低密度脂蛋白和高密度脂蛋白对动脉内皮细胞一氧化氮生成的影响
作者：任敏 曾智 梁玉佳 强鸥
单位：任敏(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；曾智(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；梁玉佳(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；强鸥(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)
关键词：脂蛋白， 低密度；脂蛋白， 高密度；豚鼠；内皮细胞；一氧化氮
中国动脉硬化杂志000213[摘 要] 为研究高密度脂蛋白和低密度脂蛋白对动脉内皮细胞一氧化氮合成的影响，以豚鼠动脉内皮细胞为实验对象，用低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及两者以不同剂量混合加入培养基中，每组设置三种剂量，分别于2 h、6 h、12 h和24 h测定一氧化氮含量。结果发现，高密度脂蛋白促进内皮细胞一氧化氮的合成(P>0.05)，与剂量大小无关；低密度脂蛋白显著抑制一氧化氮的合成(P<0.001)，与剂量相关；混合组同样明显抑制其合成，与低密度脂蛋白组比较无显著性差异(P>0.05)，各时间段一氧化氮含量无显著性差异(P>0.05)。结果表明，低密度脂蛋白明显抑制血管内皮细胞一氧化氮合成，且与剂量相关，高密度脂蛋白促进一氧化氮合成，但不能拮抗低密度脂蛋白的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R363.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-02-0134-03
Effects of Low Density Lipoprotein and High Density Lipoprotein on Nitric Oxide Synthesized by Vascular Endothelial Cell
REN Min, ZENG Zhi, LIANG Yu-Jia， and QIANG Ou
(The Laboratory of Internal Medicine of the First Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041， China)
, 百拇医药
ABSTRACT Aim To study nitric oxide (NO) variances after vascular endothial cell were impacted by low density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL). Methods Concentrations of NO in the cultured medium were detected in 2 h, 6 h, 12 h and 24 h after the addition of LDL， HDL and both of them respectively in the guinea pig vasular endothial cell. Results LDL could obviously decrease the NO synthesized by vasular endothial cell with dose depentent (P<0.01)and HDL could arise it (P<0.01), LDL mixed with three levels of HDL expressed the same effection as LDL alone (P>0.05). There was no difference in four time's group (P>0.05). Conclusions NO synthesized by vasular endothial cell will be restrainted by LDL and arisen by HDL but couldn't antagonist the former's.
, http://www.100md.com
MeSH Lipoprotein, LDL； Lipoprotein, HDL； Guinea Pig； Endothelial Cell； Nitric Oxide
低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)增高是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的独立危险因素。天然低密度脂蛋白对动脉内皮细胞没有作用，但它在体内或培养过程中经细胞氧化修饰成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)对动脉内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化的始动环节[1]。一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种作用广泛的信息分子，与低密度脂蛋白相互影响,作用于动脉粥样硬化形成的各个环节。文献[2，3]报道,动脉粥样硬化患者及实验性动物均有合成释放一氧化氮功能障碍，但血管内皮细胞经脂蛋白作用后一氧化氮的具体合成变化尚不明了。本文采用豚鼠动脉内皮细胞为实验对象，分别用低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)作用于该细胞，观察24 h内一氧化碳的生成变化。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 动脉内皮细胞培养
无菌条件下取8周龄豚鼠的胸主动脉，将管腔外翻，置于尖底离心管中，用0.1%胶原酶Ⅱ(Sigma 公司)1 mL， 37℃消化20 min，用含20%FCS(国产)的M199培养基(Gibco.BRL)适量终止消化，1 500 r/min×3离心去上清，加2 mL无血清M199，轻轻吹打后用同样方法离心，去上清，最后用20%FCS M199 3 mL将细胞轻轻打成悬液后加入培养瓶内，将培养瓶置于5% CO2孵箱，48 h后换液，约8～10天后可见原代细胞生长，待铺满瓶底后，用0.25%胰酶消化传代培养，5天后将所有细胞消化并收集作试验用，并用免疫细胞化学法作第Ⅷ相关因子鉴定。
