煤烟提取物致癌作用机制的研究
作者：李芸 沈文会 赵维敏 邱琦 吴元德 仲伟鉴 张荣泉 郑方园 张国雄
单位：李芸 沈文会 赵维敏 邱琦 吴元德；(中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院，北京 100005)；仲伟鉴 张荣泉(上海市卫生防疫站)；郑方园 张国雄(上海市煤气公司)
关键词：煤烟提取物；NIH3T3细胞；DNA断裂损伤；原癌基因
卫生毒理学杂志000205 【摘要】 目的 从煤烟对细胞膜理化特性的影响，对DNA的损伤，诱导原癌基因表达方面研究其致癌作用机制。方法 利用1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和N-3芘-马来酰亚胺(N-3P-M)分别标记NIH3T3细胞膜脂和膜蛋白，不同剂量的煤烟作用后，通过其荧光偏振度的改变确定膜理化特性的变化；利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，通过DNA-EB结合物荧光强度的变化确定基因组DNA损伤程度；利用地高辛标记的c-myc癌基因作探针，运用斑点杂交的方法，检测c-myc基因的表达情况。结果 不同剂量的煤烟作用后，能够引起膜脂流动性升高，膜蛋白运动度无显著变化，能够引起DNA的断裂损伤及c-myc基因的高表达，且上述变化皆与剂量密切相关。结论 煤烟的诱变性与其对细胞膜、DNA及原癌基因的表达的影响密切相关。
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Studies on carcinogenetic mechanism of coom extracts
LI Yun,SHEN Wen-hui,ZHAO Wei-Min
(Institute of Basic Medical Science,CAMS & PUMC,Beijing,100005,China.)
【Abstract】 Objective To study the carcinogentic effects associated with coom extract.Methods The membrane lipid and protein of NIH3T3 cells were labeled with 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene(DPH)and N-3-pyrene-maleimide(N-3P-M)respectively and the changes of membrane physiochemical properties after stimulation with coom extract of different doses were studied;vsing ethidium bromide(EB) as a fluorescence probe,the injury of the cells genome DNA was observed;vsing c-myc oncogene labeled with digoxigenin,the expression of c-myc oncogene was studied.Results The fluidity of membrane lipid raised,while the mobility of membrane protein didn't change obviously in the cells stimulated by coom extract of different doses;The coom extract also induced genome DNA breakage injury;The expression of c-myc oncogene raised.All of the above were all related closely to the dose of the coom extract.Conclusion The mechanism of coom's carcinogenesis is related closely with its effects on cell membrane,DNA and oncogene expression
, 百拇医药
【Key words】 coom extract; NIH3T3 cells; DNA breakage injury; oncogene
