湖南汉族群体HLA－DQA1位点等位基因多态性分析
作者：田伟 李立新 郭实士 程文
单位：田伟(免疫学研究室 长沙 410078)；李立新(免疫学研究室 长沙 410078)；郭实士(免疫学研究室 长沙 410078)；程文(免疫学研究室 长沙 410078)
关键词：HLA-DQ抗原类；聚合酶链式反应；序列特异性引物*；单链构像多态性*
湖南医科大学学报000215[摘要] 目的：分析湖南汉族群体HLA-DQA1位点等位基因 多态性。方法：应用PCR/SSP和 银染PCR/SSCP技术对60名无血缘关系湖南汉族健康个体作HLA-DQA1基因分型。结果：检出 10 种HLA-DQA1等位基因, 基因频率范围为0.0167～0.2254；HLA-DQA1*0302，*0501，*01 02 为常见等位基因，HLA-DQA1*0101,*0201,*0401为少见等位基因。检出26种基因型，基因型 观察值和理论值分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。5例样本的PCR/SSP分型只能 确定一个等位基因，另一等位基因经PCR/SSCP确认。结论：提供了湖南汉族群体HLA-DQA1 位点等位基因频率正常值。
, 百拇医药
[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0141-03
Allelic polymorphism of HLA-DQA1 locus in Han nationality
in Hunan province
TIAN Wei, LI Li-xin, GUO Shi-shi, et al.
Immunology Research Laboratory, Hunan Medical University(Changsha 41007 8)
[Abstract] Objective: To explore the genetic polymorphism of H LA-DQA1 locus in H an nationality in Hunan province. Method: Sixty samples randomly selected from h ealthy individuals of Han nationality in Hunan province were typed for HLA-DQA1 by PCR/SSP in combination with silver-staining PCR/SSCP. Results: Ten types of HL A-DQA1 alleles were found in all 60 samples, HLA-DQA1*0302, *0501,*0102 were t he common alleles with gene frequencies of 0.2254, 0.2254,and 0.2041 respectively .Twenty-six kinds of genotypes were found ,and the genotype distribution fitt e d the Hardy-Weinberg equilibrium test (P>0.05 ).Five samples which had amb iguity in their PCR/SSP typing were further clarified with PCR/SSCP analysis .C onc lusions: Normal gene frequency values of HLA-DQA1 alleles in Han nationality i n Hunan province are provided; PCR/SSCP can be used to eliminate the ambiguity whi ch might exist in PCR/SSP typing for HLA-DQA1 locus.
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[Key words] HLA-DQ antigens; polymerase chain reaction; se quence specific primer*; single strand conformational polymorphism
HLA-DQA1编码基因具有多态性，该位点等位基因分型对器官移植、HLA与疾病关联研究及 法 医学个体认定均有重要意义。本文采用序列特异性引物扩增技术(sequence specific prime r, PCR/SSP)结合单链构像多态性分析技术(single strand conformational polymorphism , PCR/SSCP)调查湖南地区一汉族群体HLA-DQA1遗传多态性，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 调查群体 60名无血缘关系健康志愿献血者系我校附属卫校95级学生 ，均为连续第三代的湖南籍汉族人。