1.2 细胞处理
将上述细胞加入24孔板内，使每孔细胞数约为10×104，加入20%FCS M199，细胞贴壁后换液，并将LDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)、HDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)及LDL(200 mg/L)与HDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)分别混匀加入各孔内，培养基作空白对照，每组设12孔，于加药后2 h、6 h、12 h、24 h分别取培养上清200 μL，-20℃保存。HDL、 LDL由本校载脂蛋白研究室提供，系采用一次性密度梯度超速离心法分离人新鲜全血获得，其中LDL蛋白质定量为2294.5 mg/L，HDL蛋白质定量为6430.3 mg/L。
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1.3 一氧化氮测定
利用硝酸还原酶特异性将培养上清中的NO稳定代谢产物NO-3 还原为NO-2，通过显色反应比色测定NO浓度，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4 统计学处理
实验数据以均数±标准差(
±s)表示，组间两两比较采用方差分析，用SAS软件处理。
2 结 果
2.1 细胞鉴定
经第Ⅷ相关因子鉴定，95%的细胞为血管内皮细胞。
, 百拇医药
2.2 不同时间细胞上清一氧化氮值
各组内不同时间一氧化氮值无显著性差异(P>0.05)。LDL组一氧化氮值与混合组无显著性差异(P>0.05)，但它们分别与HDL组有显著性差异(P<0.01)。HDL组组内和混合组组内同一时间一氧化氮值无显著性差异(P>0.05)，但LDL 50 mg/L组与200 mg/L和100 mg/L组有显著性差异(P<0.01)。各组与对照组均有显著性差异(P<0.01)。
表1. 各实验组与对照组不同时间点细胞的一氧化氮含量.
Table 1. The nitric oxide values in cultured medium in different times of experiement and control groups (±s, μmol/L). Groups
, 百拇医药
2 h
6 h
12 h
24 h
Control
36.9±6.05
34.39±3.73
37.51±5.11
38.78±5.68
LDL
200 mg/L
3.01±0.76abc
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6.12±1.51abc
6.30±0.87abc
7.51±1.02abc
100 mg/L
5.01±1.28abc
7.1±2.03abc
6.0±1.10abc
8.1±1.26abc
50 mg/L
10.89±1.01ac
, http://www.100md.com
10.68±0.95ac
8.61±1.23ac
11.08±1.47ac
HDL
200 mg/L
60.63±8.91
43.81±7.45a
55.57±6.81a
48.55±7.56a
100 mg/L
, 百拇医药
46.92±7.56a
45.02±8.33a
41.23±5.01a
47.54±8.73a
50 mg/L
47.39±7.21a
42.11±8.26a
38.03±7.38a
40.22±1.87a
, http://www.100md.com
LDL+HDL
(200+200) mg/L
6.31±1.65ac
7.55±1.31ac
6.18±2.08ac
11.21±3.27ac
(200+100) mg/L
6.25±2.55ac
6.83±2.70ac
9.30±1.78ac
, 百拇医药
10.66±2.34ac
(200+50) mg/L
5.10±1.13ac
6.33±1.45ac
4.78±1.00ac
11.90±3.10ac
a： P<0.01， compared with control group; b： P<0.01， compared with LDL (50 mg/L) group; c： P<0.01, compared with HDL group.
3 讨 论
, 百拇医药
一氧化氮作为一种传递介质和调节介质，在心血管系统中除起到松驰血管平滑肌、控制血压外[4]，并有抗氧化，抑制血小板聚集，抗粘附等生理功能[5]。因此，它与低密度脂蛋白互为因果，相互作用，在动脉粥样硬化的病理发展过程中起着重要作用。一氧化氮由细胞中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, 一氧化氮S)合成，血管壁三种主要细胞即血管内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞中都存在 一氧化氮S，均能合成一氧化氮。在高脂血症患者血流中，血浆脂蛋白作为第一信号作用于血管内皮细胞，引起一氧化氮S活性的改变。本实验表明，低密度脂蛋白能显著抑制血管内皮细胞一氧化氮的生成，一氧化氮的减少程度与低密度脂蛋白剂量呈一定程度依赖性，即随着低密度脂蛋白剂量的增加，一氧化氮的生成随之减少，与作用时间无关。这与动脉粥样硬化患者和实验动物血浆一氧化氮减少相吻合[2，3]，说明血管内皮细胞一氧化氮的生成在调节心血管系统功能中起到主导作用。本文同时发现，高密度脂蛋白能明显增加血管内皮细胞一氧化氮的生成，虽与剂量大小无统计学意义，但有随剂量增加一氧化氮合成增加的趋势。据文献报道，高密度脂蛋白有抗低密度脂蛋白氧化修饰作用。本文高密度脂蛋白按不同剂量与低密度脂蛋白混合，共同作用于血管内皮细胞，结果并未像所推测的随着高密度脂蛋白剂量增加一氧化氮合成增加，在此， 高密度脂蛋白不能影响低密度脂蛋白对血管内皮细胞一氧化氮生成的抑制作用。高密度脂蛋白的作用机制可能是将低密度脂蛋白的主要成份胆固醇运送至肝脏分解，而对血管内皮细胞的直接保护作用不明显。至于引起血管内皮细胞一氧化氮生成增加的原因尚不明了，还需进一步实验证实。低密度脂蛋白引起血管内皮细胞一氧化氮减少的具体途径也不很清楚，Minor等报道，高脂血症患者血管内皮细胞一氧化氮合酶的表达及一氧化氮的合成都正常或是增加，但一氧化氮的活性降低可能是一氧化氮在与靶分子结合前被清除；或是作用于膜受体，通过相应的信号传导途径抑制一氧化氮合酶的活性，从而减少一氧化氮的生成，其确切机制还需进一步研究。