煤烟是一种具有强诱变性，组成极其复杂的多相混合体系，也是我国大气颗粒物的主要污染源，严重危害广大职工、居民的健康，但有关煤烟颗粒致癌生物学过程的研究报道甚少。有研究表明这一过程涉及自由基的作用，煤烟的诱变性与其对*OH生成的加速作用及其对DNA造成的氧化损伤有一定关系[1，2]。本实验首先利用荧光标记物研究了煤烟对细胞膜脂和膜蛋白理化特性的影响；进而利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，研究了煤烟对DNA的断裂损伤情况；c-myc基因是一种快速反应基因，其过度表达与细胞的癌变有关[3]，本实验利用斑点杂交的方法，观察经煤烟提取物作用后的细胞内c-myc基因的表达情况，从而对煤烟的致癌作用机制进行初步探讨。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试剂与仪器 NIH3T3细胞由本所细胞室惠赠。煤烟由上海市卫生防疫站采自杨浦煤气厂；Tris:USB公司；佛波酯(TPA)、硫代巴比妥酸(TBA)、二氨基四乙酸(EDTA)、EB：Sigma公司；蛋白酶K：MERCK公司；RNase A、地高辛标记检测试剂盒：Boeheringer Mannheim公司；苯丙[α]芘(B[α]P)、1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)、N-3芘-马来酰亚胺(N[3P]M)：Fluke公司；其余试剂均为国产分析纯；荧光分光光度计：HITACHII公司MPF-4型；紫外薄层扫描仪为日本岛津公司产品。
1.2 NIH3T3细胞的培养 细胞生长于DMEM培养基中(含体积分数为10 %的灭活小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml的链霉素；pH7.2～7.4)，培养条件为37 ℃、体积分数为5 %的CO2。
1.3 细胞刺激物的制备
, 百拇医药
1.3.1 煤烟采样如文献[4]所述。采集于玻璃纤维滤膜上的煤烟加入适量的三氯甲烷(CHCl3),超声15 min后提取，提取液吹干后制成浓度为254 mg/ml的溶液。
1.3.2 B[α]P：取5 mg溶于5 ml丙酮，4 ℃保存，使用液终浓度为1 μg/ml 和10 μg/ml 2组。
1.3.3 TPA：溶于二甲基亚砜，使其终浓度为0.1 μg/ml 和1 μg/ml。
1.4 刺激物作用于细胞 以胰酶消化NIH3T3细胞，制成1×106个/ml的细胞悬液，各种刺激物作用于细胞，37 ℃温育1 h,1 000 r/min离心10 min收集细胞，用生理盐水制成细胞悬液待用。
1.5 细胞膜脂及膜蛋白的荧光标记 在2.5 ml各组细胞悬液中加入浓度为2×10-3 mol/L的DPH2.5 μl，温育30 min,1 500 r/min离心5 min,生理盐水清洗1次，再制成2.5 ml细胞悬液，细胞计数，以激发波长358 nm，发射波长429 nm，测定荧光偏振度。细胞悬液中加入浓度为4×10-5 mol/L的N[3P]M2.5 μl,同上述处理，以激发波长343 nm，发射波长376 nm，测定荧光偏振度。
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1.6 细胞基因组DNA的提取和定量 采用酚氯仿抽提法[5]。
1.7 EB嵌入测定DNA断裂损伤
1.7.1 取20 μgDNA，用1×SSC溶液稀释成终体积为500 μl的反应体系，分别加入剂量为1 mg(低剂量)、5 mg(中低剂量)、10 mg(高剂量)的煤烟提取物以及40 μl的CHCl3,37 ℃孵育1 h。
1.7.2 在上述样品中分别加入10 μgEB,作用15 min,用0.1×SSC溶液稀释至2 ml，以520 nm为激发波长，测定600 nm处的相对荧光强度。
1.8 地高辛标记探针 按Boeheringer Mannheim公司试剂盒说明书用随机引物法进行。
1.9 刺激物作用细胞 取旺盛生长的细胞，在培养基中加入不同剂量的作用物，37 ℃孵育2 h，收集细胞，制成106个/ml的细胞悬液。
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1.10 斑点杂交 方法参照文献[6]。拍摄滤膜照片，并进行薄层扫描分析。
2 结果
2.1 小剂量的B[α]P和TPA联合作用 DPH荧光偏振度有下降趋势，但未显示出统计学上的差异；10倍剂量的B[α]P作用后，DPH偏振度较对照组显著降低(P<0.01)；10倍剂量的TPA作用后，DPH偏振度也有明显下降(P<0.01)。煤烟提取物作用后，DPH荧光偏振度下降(P<0.05)，且剂量越大，下降愈明显；N[3P]M亦有下降趋势，但差异无显著性(表1)。
表1 各刺激物致细胞膜理化特性的改变(x±s,n=6) 刺激物
浓度(μg/ml)
DPH
N[3P]M
, 百拇医药
B[α]P+TPA
1+0.1
0.150±0.016
0.094±0.005
B[α]P
10
0.039±0.009**
TPA
1
0.078±0.013**
煤烟提取物
5×103
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0.140±0.080
0.125±0.006
10×103
0.099±0.040
0.102±0.007
15×103
0.049±0.032**
0.097±0.013
对照组
0
0.170±0.012
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0.110±0.002
与正常组相比，P<0.05，**P<0.01
