枸枣汁急性毒性和致突变性实验研究
作者：曾令福 张茂玉 吴紫华 张清碧
单位：张清碧(泸州医学院卫生学教研室)；曾令福 张茂玉 吴紫华(华西医科大学公共卫生学院，成都 610041)
关键词：
卫生毒理学杂志000217 枸枣汁为木通科植物猫儿屎(Decaisnea fargessii Franch)的果实所榨取的原汁，具有清热解毒作用[1，2]，并富含维生素B1、B2、C和铁等营养素，可作饮料和保健食品。根据《食品安全性毒理学评价程序》的要求[3]，采用小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠微核试验、小鼠精子畸变试验对其急性毒性和致突变性进行测试，为进行食品安全性评价提供毒理学依据，以便开发利用该植物资源。
1 材料与方法
1.1 样品 枸枣汁(原汁)，由彭州市山珍食品开发公司提供。
, http://www.100md.com
1.2 试验菌种 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由四川省食品卫生监督检验所提供。经分离、纯化鉴定其符合要求后进行试验。
1.3 试验动物 ICR小白鼠，由四川省医学科学院实验动物中心提供。
1.4 急性毒性试验 按《食品安全性毒理学评价程序和方法》中的Horn法进行试验和判断[3]。选体重18～24 g的ICR小鼠分为4组，每组20只，雌雄各半。分别将枸枣汁按2.15、4.16、10.00、21.50 g/kg体重剂量给动物灌胃染毒1次，观察14 d。
1.5 Ames试验 按Maron Ames1983年推荐的标准平皿掺入法和预培养平皿掺入法进行试验[4]。试验样品各设4个剂量组，并设阴性对照组(蒸镏水)和阳性对照组(四硝基喹啉氮氧化物NQNO、2-氨基芴2-AF)。每个剂量设3个平行平皿，重复试验2次。
, 百拇医药
1.6 小鼠微核试验[3、5] 选体重25～28 g的ICR小白鼠，分为3个枸枣汁试验组及阴性对照组、阳性对照组。每组10只动物，雌雄各半。分别将枸枣汁样品按2.0、5.0、10.0 g/kg体重剂量对试验动物灌胃，24 h后重复1次，6 h后处死动物，取胸骨骨髓制片，Gemesa染色，镜检。阴性对照组用蒸馏水灌胃，阳性对照腹腔注射环磷酰胺。
1.7 小鼠精子致畸试验[3，6] 选体重20～25g的ICR雄性小白鼠，分为阴性对照组、阳性对照组、3个枸枣汁试验组。将枸枣汁分别按2.0、5.0、10.0 g/kg体重对试验动物连续灌胃5 d，每天1次，4周后处死动物，取双侧附睾制备精子悬液，制片，用质量浓度为2%的伊红染色，镜检。阴性对照以蒸馏水灌胃，阳性对照以甲基磺酸乙酯灌胃。
2 结果与讨论
2.1 急性毒性试验：灌胃染毒后、观察14 d未见动物有任何明显不良反应及死亡，表明枸枣汁的小鼠经口LD50>21.5 g/kg，属实际无毒类物质。
, 百拇医药
2.2 Ames试验结果 见表1。
表1 枸枣汁Ames试验结果(
±s) 组别
剂量
(mg/皿)
S-9
每皿回变菌落数
TA97
TA98
TA100
TA102
枸枣汁
, 百拇医药
1190
-
67.2
±
29.4
18.3
±
6.2
80.0
±
25.3
210.0±40.0
119
, http://www.100md.com
-
127.5
±
12.5
29.8
±
2.3
146.1
±
16.4
326.5±28.1
11.90
-
, http://www.100md.com
139.2
±
17.2
30.6
±
5.3
126.0
±
10.8
310.6±36.2
1.19
-
144.5
, 百拇医药
±
12.3
32.8
±
6.4
130.8
±
8.6
295.8±72.3
NQNO
0.5 μg/皿
-
909.6
, http://www.100md.com
±
48.9
362
±
34
1042
±
58
943.5±92.1
阴性对照
-
127.8
±
, http://www.100md.com
20.1
30.8
±
3.1
118.8
±
7.6
260.0±12.2
枸枣汁
1190
+
95.0
±
, 百拇医药
14.9
33.8
±
7.0
109.7
±
29.9