, 百拇医药
[作者简介] 任敏，女，1963年6月出生，副研究员。曾智，男，45岁，心血管内科教授，硕士研究生导师。
参考文献
[1] Russell Ross. The pathagensis of atherosclersis: a perspective for the 1990 S [J]. Nature， 1993, 362: 10
[2] XingY, Li YJ. Endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis and lipid peroxidation in hypercholesterolemic rabbit [J]. Acta Pharmac Sinica， 1996, 12 (2): 149
[3] 陈雪云， 马兴义， 刘传民， 等. 冠心病患者血浆氧化修饰低密度脂蛋白与血清NO的变化及相关性研究 [J]. 临床心血管病杂志， 1999, 15 (2): 72-73
, 百拇医药
[4] Faraci FM. Role of NO in regulation of basilar artery tone in vivo [J]. Am J Physiol， 1990, 259: 1 216-219
[5] Raffacle de Caterina, Peter Libby, Peng HB， et al. Nitric oxide decrease cytokine-induced endothelial activation [J]. J Clin Invest， 1995, 96: 60
1999-12-09收到
2000-05-20修回, http://www.100md.com
单位：任敏(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；曾智(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；梁玉佳(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)；强鸥(华西医科大学附属第一医院内科实验室，四川省成都市 610041)
关键词：脂蛋白， 低密度；脂蛋白， 高密度；豚鼠；内皮细胞；一氧化氮
中国动脉硬化杂志000213[摘 要] 为研究高密度脂蛋白和低密度脂蛋白对动脉内皮细胞一氧化氮合成的影响，以豚鼠动脉内皮细胞为实验对象，用低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及两者以不同剂量混合加入培养基中，每组设置三种剂量，分别于2 h、6 h、12 h和24 h测定一氧化氮含量。结果发现，高密度脂蛋白促进内皮细胞一氧化氮的合成(P>0.05)，与剂量大小无关；低密度脂蛋白显著抑制一氧化氮的合成(P<0.001)，与剂量相关；混合组同样明显抑制其合成，与低密度脂蛋白组比较无显著性差异(P>0.05)，各时间段一氧化氮含量无显著性差异(P>0.05)。结果表明，低密度脂蛋白明显抑制血管内皮细胞一氧化氮合成，且与剂量相关，高密度脂蛋白促进一氧化氮合成，但不能拮抗低密度脂蛋白的作用。
, 百拇医药
[中图分类号] R363.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-02-0134-03
Effects of Low Density Lipoprotein and High Density Lipoprotein on Nitric Oxide Synthesized by Vascular Endothelial Cell
REN Min, ZENG Zhi, LIANG Yu-Jia， and QIANG Ou
(The Laboratory of Internal Medicine of the First Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041， China)
, 百拇医药
ABSTRACT Aim To study nitric oxide (NO) variances after vascular endothial cell were impacted by low density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL). Methods Concentrations of NO in the cultured medium were detected in 2 h, 6 h, 12 h and 24 h after the addition of LDL， HDL and both of them respectively in the guinea pig vasular endothial cell. Results LDL could obviously decrease the NO synthesized by vasular endothial cell with dose depentent (P<0.01)and HDL could arise it (P<0.01), LDL mixed with three levels of HDL expressed the same effection as LDL alone (P>0.05). There was no difference in four time's group (P>0.05). Conclusions NO synthesized by vasular endothial cell will be restrainted by LDL and arisen by HDL but couldn't antagonist the former's.