2.2 细胞基因组DNA的损伤 仅以煤烟的溶剂CHCl3及低剂量的煤烟作用，其DNA-EB结合物的荧光值呈下降趋势，但与正常对照组相比差异无显著性；以中剂量的煤烟作用，其结合物的荧光值下降，差异有显著性(P<0.05)；以高剂量的煤烟作用，其结合物的荧光值明显下降，与正常对照组相比，差异有显著性(P<0.01，表2)。
表2 各刺激物作用于细胞后DNA-EB结合物荧光值(x±s,n=6) 煤烟提取物(mg/ml)
DNA-EB结合物荧光值
0
, 百拇医药 22.550±2.588
CHCl3
22.325±2.839
1
20.175±1.466
5
18.850±0.985
10
17.525±0.532
与正常组相比，P<0.05，P<0.012.3 c-myc基因的表达 斑点杂交结果显示，仅以CHCl3作用细胞，c-myc基因基本无表达；分别以3种剂量的煤烟作用于细胞，c-myc基因表达，且随着剂量的增大，表达增强，薄层扫描分析亦显示了这一结果(图1)。
, 百拇医药
图1 c-myc基因斑点杂交薄层扫描图
3 讨论
3.1 细胞膜是细胞的重要组成部分，它在细胞的代谢分裂增殖中发挥重要作用。本实验应用DPH标记膜脂，N[3P]M标记膜蛋白，各刺激因素作用后，测其荧光偏振度。结果发现，无论B[α]P、TPA，还是煤烟提取物，皆会使DPH荧光偏振度下降，说明细胞膜脂的流动性增加，且与剂量相关；N[3P]M的荧光偏振度也呈下降趋势，说明细胞膜蛋白的运动度也增加。B[α]P和TPA都是已知的强致促癌物，本实验检测了它们对NIH3T3细胞膜脂、膜蛋白理化特性的影响，并与煤烟对其作用进行比较，产生了类似的作用结果。
3.2 EB自身荧光很弱，当它特异性地嵌入DNA双螺旋结构中时可以产生很强的荧光，当DNA由于损伤，产生链的断裂，导致EB嵌入量减少，荧光强度降低[7]。单独以CHCl3作用于细胞基因组DNA，其结合物荧光强度与正常对照组相比无明显差异，溶剂本身对DNA不产生损伤作用；小剂量的煤烟作用，对DNA基本无损伤作用；中、高剂量的煤烟作用，结合物的荧光值显著下降，且剂量愈高，荧光值愈低，说明DNA链产生断裂损伤，且损伤程度与煤烟的剂量正相关。
, 百拇医药
3.3 c-myc基因是一种快速反应基因，其过度表达与细胞的癌变有关，c-myc基因的活化是细胞持续增殖所必须的前提条件。仅以CHCl3作用细胞，c-myc基因基本不表达，说明溶剂本身在c-myc基因的激活表达中不起作用；低、中、高3种剂量的煤烟作用，皆引起c-myc基因的表达，且与剂量正相关。
3.4 煤烟作用如何引起c-myc基因的过度表达呢?一种可能是与其对DNA的损伤有关。DNA结构的改变，尤其是链的断裂，在修复过程中可能发生错误从而引发突变，DNA结构的改变可以影响基因的转录，这些都有可能影响基因的表达。另一种可能是通过影响细胞的信号转导系统发挥作用。煤烟作用后能够引起膜脂、膜蛋白理化特性的改变，细胞膜是细胞的信号转导系统的重要组分，膜的改变会进一步影响到信号系统的其他组分，引发一系列的信号级联，最终导致基因表达的改变。
最后，本实验初步探讨了在环境污染严重地区肿瘤发生率相对较高的可能机制，为其防治提供了一些线索。
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本课题受国家自然科学基金资助(39400030)
参考文献
[1] Halliuel B,Grootueld M.Methods for measurement of hydroxyl radicals in biochemical systems.Methods Biol Andysis.1991,33,59-90.
[2] Pryor WA.Cigarette smoke & the involvement of free radical redical reactions in chemical carcinogenesis.Br J Cancer,1987,55(suppl.Ⅷ):19-23.
[3] Waikel RL,Wang XJ,Roop DR.Targeted expression of c-myc in the epidermis alters normal proliferation,differentiation and UV-B induced apoptosis.Oncogene 1999,18:4870-4878.
, 百拇医药
[4] 仲伟鉴，张荣泉.煤烟颗粒对DNA氧化损伤.Ⅰ对deoxyribose羟化降解的影响.致突*致畸*致癌，1997，9：235-237.
[5] 卢圣栋，主编.核酸的分离与纯化.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993，95.
[6] 鲍家驹，沈德瑜，王瑞瑜，等.一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法用于癌基因表达.中国医学科学院学报，1991，13：439-442.
[7] 刘晓麒，曹恩华.亚油酸体系脂质过氧化引起的DNA损伤研究.生物物理学报，1993，9：493-497.
