胞凋亡的TUNEL检测结果(±s)
图3生后20d下丘脑凋亡细胞明显减少，箭头示凋亡细胞(×800)
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Fig.3Thephotographshowingthatapcptoticcellsbypothalamusreducedgreatlyattheday20ofpostnatallife(×800)
图4箭头示生后1d大鼠下丘脑用核固红-结晶紫染色的凋亡细胞(×800)
Fig.4Arrowshowingtheapoptoticcellsstainedbynuclearfastred-crystalvioletinWistarrathypothalamusatthe1dofpostnatallife(×800)
2.2核固红-结晶紫染色结果观察用此法所见凋亡细胞数与TUNEL法所见相似(图4)。
2.3禁水组下丘脑凋亡细胞观察成年雄鼠分别禁水1、4、7和10d后，取下丘脑切片，分别用TUNEL和核固红-结晶紫两种方法染色，用Olympus双目显微镜及图像分析仪观察，几乎见不到凋亡细胞。禁水1d和4d的切片，见到较多变性的神经元，胞质嗜酸性，核模糊不清。组织中见到空腔。禁水7d和10d组，典型神经元明显减少，见到许多体积小而异染色质多的细胞核。
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对照组下丘脑切片，几乎见不到凋亡细胞。
3讨论
3.1下丘脑的细胞凋亡观察结果表明，大鼠生后1天，凋亡细胞最多，多见凋亡小体，这与ParkJJ对雪貂研究中报道的一致[1]。生后5天凋亡细胞明显减少，以后凋亡细胞越来越减少，60天几乎见不到凋亡细胞，均与1人的结果存在显著差异(P<0.001)。结果提示，脊椎动物中枢神经系统发育中的细胞凋亡是有规律的，此规律是由基因和细胞外环境因素共同调控来完成。生后1天，下丘脑室旁核等核团刚刚形成[2]，神经元之间的突触联系尚未完全建立，由于环境的改变，使抑癌基因如p53发出抗细胞增殖的信号[3]，拮抗了癌基因产生的生长刺激信号，导致不可逆的生长停止，即细胞凋亡。5天后，由于环境的稳定，癌基因和生长因子等的共同作用，使凋亡细胞迅速减少，至60天停止。表明下丘脑发育完全成熟。
TdT介导的原位末端标记方法检测细胞凋亡敏感而且特异性强[4]，但价格昂贵。改良的Bouin液固定的标本，经核固红-结晶紫染色，分裂间期的细胞核染成红色，分裂期的染色体和凋亡细胞核染为蓝色[5]。镜下对比明显，一目了然，而且价格便宜，适宜于大标本量的研究，便于对细胞凋亡或细胞分裂进行定量分析。我们用该方法对下丘脑各发育阶段的细胞凋亡进行分析，其结果与用TUNEL技术的结果相似。
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3.2禁水对细胞凋亡的影响对成年大鼠不同时间禁水，用TUNEL技术和核固红-结晶紫染色，下丘脑凋亡细胞数与对照组极为相似。说明禁水对下丘脑细胞凋亡没有影响。
基金项目：山东省科委资助课题(No 9756)
参考文献： [1]Par.JJ, et al. Cell death in the sexually dimorphic dorsal preoptic areal/anterior hypothalamus of perinatal male and remal ferret[J].J Neurobiol,1998,34:3242
[2]李盛芳，郝晶，宋卫华，等.大鼠下丘脑VP神经元及相关核团的生后发育及免疫细胞化学研究[J].山东医科大学学报，1998，37(2)：103
[3]Sanders EJ. Programmed cell death in development[J]. Int Revcyto,1995,163:105
, 百拇医药
[4]Garili Y, et al. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fregmentation[J].J Cell Biol,1992, (3):493
[5]马金龙，高英茂，刘凯，等高温致金黄地鼠神经管畸形中细胞凋亡的组织学观察[J].解剖学报，1998，29(3)：299
[6]Purlmuter LS, et al. Neuronal/glial plasticity in the supro ptic dendrit in respons to acute and chronic dehydration[J]. Brain Res,1985,361:225
收稿日期：1999-04-18, 百拇医药