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MeSH Lipoprotein, LDL； Lipoprotein, HDL； Guinea Pig； Endothelial Cell； Nitric Oxide
低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)增高是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的独立危险因素。天然低密度脂蛋白对动脉内皮细胞没有作用，但它在体内或培养过程中经细胞氧化修饰成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)对动脉内皮细胞的损伤是动脉粥样硬化的始动环节[1]。一氧化氮(nitric oxide, NO)作为一种作用广泛的信息分子，与低密度脂蛋白相互影响,作用于动脉粥样硬化形成的各个环节。文献[2，3]报道,动脉粥样硬化患者及实验性动物均有合成释放一氧化氮功能障碍，但血管内皮细胞经脂蛋白作用后一氧化氮的具体合成变化尚不明了。本文采用豚鼠动脉内皮细胞为实验对象，分别用低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)作用于该细胞，观察24 h内一氧化碳的生成变化。
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1 材料和方法
1.1 动脉内皮细胞培养
无菌条件下取8周龄豚鼠的胸主动脉，将管腔外翻，置于尖底离心管中，用0.1%胶原酶Ⅱ(Sigma 公司)1 mL， 37℃消化20 min，用含20%FCS(国产)的M199培养基(Gibco.BRL)适量终止消化，1 500 r/min×3离心去上清，加2 mL无血清M199，轻轻吹打后用同样方法离心，去上清，最后用20%FCS M199 3 mL将细胞轻轻打成悬液后加入培养瓶内，将培养瓶置于5% CO2孵箱，48 h后换液，约8～10天后可见原代细胞生长，待铺满瓶底后，用0.25%胰酶消化传代培养，5天后将所有细胞消化并收集作试验用，并用免疫细胞化学法作第Ⅷ相关因子鉴定。
1.2 细胞处理
将上述细胞加入24孔板内，使每孔细胞数约为10×104，加入20%FCS M199，细胞贴壁后换液，并将LDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)、HDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)及LDL(200 mg/L)与HDL(200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L)分别混匀加入各孔内，培养基作空白对照，每组设12孔，于加药后2 h、6 h、12 h、24 h分别取培养上清200 μL，-20℃保存。HDL、 LDL由本校载脂蛋白研究室提供，系采用一次性密度梯度超速离心法分离人新鲜全血获得，其中LDL蛋白质定量为2294.5 mg/L，HDL蛋白质定量为6430.3 mg/L。
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1.3 一氧化氮测定
利用硝酸还原酶特异性将培养上清中的NO稳定代谢产物NO-3 还原为NO-2，通过显色反应比色测定NO浓度，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4 统计学处理
实验数据以均数±标准差(
±s)表示，组间两两比较采用方差分析，用SAS软件处理。2 结 果
2.1 细胞鉴定
经第Ⅷ相关因子鉴定，95%的细胞为血管内皮细胞。
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2.2 不同时间细胞上清一氧化氮值
各组内不同时间一氧化氮值无显著性差异(P>0.05)。LDL组一氧化氮值与混合组无显著性差异(P>0.05)，但它们分别与HDL组有显著性差异(P<0.01)。HDL组组内和混合组组内同一时间一氧化氮值无显著性差异(P>0.05)，但LDL 50 mg/L组与200 mg/L和100 mg/L组有显著性差异(P<0.01)。各组与对照组均有显著性差异(P<0.01)。
表1. 各实验组与对照组不同时间点细胞的一氧化氮含量.
Table 1. The nitric oxide values in cultured medium in different times of experiement and control groups (
±s, μmol/L). Groups, 百拇医药
2 h
6 h
12 h
24 h
Control
36.9±6.05
34.39±3.73
37.51±5.11
38.78±5.68
LDL
200 mg/L
3.01±0.76abc
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6.12±1.51abc
6.30±0.87abc
7.51±1.02abc
100 mg/L
5.01±1.28abc
7.1±2.03abc
6.0±1.10abc
8.1±1.26abc
50 mg/L
10.89±1.01ac
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10.68±0.95ac
8.61±1.23ac
11.08±1.47ac
HDL
200 mg/L
60.63±8.91
43.81±7.45a
55.57±6.81a
48.55±7.56a
100 mg/L
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46.92±7.56a
45.02±8.33a
41.23±5.01a
47.54±8.73a
50 mg/L
47.39±7.21a
42.11±8.26a
38.03±7.38a
40.22±1.87a
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LDL+HDL
(200+200) mg/L
6.31±1.65ac
7.55±1.31ac
6.18±2.08ac
11.21±3.27ac
(200+100) mg/L
6.25±2.55ac
6.83±2.70ac
9.30±1.78ac
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10.66±2.34ac
(200+50) mg/L
5.10±1.13ac
6.33±1.45ac
4.78±1.00ac
11.90±3.10ac
a： P<0.01， compared with control group; b： P<0.01， compared with LDL (50 mg/L) group; c： P<0.01, compared with HDL group.