227.5±23.0
119
+
138.7
±
34.3
, 百拇医药
52.4
±
6.9
131.5
±
7.6
318.6±47.3
11.90
+
139.8
±
9.3
31.5
, 百拇医药
±
4.9
112.3
±
10.3
297.2±27.8
1.19
+
129.0
±
17.5
44.3
±
, http://www.100md.com
14.3
118.8
±
15.8
302.4±51.8
2-AF
50 μg/皿
+
1145
±
205
424
±
, 百拇医药
57
802
±
76
509.0±37.4
阴性对照
+
148.3
±
12.3
31.8
±
4.8
, 百拇医药
110.8
±
11.7
284.8±45.9
表1中，无论加或不加S-9混合液，阳性对照回变菌落数为阴性对照2倍以上，呈明显阳性反应。枸枣汁各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照2倍，呈阴性反应。
2.3 小鼠微核试验和精子畸形试验见表2和表3。
表2 枸枣汁微核试验结果 组别
剂量
(g/kg体重)
动物数
, 百拇医药
(只)
PCE数
(个/只)
微核数
(±s)
微核率
(‰)
枸枣汁
2.0
10
1 000
1.5±0.54*
, http://www.100md.com
1.5
5.0
10
1 000
2.0±0.66*
2.0
10.0
10
1 000
1.7±0.64*
1.7
环磷酰胺
, 百拇医药
40 mg/kg
10
1 000
29.2±8.0**
29.2
阴性对照
10
1 000
2.1±0.62
2.1
与阴性对照比较，*P>0.05，**P<0.001表3 枸枣汁小鼠精子畸形试验结果 组别
, http://www.100md.com
剂量
(g/kg)体重
动物数
(只)
精子数
(个/只)
畸形精子数
(±s)
畸形率
(‰)
枸枣汁
2.0
, 百拇医药
5
1 000
2.22±0.4*
2.22
5.0
5
1 000
2.94±0.5*
2.94
10.0
5
1 000
, 百拇医药
2.64±1.0*
2.64
甲基磺
60 mg/kg
5
1 000
7.18±0.9**
7.18
酸乙酯
阴性对照
5
1 000
, 百拇医药
2.12±0.1
2.12
与阴性对照比较，*P>0.05，**P<0.001
表2中，枸枣汁各剂量组小鼠微核率与阴性对照组差异无显著性(P>0.05)，呈阴性反应，阳性组(环磷酰胺40 mg/kg体重)微核率显著高于阴性对照(P<0.001)，呈阳性反应。
表3中，枸枣汁各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组比数，差异无显著性(P>0.05)，阳性组(甲基磺酸乙酯60 mg/kg体重)精子畸形率显著高于阴性对照(P<0.001)，呈阳性反应。
以上体内外试验结果显示：枸枣汁的小鼠经口LD50>21.5 g/kg，属实际无毒类物质；在本试验系统的3个致突变试验中均呈阴性反应，未显示致突变作用。表明枸枣汁为基本无毒性和无致突变活性物质，但还需要进一步的毒理学实验证实其对人的安全性。
, 百拇医药
参考文献
[1] 谢万宗，编.全国中草药汇编.下册.北京：人民卫生出版社，1977.571-572.
[2] 浙江新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1977.2205-2206.
[3] 卫生部.中华人民共和国国家标准《食品安全性毒理学评价程序和方法》.北京：中国标准出版社，1995.1-5，12-26，35-36，40-41.
[4] Maron Dm,Ames BN,Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.Mutation Res，1983，113：173-215.
[5] 黄幸纾.陈星若，主编.环境化学物致突变致畸致癌试验方法.杭州：浙江科学技术出版社，1985.218-230.
[6] 张立实，王瑞淑，徐维光.小鼠精子致畸试验在食品毒理学评价中的应用.食品卫生学进展，1988，5.117-121.