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1.2 主要试剂 蛋白酶k系E. Merck公司产品；Ampli Taq DNA聚合酶和HLA-DQA1*0102，*0103，*0401，*0 6 01等4种等位基因标准DNA由美国Baylor大学罗亚敏博士赠送；琼脂糖系Promega公司产品； 丙烯酰胺系Sigma公司产品；FD-DNA聚合酶系上海复华公司产品；二甲叉双丙烯酰胺系Fluc k 公司产品；HLA-DQA1等位基因PCR/SSP分型引物试剂盒(Dynal,批号：626)由第12次国 际协作大会(12th IHWC)HLA-DR2协作组统一提供。
1.3 外周血白细胞基因组DNA提取 按文献方法[1]。
1.4 PCR/SSP作HLA-DQA1等位基因分型 共使用14对序列特异性引物，编号1～14,除第10对 特异性引物外，其余均扩增HLA-DQA1第二外显子。PCR体系为10 μl，含3 μl序列特异性 引 物，1×PCR缓冲液,0.4 U Ampli Taq酶，200 μmol.L-1 dNTP,100 ng基因组DNA。 在PE-480型 基因扩增仪上94℃预变性3 min后，按94℃变性45 s, 64℃退火及延伸90 s循环10次，再按9 4℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸30 s循环20次。取全部PCR产物2%琼脂糖电泳，1×TA E,10 V.cm-1恒压电泳15 min后置紫外灯下观察,根据试剂盒所附扩增格局表(表1 )判定HLA-DQA1等位基因。
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1.5 HLA-DQA1基因第二外显子银染PCR/SSCP分析 PCR扩增HLA-DQA1基因第二外显子第11～87位密码子区域，片段长229 bp。引物序列按11t h IHWC[1]设计，由上海Sangon公司合成。PCR体积为20 μl,含1×PCR缓冲液，1 U FD-DNA聚 合酶，10 pmol引物,200 μmol.L-1 dNTP,200 ng基因组DNA。设PCR退火温度为65℃ ，其余参 数同文献[1]。取PCR扩增产物6 μl,，加等体积载样缓冲液(95%甲酰胺，20 mmol.L-1EDT A,0.1%溴酚蓝)，95℃变性7 min，迅速置冰浴骤冷10 min后备用。15%非变性聚丙烯酰胺 凝胶(Acr:Bis=49:1,作胶面积10 cm×9 cm×0.1 cm)于4℃,60 V恒压电泳16 h。凝胶采用银 染，方法同文献[2]。
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1.6 统计学处理 等位基因频率,Hardy-Weinberg吻合度检验均按文献 [3]方法计算。
2 结 果
共检出10种HLA-DQA1等位基因(图1) ,以HLA-DQA1*0302,*0501,*0102最为常见，DQA1*010 1,*0201,*0401为少见等位基因，各等位基因频率详见表2。共检出26 种HLA-DQA1基因型， Hardy-Weinberg检验示P>0.05。5例样本PCR/SSP分型只能指定一个 HLA-DQA1基因型别，这些样本的另一HLA-DQA1等位基因经PCR/SSCP分析确定(表3，图2) 。
图1 HLA-DQA1 等位基因PCR/SSP 电泳图 谱 A：HLA-DQA1*0102/*0501杂合子；2，3，6， 9，12为PCR/SSP 反应阳性。B：HLA-DQA1*0102/*0601杂合子；2，3，6，9，14为PCR/SS P反应 阳性。M：DQA1基因第二外显子扩增2片段(229 bp)。内对照PCR扩增带：人生长激素基因 片段(429 bp)
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Fig.1 Gel electrophoresis of PCR/SSP products of two HLA-DQA1 heterozygotes A：HLA-DQA1*0102/*0501; B：HLA-DQA1*0 102/*0601. M：PCR amplified fragment of the 2nd exon of HLA-DQA1 gene (229 bp )
图2 HLA-DQA1等位基因第二外显子PCR/SSCP 分析 1， DQA1*0101/ *0301； 2，DQA1*0103/*0501； 3，DQA1*0302/*0501； 4，DQA1*0 501/-；5，DQA1*0102/*0501; 6，DQA1*0501/-
Fig.2 PCR/SSCP analysis of the 2nd exon of HLA-DQA1 alleles 1， DQA1*0101/ *0301； 2，DQA1*0103/*0501； 3，DQA1*0302/* 0501； 4，DQA1*0501/-；5，DQA1*0102/*0501; 6, DQA1*0501/-
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表1 HLA-DQA1位点PCR/SSP分型引物扩增特 异性 引物编号
PCR产物长度(bp)
扩增特异性
1
150
DQA1*0101,0104
2
170
DQA1*0101，0102，0104
3
150
DQA1*0102，0103
, 百拇医药