(收稿日期：1999-07-28), 百拇医药
单位：李芸 沈文会 赵维敏 邱琦 吴元德；(中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学院，北京 100005)；仲伟鉴 张荣泉(上海市卫生防疫站)；郑方园 张国雄(上海市煤气公司)
关键词：煤烟提取物；NIH3T3细胞；DNA断裂损伤；原癌基因
卫生毒理学杂志000205 【摘要】 目的 从煤烟对细胞膜理化特性的影响，对DNA的损伤，诱导原癌基因表达方面研究其致癌作用机制。方法 利用1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)和N-3芘-马来酰亚胺(N-3P-M)分别标记NIH3T3细胞膜脂和膜蛋白，不同剂量的煤烟作用后，通过其荧光偏振度的改变确定膜理化特性的变化；利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，通过DNA-EB结合物荧光强度的变化确定基因组DNA损伤程度；利用地高辛标记的c-myc癌基因作探针，运用斑点杂交的方法，检测c-myc基因的表达情况。结果 不同剂量的煤烟作用后，能够引起膜脂流动性升高，膜蛋白运动度无显著变化，能够引起DNA的断裂损伤及c-myc基因的高表达，且上述变化皆与剂量密切相关。结论 煤烟的诱变性与其对细胞膜、DNA及原癌基因的表达的影响密切相关。
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Studies on carcinogenetic mechanism of coom extracts
LI Yun,SHEN Wen-hui,ZHAO Wei-Min
(Institute of Basic Medical Science,CAMS & PUMC,Beijing,100005,China.)
【Abstract】 Objective To study the carcinogentic effects associated with coom extract.Methods The membrane lipid and protein of NIH3T3 cells were labeled with 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene(DPH)and N-3-pyrene-maleimide(N-3P-M)respectively and the changes of membrane physiochemical properties after stimulation with coom extract of different doses were studied;vsing ethidium bromide(EB) as a fluorescence probe,the injury of the cells genome DNA was observed;vsing c-myc oncogene labeled with digoxigenin,the expression of c-myc oncogene was studied.Results The fluidity of membrane lipid raised,while the mobility of membrane protein didn't change obviously in the cells stimulated by coom extract of different doses;The coom extract also induced genome DNA breakage injury;The expression of c-myc oncogene raised.All of the above were all related closely to the dose of the coom extract.Conclusion The mechanism of coom's carcinogenesis is related closely with its effects on cell membrane,DNA and oncogene expression
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【Key words】 coom extract; NIH3T3 cells; DNA breakage injury; oncogene