(收稿日期：1999-01-14), 百拇医药
单位：张清碧(泸州医学院卫生学教研室)；曾令福 张茂玉 吴紫华(华西医科大学公共卫生学院，成都 610041)
关键词：
卫生毒理学杂志000217 枸枣汁为木通科植物猫儿屎(Decaisnea fargessii Franch)的果实所榨取的原汁，具有清热解毒作用[1，2]，并富含维生素B1、B2、C和铁等营养素，可作饮料和保健食品。根据《食品安全性毒理学评价程序》的要求[3]，采用小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠微核试验、小鼠精子畸变试验对其急性毒性和致突变性进行测试，为进行食品安全性评价提供毒理学依据，以便开发利用该植物资源。
1 材料与方法
1.1 样品 枸枣汁(原汁)，由彭州市山珍食品开发公司提供。
, http://www.100md.com
1.2 试验菌种 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由四川省食品卫生监督检验所提供。经分离、纯化鉴定其符合要求后进行试验。
1.3 试验动物 ICR小白鼠，由四川省医学科学院实验动物中心提供。
1.4 急性毒性试验 按《食品安全性毒理学评价程序和方法》中的Horn法进行试验和判断[3]。选体重18～24 g的ICR小鼠分为4组，每组20只，雌雄各半。分别将枸枣汁按2.15、4.16、10.00、21.50 g/kg体重剂量给动物灌胃染毒1次，观察14 d。
1.5 Ames试验 按Maron Ames1983年推荐的标准平皿掺入法和预培养平皿掺入法进行试验[4]。试验样品各设4个剂量组，并设阴性对照组(蒸镏水)和阳性对照组(四硝基喹啉氮氧化物NQNO、2-氨基芴2-AF)。每个剂量设3个平行平皿，重复试验2次。
, 百拇医药
1.6 小鼠微核试验[3、5] 选体重25～28 g的ICR小白鼠，分为3个枸枣汁试验组及阴性对照组、阳性对照组。每组10只动物，雌雄各半。分别将枸枣汁样品按2.0、5.0、10.0 g/kg体重剂量对试验动物灌胃，24 h后重复1次，6 h后处死动物，取胸骨骨髓制片，Gemesa染色，镜检。阴性对照组用蒸馏水灌胃，阳性对照腹腔注射环磷酰胺。
1.7 小鼠精子致畸试验[3，6] 选体重20～25g的ICR雄性小白鼠，分为阴性对照组、阳性对照组、3个枸枣汁试验组。将枸枣汁分别按2.0、5.0、10.0 g/kg体重对试验动物连续灌胃5 d，每天1次，4周后处死动物，取双侧附睾制备精子悬液，制片，用质量浓度为2%的伊红染色，镜检。阴性对照以蒸馏水灌胃，阳性对照以甲基磺酸乙酯灌胃。
2 结果与讨论
2.1 急性毒性试验：灌胃染毒后、观察14 d未见动物有任何明显不良反应及死亡，表明枸枣汁的小鼠经口LD50>21.5 g/kg，属实际无毒类物质。
, 百拇医药
2.2 Ames试验结果 见表1。
表1 枸枣汁Ames试验结果(
±s) 组别剂量
(mg/皿)
S-9
每皿回变菌落数
TA97
TA98
TA100
TA102
枸枣汁
, 百拇医药
1190
-
67.2
±
29.4
18.3
±
6.2
80.0
±
25.3
210.0±40.0
119
, http://www.100md.com
-
127.5
±
12.5
29.8
±
2.3
146.1
±
16.4
326.5±28.1
11.90
-
, http://www.100md.com
139.2
±
17.2
30.6
±
5.3
126.0
±
10.8
310.6±36.2
1.19
-
144.5
, 百拇医药
±
12.3
32.8
±
6.4
130.8
±
8.6
295.8±72.3
NQNO
0.5 μg/皿
-
909.6
, http://www.100md.com
±
48.9
362
±
34
1042
±
58
943.5±92.1
阴性对照
-
127.8
±
, http://www.100md.com
20.1
30.8
±
3.1
118.8
±
7.6
260.0±12.2
枸枣汁
1190
+
95.0
±
, 百拇医药
14.9
33.8
±
7.0
109.7
±
29.9