4
170
DQA1*0103
5
220
DQA1*0104
6
60
DQA1*0104以外等位基因
7
120
DQA1*0201
8
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180
DQA1*0301，0302
9
220
DQA1*0302以外等位基因
10
150
DQA1*0302
11
210
DQA1*0401
12
90
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DQA1*0501
13
90
DQA1*0502
14
120
DQA1*0601
表2 湖南汉族HLA-DQA1等位基因频率(N=6 0) 等位基因
阳性标本数
等 位基因频率
0101
2
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0.0167
0102
22
0.2041
0103
11
0.0962
0104
9
0.0780
0201
2
0.0167
, 百拇医药
0301
8
0.0690
0302
24
0.2254
0401
2
0.0167
0501
24
0.2254
0601
, 百拇医药
8
0.0690
表3 经PCR/SSCP定型的样本 样本号
PCR/SSP分型
PCR/ SSCP定型
8
*0102/*0501或*0103/ *0501
*0102/ *0501
9
*0104/*0302或*0104/*0501
*0104/*0501
, 百拇医药
18
*0302/*0601或*0302/*0501
*0302/ *0601
41
*0501/-或0401/*0501
*0501/-
46
*0103/*0301或*0103/-
*0103/ *0301
3 讨 论
HLA- DQA1*0101和*0104在第2外显子的第2密码子存在单碱基差异(*0101为GAC，*010 4为GGC)，DQA1*0301和*0302序列差异位于第3外显子，11th IHWC所设计PCR引物和SSO探针 未能将上述差异进一步区分，而是将前两者合称*0101，将后两者合称*03[1,4,5] 。本次调 查揭示，湖南汉族群体DQA1*0101，*0104等位基因均呈低频率分布，以DQA1*0104为主；DQA 1*03属高频率基因，以DQA1*0302为主,占75%(24/32)。
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本次调查空白基因频率为零，基因型观察值和理论值具有良好的吻合度(P>0.05)， 表明此次 调查结果准确可信，所获数据可作为湖南地区汉族群体HLA- DQA1位点等位基因频率的正常 参考值。
本次调查亦显示，PCR/SSP存在与PCR/SSO[2,6]一样的缺点：即用于HLAⅡ类基 因分型时 可能存在误差或难以准确指定型别。此次PCR/SSP分型中有5例样本只能指定一个HLA-DQA1 型 别，经PCR/SSCP分析样本第二外显子单链构像，并与已定型样本比较才得以完全 定型。这5 例样本均属已检出的等位基因，且主要涉及DQA1*0501，这可能与DQA1*0501序列构成有关， 但不排除No .12序列特异性引物设计需进一步合理化。
参考文献：
[1] Kimura A, Sasazuki T. Eleventh international histocompat ibility workshop reference protocol for the HLA DNA typing technique [M]. In : Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991.New York: Oxford University Press, 1992: Vol 1, 397-419.
, http://www.100md.com
[2] 田伟，郭实士，李立新，等.联合应用PCR/SSCP和PCR/SSO提高HLA基因分型的精确 性[J]. 湖南医科大学学报,1998,23 (4):361-364.
[3] 赵桐茂. HLA遗传学中的统计分析[M].见：赵桐茂主编.HLA分型原理及应用.上海 ：上海科学技术出版社,1984:145-148.
[4] Marsh SGE, Bodmer JG. HLA class Ⅱnucleotide sequences,1992 [M]. In :T suji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991.New York: Oxford University Press, 1 992: Vol 1,32-62.
[5] Noreen H, Hors J, Ronningen KS, et al.HLA-DQA1 and -DQB1 polymorph ism using polymerase chain reaction (PCR) oligotyping [M]. In:Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds.HLA 1991.New York : Oxford University Press, 1992:Vol 1,477-4 84.