煤烟是一种具有强诱变性，组成极其复杂的多相混合体系，也是我国大气颗粒物的主要污染源，严重危害广大职工、居民的健康，但有关煤烟颗粒致癌生物学过程的研究报道甚少。有研究表明这一过程涉及自由基的作用，煤烟的诱变性与其对*OH生成的加速作用及其对DNA造成的氧化损伤有一定关系[1，2]。本实验首先利用荧光标记物研究了煤烟对细胞膜脂和膜蛋白理化特性的影响；进而利用溴化乙锭(EB)作荧光探针，研究了煤烟对DNA的断裂损伤情况；c-myc基因是一种快速反应基因，其过度表达与细胞的癌变有关[3]，本实验利用斑点杂交的方法，观察经煤烟提取物作用后的细胞内c-myc基因的表达情况，从而对煤烟的致癌作用机制进行初步探讨。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 试剂与仪器 NIH3T3细胞由本所细胞室惠赠。煤烟由上海市卫生防疫站采自杨浦煤气厂；Tris:USB公司；佛波酯(TPA)、硫代巴比妥酸(TBA)、二氨基四乙酸(EDTA)、EB：Sigma公司；蛋白酶K：MERCK公司；RNase A、地高辛标记检测试剂盒：Boeheringer Mannheim公司；苯丙[α]芘(B[α]P)、1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(DPH)、N-3芘-马来酰亚胺(N[3P]M)：Fluke公司；其余试剂均为国产分析纯；荧光分光光度计：HITACHII公司MPF-4型；紫外薄层扫描仪为日本岛津公司产品。
1.2 NIH3T3细胞的培养 细胞生长于DMEM培养基中(含体积分数为10 %的灭活小牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml的链霉素；pH7.2～7.4)，培养条件为37 ℃、体积分数为5 %的CO2。
1.3 细胞刺激物的制备
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1.3.1 煤烟采样如文献[4]所述。采集于玻璃纤维滤膜上的煤烟加入适量的三氯甲烷(CHCl3),超声15 min后提取，提取液吹干后制成浓度为254 mg/ml的溶液。
1.3.2 B[α]P：取5 mg溶于5 ml丙酮，4 ℃保存，使用液终浓度为1 μg/ml 和10 μg/ml 2组。
1.3.3 TPA：溶于二甲基亚砜，使其终浓度为0.1 μg/ml 和1 μg/ml。
1.4 刺激物作用于细胞 以胰酶消化NIH3T3细胞，制成1×106个/ml的细胞悬液，各种刺激物作用于细胞，37 ℃温育1 h,1 000 r/min离心10 min收集细胞，用生理盐水制成细胞悬液待用。
1.5 细胞膜脂及膜蛋白的荧光标记 在2.5 ml各组细胞悬液中加入浓度为2×10-3 mol/L的DPH2.5 μl，温育30 min,1 500 r/min离心5 min,生理盐水清洗1次，再制成2.5 ml细胞悬液，细胞计数，以激发波长358 nm，发射波长429 nm，测定荧光偏振度。细胞悬液中加入浓度为4×10-5 mol/L的N[3P]M2.5 μl,同上述处理，以激发波长343 nm，发射波长376 nm，测定荧光偏振度。
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1.6 细胞基因组DNA的提取和定量 采用酚氯仿抽提法[5]。
1.7 EB嵌入测定DNA断裂损伤
1.7.1 取20 μgDNA，用1×SSC溶液稀释成终体积为500 μl的反应体系，分别加入剂量为1 mg(低剂量)、5 mg(中低剂量)、10 mg(高剂量)的煤烟提取物以及40 μl的CHCl3,37 ℃孵育1 h。
1.7.2 在上述样品中分别加入10 μgEB,作用15 min,用0.1×SSC溶液稀释至2 ml，以520 nm为激发波长，测定600 nm处的相对荧光强度。
1.8 地高辛标记探针 按Boeheringer Mannheim公司试剂盒说明书用随机引物法进行。
1.9 刺激物作用细胞 取旺盛生长的细胞，在培养基中加入不同剂量的作用物，37 ℃孵育2 h，收集细胞，制成106个/ml的细胞悬液。
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1.10 斑点杂交 方法参照文献[6]。拍摄滤膜照片，并进行薄层扫描分析。
2 结果
2.1 小剂量的B[α]P和TPA联合作用 DPH荧光偏振度有下降趋势，但未显示出统计学上的差异；10倍剂量的B[α]P作用后，DPH偏振度较对照组显著降低(P<0.01)；10倍剂量的TPA作用后，DPH偏振度也有明显下降(P<0.01)。煤烟提取物作用后，DPH荧光偏振度下降(P<0.05)，且剂量越大，下降愈明显；N[3P]M亦有下降趋势，但差异无显著性(表1)。
表1 各刺激物致细胞膜理化特性的改变(x±s,n=6) 刺激物
浓度(μg/ml)
DPH
N[3P]M
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B[α]P+TPA
1+0.1
0.150±0.016
0.094±0.005
B[α]P
10
0.039±0.009**
TPA
1
0.078±0.013**
煤烟提取物
5×103
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0.140±0.080
0.125±0.006
10×103
0.099±0.040
0.102±0.007
15×103
0.049±0.032**
0.097±0.013
对照组
0
0.170±0.012
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0.110±0.002
与正常组相比，P<0.05，**P<0.01