3 讨 论
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一氧化氮作为一种传递介质和调节介质，在心血管系统中除起到松驰血管平滑肌、控制血压外[4]，并有抗氧化，抑制血小板聚集，抗粘附等生理功能[5]。因此，它与低密度脂蛋白互为因果，相互作用，在动脉粥样硬化的病理发展过程中起着重要作用。一氧化氮由细胞中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, 一氧化氮S)合成，血管壁三种主要细胞即血管内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞中都存在 一氧化氮S，均能合成一氧化氮。在高脂血症患者血流中，血浆脂蛋白作为第一信号作用于血管内皮细胞，引起一氧化氮S活性的改变。本实验表明，低密度脂蛋白能显著抑制血管内皮细胞一氧化氮的生成，一氧化氮的减少程度与低密度脂蛋白剂量呈一定程度依赖性，即随着低密度脂蛋白剂量的增加，一氧化氮的生成随之减少，与作用时间无关。这与动脉粥样硬化患者和实验动物血浆一氧化氮减少相吻合[2，3]，说明血管内皮细胞一氧化氮的生成在调节心血管系统功能中起到主导作用。本文同时发现，高密度脂蛋白能明显增加血管内皮细胞一氧化氮的生成，虽与剂量大小无统计学意义，但有随剂量增加一氧化氮合成增加的趋势。据文献报道，高密度脂蛋白有抗低密度脂蛋白氧化修饰作用。本文高密度脂蛋白按不同剂量与低密度脂蛋白混合，共同作用于血管内皮细胞，结果并未像所推测的随着高密度脂蛋白剂量增加一氧化氮合成增加，在此， 高密度脂蛋白不能影响低密度脂蛋白对血管内皮细胞一氧化氮生成的抑制作用。高密度脂蛋白的作用机制可能是将低密度脂蛋白的主要成份胆固醇运送至肝脏分解，而对血管内皮细胞的直接保护作用不明显。至于引起血管内皮细胞一氧化氮生成增加的原因尚不明了，还需进一步实验证实。低密度脂蛋白引起血管内皮细胞一氧化氮减少的具体途径也不很清楚，Minor等报道，高脂血症患者血管内皮细胞一氧化氮合酶的表达及一氧化氮的合成都正常或是增加，但一氧化氮的活性降低可能是一氧化氮在与靶分子结合前被清除；或是作用于膜受体，通过相应的信号传导途径抑制一氧化氮合酶的活性，从而减少一氧化氮的生成，其确切机制还需进一步研究。
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[作者简介] 任敏，女，1963年6月出生，副研究员。曾智，男，45岁，心血管内科教授，硕士研究生导师。
参考文献
[1] Russell Ross. The pathagensis of atherosclersis: a perspective for the 1990 S [J]. Nature， 1993, 362: 10
[2] XingY, Li YJ. Endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis and lipid peroxidation in hypercholesterolemic rabbit [J]. Acta Pharmac Sinica， 1996, 12 (2): 149
[3] 陈雪云， 马兴义， 刘传民， 等. 冠心病患者血浆氧化修饰低密度脂蛋白与血清NO的变化及相关性研究 [J]. 临床心血管病杂志， 1999, 15 (2): 72-73
, 百拇医药
[4] Faraci FM. Role of NO in regulation of basilar artery tone in vivo [J]. Am J Physiol， 1990, 259: 1 216-219
[5] Raffacle de Caterina, Peter Libby, Peng HB， et al. Nitric oxide decrease cytokine-induced endothelial activation [J]. J Clin Invest， 1995, 96: 60
1999-12-09收到
2000-05-20修回, http://www.100md.com