[6] Kimura A, Sasazuki T. The pre-workshop of the DNA component [M]. In:Ts uji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991. New York : Oxford University Press , 1992:Vol 1,426-431., http://www.100md.com
单位：田伟(免疫学研究室 长沙 410078)；李立新(免疫学研究室 长沙 410078)；郭实士(免疫学研究室 长沙 410078)；程文(免疫学研究室 长沙 410078)
关键词：HLA-DQ抗原类；聚合酶链式反应；序列特异性引物*；单链构像多态性*
湖南医科大学学报000215[摘要] 目的：分析湖南汉族群体HLA-DQA1位点等位基因 多态性。方法：应用PCR/SSP和 银染PCR/SSCP技术对60名无血缘关系湖南汉族健康个体作HLA-DQA1基因分型。结果：检出 10 种HLA-DQA1等位基因, 基因频率范围为0.0167～0.2254；HLA-DQA1*0302，*0501，*01 02 为常见等位基因，HLA-DQA1*0101,*0201,*0401为少见等位基因。检出26种基因型，基因型 观察值和理论值分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。5例样本的PCR/SSP分型只能 确定一个等位基因，另一等位基因经PCR/SSCP确认。结论：提供了湖南汉族群体HLA-DQA1 位点等位基因频率正常值。
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[中图分类号] R392.1 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0141-03
Allelic polymorphism of HLA-DQA1 locus in Han nationality
in Hunan province
TIAN Wei, LI Li-xin, GUO Shi-shi, et al.
Immunology Research Laboratory, Hunan Medical University(Changsha 41007 8)
[Abstract] Objective: To explore the genetic polymorphism of H LA-DQA1 locus in H an nationality in Hunan province. Method: Sixty samples randomly selected from h ealthy individuals of Han nationality in Hunan province were typed for HLA-DQA1 by PCR/SSP in combination with silver-staining PCR/SSCP. Results: Ten types of HL A-DQA1 alleles were found in all 60 samples, HLA-DQA1*0302, *0501,*0102 were t he common alleles with gene frequencies of 0.2254, 0.2254,and 0.2041 respectively .Twenty-six kinds of genotypes were found ,and the genotype distribution fitt e d the Hardy-Weinberg equilibrium test (P>0.05 ).Five samples which had amb iguity in their PCR/SSP typing were further clarified with PCR/SSCP analysis .C onc lusions: Normal gene frequency values of HLA-DQA1 alleles in Han nationality i n Hunan province are provided; PCR/SSCP can be used to eliminate the ambiguity whi ch might exist in PCR/SSP typing for HLA-DQA1 locus.
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[Key words] HLA-DQ antigens; polymerase chain reaction; se quence specific primer*; single strand conformational polymorphism
HLA-DQA1编码基因具有多态性，该位点等位基因分型对器官移植、HLA与疾病关联研究及 法 医学个体认定均有重要意义。本文采用序列特异性引物扩增技术(sequence specific prime r, PCR/SSP)结合单链构像多态性分析技术(single strand conformational polymorphism , PCR/SSCP)调查湖南地区一汉族群体HLA-DQA1遗传多态性，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 调查群体 60名无血缘关系健康志愿献血者系我校附属卫校95级学生 ，均为连续第三代的湖南籍汉族人。