2.2 细胞基因组DNA的损伤 仅以煤烟的溶剂CHCl3及低剂量的煤烟作用，其DNA-EB结合物的荧光值呈下降趋势，但与正常对照组相比差异无显著性；以中剂量的煤烟作用，其结合物的荧光值下降，差异有显著性(P<0.05)；以高剂量的煤烟作用，其结合物的荧光值明显下降，与正常对照组相比，差异有显著性(P<0.01，表2)。
表2 各刺激物作用于细胞后DNA-EB结合物荧光值(x±s,n=6) 煤烟提取物(mg/ml)
DNA-EB结合物荧光值
0
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CHCl3
22.325±2.839
1
20.175±1.466
5
18.850±0.985
10
17.525±0.532
与正常组相比，P<0.05，P<0.012.3 c-myc基因的表达 斑点杂交结果显示，仅以CHCl3作用细胞，c-myc基因基本无表达；分别以3种剂量的煤烟作用于细胞，c-myc基因表达，且随着剂量的增大，表达增强，薄层扫描分析亦显示了这一结果(图1)。
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图1 c-myc基因斑点杂交薄层扫描图
3 讨论
3.1 细胞膜是细胞的重要组成部分，它在细胞的代谢分裂增殖中发挥重要作用。本实验应用DPH标记膜脂，N[3P]M标记膜蛋白，各刺激因素作用后，测其荧光偏振度。结果发现，无论B[α]P、TPA，还是煤烟提取物，皆会使DPH荧光偏振度下降，说明细胞膜脂的流动性增加，且与剂量相关；N[3P]M的荧光偏振度也呈下降趋势，说明细胞膜蛋白的运动度也增加。B[α]P和TPA都是已知的强致促癌物，本实验检测了它们对NIH3T3细胞膜脂、膜蛋白理化特性的影响，并与煤烟对其作用进行比较，产生了类似的作用结果。
3.2 EB自身荧光很弱，当它特异性地嵌入DNA双螺旋结构中时可以产生很强的荧光，当DNA由于损伤，产生链的断裂，导致EB嵌入量减少，荧光强度降低[7]。单独以CHCl3作用于细胞基因组DNA，其结合物荧光强度与正常对照组相比无明显差异，溶剂本身对DNA不产生损伤作用；小剂量的煤烟作用，对DNA基本无损伤作用；中、高剂量的煤烟作用，结合物的荧光值显著下降，且剂量愈高，荧光值愈低，说明DNA链产生断裂损伤，且损伤程度与煤烟的剂量正相关。
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3.3 c-myc基因是一种快速反应基因，其过度表达与细胞的癌变有关，c-myc基因的活化是细胞持续增殖所必须的前提条件。仅以CHCl3作用细胞，c-myc基因基本不表达，说明溶剂本身在c-myc基因的激活表达中不起作用；低、中、高3种剂量的煤烟作用，皆引起c-myc基因的表达，且与剂量正相关。
3.4 煤烟作用如何引起c-myc基因的过度表达呢?一种可能是与其对DNA的损伤有关。DNA结构的改变，尤其是链的断裂，在修复过程中可能发生错误从而引发突变，DNA结构的改变可以影响基因的转录，这些都有可能影响基因的表达。另一种可能是通过影响细胞的信号转导系统发挥作用。煤烟作用后能够引起膜脂、膜蛋白理化特性的改变，细胞膜是细胞的信号转导系统的重要组分，膜的改变会进一步影响到信号系统的其他组分，引发一系列的信号级联，最终导致基因表达的改变。
最后，本实验初步探讨了在环境污染严重地区肿瘤发生率相对较高的可能机制，为其防治提供了一些线索。
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本课题受国家自然科学基金资助(39400030)
参考文献
[1] Halliuel B,Grootueld M.Methods for measurement of hydroxyl radicals in biochemical systems.Methods Biol Andysis.1991,33,59-90.
[2] Pryor WA.Cigarette smoke & the involvement of free radical redical reactions in chemical carcinogenesis.Br J Cancer,1987,55(suppl.Ⅷ):19-23.
[3] Waikel RL,Wang XJ,Roop DR.Targeted expression of c-myc in the epidermis alters normal proliferation,differentiation and UV-B induced apoptosis.Oncogene 1999,18:4870-4878.
, 百拇医药
[4] 仲伟鉴，张荣泉.煤烟颗粒对DNA氧化损伤.Ⅰ对deoxyribose羟化降解的影响.致突*致畸*致癌，1997，9：235-237.
[5] 卢圣栋，主编.核酸的分离与纯化.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993，95.
[6] 鲍家驹，沈德瑜，王瑞瑜，等.一种简便且灵敏的核酸杂交新方法——地高辛配基标记探针细胞原位杂交法用于癌基因表达.中国医学科学院学报，1991，13：439-442.
[7] 刘晓麒，曹恩华.亚油酸体系脂质过氧化引起的DNA损伤研究.生物物理学报，1993，9：493-497.
(收稿日期：1999-07-28), 百拇医药