227.5±23.0
119
+
138.7
±
34.3
, 百拇医药
52.4
±
6.9
131.5
±
7.6
318.6±47.3
11.90
+
139.8
±
9.3
31.5
, 百拇医药
±
4.9
112.3
±
10.3
297.2±27.8
1.19
+
129.0
±
17.5
44.3
±
, http://www.100md.com
14.3
118.8
±
15.8
302.4±51.8
2-AF
50 μg/皿
+
1145
±
205
424
±
, 百拇医药
57
802
±
76
509.0±37.4
阴性对照
+
148.3
±
12.3
31.8
±
4.8
, 百拇医药
110.8
±
11.7
284.8±45.9
表1中，无论加或不加S-9混合液，阳性对照回变菌落数为阴性对照2倍以上，呈明显阳性反应。枸枣汁各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照2倍，呈阴性反应。
2.3 小鼠微核试验和精子畸形试验见表2和表3。
表2 枸枣汁微核试验结果 组别
剂量
(g/kg体重)
动物数
, 百拇医药
(只)
PCE数
(个/只)
微核数
(
±s)微核率
(‰)
枸枣汁
2.0
10
1 000
1.5±0.54*
, http://www.100md.com
1.5
5.0
10
1 000
2.0±0.66*
2.0
10.0
10
1 000
1.7±0.64*
1.7
环磷酰胺
, 百拇医药
40 mg/kg
10
1 000
29.2±8.0**
29.2
阴性对照
10
1 000
2.1±0.62
2.1
与阴性对照比较，*P>0.05，**P<0.001表3 枸枣汁小鼠精子畸形试验结果 组别
, http://www.100md.com
剂量
(g/kg)体重
动物数
(只)
精子数
(个/只)
畸形精子数
(
±s)畸形率
(‰)
枸枣汁
2.0
, 百拇医药
5
1 000
2.22±0.4*
2.22
5.0
5
1 000
2.94±0.5*
2.94
10.0
5
1 000
, 百拇医药
2.64±1.0*
2.64
甲基磺
60 mg/kg
5
1 000
7.18±0.9**
7.18
酸乙酯
阴性对照
5
1 000
, 百拇医药
2.12±0.1
2.12
与阴性对照比较，*P>0.05，**P<0.001
表2中，枸枣汁各剂量组小鼠微核率与阴性对照组差异无显著性(P>0.05)，呈阴性反应，阳性组(环磷酰胺40 mg/kg体重)微核率显著高于阴性对照(P<0.001)，呈阳性反应。
表3中，枸枣汁各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组比数，差异无显著性(P>0.05)，阳性组(甲基磺酸乙酯60 mg/kg体重)精子畸形率显著高于阴性对照(P<0.001)，呈阳性反应。
以上体内外试验结果显示：枸枣汁的小鼠经口LD50>21.5 g/kg，属实际无毒类物质；在本试验系统的3个致突变试验中均呈阴性反应，未显示致突变作用。表明枸枣汁为基本无毒性和无致突变活性物质，但还需要进一步的毒理学实验证实其对人的安全性。
, 百拇医药
参考文献
[1] 谢万宗，编.全国中草药汇编.下册.北京：人民卫生出版社，1977.571-572.
[2] 浙江新医学院编.中药大辞典.上册.上海：上海人民出版社，1977.2205-2206.
[3] 卫生部.中华人民共和国国家标准《食品安全性毒理学评价程序和方法》.北京：中国标准出版社，1995.1-5，12-26，35-36，40-41.
[4] Maron Dm,Ames BN,Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.Mutation Res，1983，113：173-215.
[5] 黄幸纾.陈星若，主编.环境化学物致突变致畸致癌试验方法.杭州：浙江科学技术出版社，1985.218-230.
[6] 张立实，王瑞淑，徐维光.小鼠精子致畸试验在食品毒理学评价中的应用.食品卫生学进展，1988，5.117-121.
(收稿日期：1999-01-14), 百拇医药