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1.2 主要试剂 蛋白酶k系E. Merck公司产品；Ampli Taq DNA聚合酶和HLA-DQA1*0102，*0103，*0401，*0 6 01等4种等位基因标准DNA由美国Baylor大学罗亚敏博士赠送；琼脂糖系Promega公司产品； 丙烯酰胺系Sigma公司产品；FD-DNA聚合酶系上海复华公司产品；二甲叉双丙烯酰胺系Fluc k 公司产品；HLA-DQA1等位基因PCR/SSP分型引物试剂盒(Dynal,批号：626)由第12次国 际协作大会(12th IHWC)HLA-DR2协作组统一提供。
1.3 外周血白细胞基因组DNA提取 按文献方法[1]。
1.4 PCR/SSP作HLA-DQA1等位基因分型 共使用14对序列特异性引物，编号1～14,除第10对 特异性引物外，其余均扩增HLA-DQA1第二外显子。PCR体系为10 μl，含3 μl序列特异性 引 物，1×PCR缓冲液,0.4 U Ampli Taq酶，200 μmol.L-1 dNTP,100 ng基因组DNA。 在PE-480型 基因扩增仪上94℃预变性3 min后，按94℃变性45 s, 64℃退火及延伸90 s循环10次，再按9 4℃变性45 s,61℃退火45 s,72℃延伸30 s循环20次。取全部PCR产物2%琼脂糖电泳，1×TA E,10 V.cm-1恒压电泳15 min后置紫外灯下观察,根据试剂盒所附扩增格局表(表1 )判定HLA-DQA1等位基因。
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1.5 HLA-DQA1基因第二外显子银染PCR/SSCP分析 PCR扩增HLA-DQA1基因第二外显子第11～87位密码子区域，片段长229 bp。引物序列按11t h IHWC[1]设计，由上海Sangon公司合成。PCR体积为20 μl,含1×PCR缓冲液，1 U FD-DNA聚 合酶，10 pmol引物,200 μmol.L-1 dNTP,200 ng基因组DNA。设PCR退火温度为65℃ ，其余参 数同文献[1]。取PCR扩增产物6 μl,，加等体积载样缓冲液(95%甲酰胺，20 mmol.L-1EDT A,0.1%溴酚蓝)，95℃变性7 min，迅速置冰浴骤冷10 min后备用。15%非变性聚丙烯酰胺 凝胶(Acr:Bis=49:1,作胶面积10 cm×9 cm×0.1 cm)于4℃,60 V恒压电泳16 h。凝胶采用银 染，方法同文献[2]。
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1.6 统计学处理 等位基因频率,Hardy-Weinberg吻合度检验均按文献 [3]方法计算。
2 结 果
共检出10种HLA-DQA1等位基因(图1) ,以HLA-DQA1*0302,*0501,*0102最为常见，DQA1*010 1,*0201,*0401为少见等位基因，各等位基因频率详见表2。共检出26 种HLA-DQA1基因型， Hardy-Weinberg检验示P>0.05。5例样本PCR/SSP分型只能指定一个 HLA-DQA1基因型别，这些样本的另一HLA-DQA1等位基因经PCR/SSCP分析确定(表3，图2) 。
图1 HLA-DQA1 等位基因PCR/SSP 电泳图 谱 A：HLA-DQA1*0102/*0501杂合子；2，3，6， 9，12为PCR/SSP 反应阳性。B：HLA-DQA1*0102/*0601杂合子；2，3，6，9，14为PCR/SS P反应 阳性。M：DQA1基因第二外显子扩增2片段(229 bp)。内对照PCR扩增带：人生长激素基因 片段(429 bp)
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Fig.1 Gel electrophoresis of PCR/SSP products of two HLA-DQA1 heterozygotes A：HLA-DQA1*0102/*0501; B：HLA-DQA1*0 102/*0601. M：PCR amplified fragment of the 2nd exon of HLA-DQA1 gene (229 bp )
图2 HLA-DQA1等位基因第二外显子PCR/SSCP 分析 1， DQA1*0101/ *0301； 2，DQA1*0103/*0501； 3，DQA1*0302/*0501； 4，DQA1*0 501/-；5，DQA1*0102/*0501; 6，DQA1*0501/-
Fig.2 PCR/SSCP analysis of the 2nd exon of HLA-DQA1 alleles 1， DQA1*0101/ *0301； 2，DQA1*0103/*0501； 3，DQA1*0302/* 0501； 4，DQA1*0501/-；5，DQA1*0102/*0501; 6, DQA1*0501/-
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表1 HLA-DQA1位点PCR/SSP分型引物扩增特 异性 引物编号
PCR产物长度(bp)
扩增特异性
1
150
DQA1*0101,0104
2
170
DQA1*0101，0102，0104
3
150
DQA1*0102，0103
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DQA1*0103
5
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DQA1*0104
6
60
DQA1*0104以外等位基因
7
120
DQA1*0201
8
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180
DQA1*0301，0302
9
220
DQA1*0302以外等位基因
10
150
DQA1*0302
11
210
DQA1*0401
12
90
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DQA1*0501
13
90
DQA1*0502
14
120
DQA1*0601
表2 湖南汉族HLA-DQA1等位基因频率(N=6 0) 等位基因
阳性标本数
等 位基因频率
0101
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0.0167
0102
22
0.2041
0103
11
0.0962
0104
9
0.0780
0201
2
0.0167
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0301
8
0.0690
0302
24
0.2254
0401
2
0.0167
0501
24
0.2254
0601
, 百拇医药
8
0.0690
表3 经PCR/SSCP定型的样本 样本号
PCR/SSP分型
PCR/ SSCP定型
8
*0102/*0501或*0103/ *0501
*0102/ *0501
9
*0104/*0302或*0104/*0501
*0104/*0501
, 百拇医药
18
*0302/*0601或*0302/*0501
*0302/ *0601
41
*0501/-或0401/*0501
*0501/-
46
*0103/*0301或*0103/-
*0103/ *0301
3 讨 论
HLA- DQA1*0101和*0104在第2外显子的第2密码子存在单碱基差异(*0101为GAC，*010 4为GGC)，DQA1*0301和*0302序列差异位于第3外显子，11th IHWC所设计PCR引物和SSO探针 未能将上述差异进一步区分，而是将前两者合称*0101，将后两者合称*03[1,4,5] 。本次调 查揭示，湖南汉族群体DQA1*0101，*0104等位基因均呈低频率分布，以DQA1*0104为主；DQA 1*03属高频率基因，以DQA1*0302为主,占75%(24/32)。
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本次调查空白基因频率为零，基因型观察值和理论值具有良好的吻合度(P>0.05)， 表明此次 调查结果准确可信，所获数据可作为湖南地区汉族群体HLA- DQA1位点等位基因频率的正常 参考值。
本次调查亦显示，PCR/SSP存在与PCR/SSO[2,6]一样的缺点：即用于HLAⅡ类基 因分型时 可能存在误差或难以准确指定型别。此次PCR/SSP分型中有5例样本只能指定一个HLA-DQA1 型 别，经PCR/SSCP分析样本第二外显子单链构像，并与已定型样本比较才得以完全 定型。这5 例样本均属已检出的等位基因，且主要涉及DQA1*0501，这可能与DQA1*0501序列构成有关， 但不排除No .12序列特异性引物设计需进一步合理化。
参考文献：
[1] Kimura A, Sasazuki T. Eleventh international histocompat ibility workshop reference protocol for the HLA DNA typing technique [M]. In : Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991.New York: Oxford University Press, 1992: Vol 1, 397-419.
, http://www.100md.com
[2] 田伟，郭实士，李立新，等.联合应用PCR/SSCP和PCR/SSO提高HLA基因分型的精确 性[J]. 湖南医科大学学报,1998,23 (4):361-364.
[3] 赵桐茂. HLA遗传学中的统计分析[M].见：赵桐茂主编.HLA分型原理及应用.上海 ：上海科学技术出版社,1984:145-148.
[4] Marsh SGE, Bodmer JG. HLA class Ⅱnucleotide sequences,1992 [M]. In :T suji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991.New York: Oxford University Press, 1 992: Vol 1,32-62.
[5] Noreen H, Hors J, Ronningen KS, et al.HLA-DQA1 and -DQB1 polymorph ism using polymerase chain reaction (PCR) oligotyping [M]. In:Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds.HLA 1991.New York : Oxford University Press, 1992:Vol 1,477-4 84.
[6] Kimura A, Sasazuki T. The pre-workshop of the DNA component [M]. In:Ts uji K, Aizawa M, Sasazuki T, eds. HLA 1991. New York : Oxford University Press , 1992:Vol 1,426-431., http://www.100md.com