血管内皮生长因子在治疗性血管生成中的应用
作者：罗杰 黄定九
单位：200001 上海市,上海第二医科大学附属仁济医院 心内科
关键词：血管内皮生长因子基因；治疗性血管生成；侧支循环
中国循环杂志000235 摘要 血管内皮生长因子(VEGF)是特异的有丝分裂素,除有促进内皮细胞增生、转移、增加血管通透性和血管生成的作用外,微血管造影证实VEGF可促进侧枝血管的形成。人重组VEGF和VEGF转基因治疗促进缺血模型的治疗性血管生成。VEGF基因还成功地用于严重下肢缺血病人的转基因治疗。
中图分类号:Q291 文献标识码:A
文章编号:1000-614(2000 )02-124-2
治疗性血管生成(Therapeutic angiogenesis)就是用血管生成因子加速和(或)增加侧支动脉的发育来治疗血管狭窄引起的缺血。其前提是血管组织固有的血管生长能力在适当的生长因子影响下可促进新血管的发育。
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1 血管内皮生长因子的作用
血管内皮生长因子(VEGF)是一种肝素结合的二聚体多肽糖蛋白,分子量为45 KD[1],4种异构体VEGF121,VEGF165,VEGF189和VEGF206都是血管内皮细胞特异的有丝分裂素,有促进内皮细胞增生、转移、增加血管通透性和血管生成的作用[2]。VEGF有两种高亲和力的酪氨酸激酶受体FLT-1,FLK-1/KDR。不论是静止的还是增生期的细胞,这些受体只在内皮细胞表达。缺氧时,VEGF受体表达上调,尤其是KDR可上调13倍[3]。
另外,VEGF还改善血液动力学功能,减少对乙酰胆碱的异常收缩反应,增加二磷酸腺苷(ADP)的内皮舒张反应,可增加罂粟碱的血管扩张作用。由于VEGF特异性地作用于内皮细胞,引起内皮细胞增生,对平滑肌细胞(SMCs)和成纤维细胞则无直接有丝分裂作用,故缺血区出现毛细血管密度增加。但在血管造影时发现较大的血管(200 μm～800 μm)的密度也增加,提示血管发生可继发于微血管水平新血管的形成[4]。微血管造影也证实VEGF可促进侧支血管的形成[5]。
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2 重组血管内皮生长因子引起治疗性血管生成
Takeshita[6]等用兔的缺血后肢模型研究人重组VEGF165的治疗性血管生成,缺血局部肌肉注射不同剂量的人重组VEGF165,可见肢体的侧支血管形成增多,灌注压增加,与VEGF的注射剂量成正相关。全身静脉给药也得到同样结果。在狗的慢性心脏缺血模型,向缺血区注入重组VEGF16545 μg,28天后侧支血流增加[7]。
3 血管内皮生长因子基因治疗引起的治疗性血管生成
VEGF基因的外显子1编码的N端分泌信号序列,使其即使在转染率很低的情况下也能通过不断的旁分泌而发挥生物学效应,这与细胞内的蛋白质不同,如bFGF,它需较大的转染率才能有生物学效应[2]。
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动物缺血模型的转VEGF基因治疗:在兔后肢缺模型把含有400 μg裸脱氧核糖核酸(DNA)的水凝胶外衣球囊成形导管送入阻塞动脉的近端,扩张,使裸DNA在特定位置转染髂动脉内膜,造影示侧支血管的发育增加,在信使核糖核酸(mRNA)水平的基因表达可持续21天[8]。在同样模型直接用裸DNA肌肉注射30天后与对照组比较,phVEGF165治疗组侧支血管增多,毛细血管密度增加。在引起血管生成方面编码VEGF121,VEGF165和VEGF189的人cDNA质粒有相同的生物学活性[9]。用编码人VEGF165的缺陷型重组单纯疱疹病毒,感染NIH3T3成纤维细胞,在基质胶悬浮后,注入大鼠皮下,一个星期后在栓子上就有新生血管。用重组的缺陷型腺病毒作载体,注入小鼠皮下组织也感染决定新生血管的周围组织[10]。
微血管造影显示VEGF基因治疗组侧支网络明显广泛,在微血管水平(直径〈100 μm),除了有线性侧支血管外,还有波状的侧支血管。这种波状侧支血管可能是新形成的或者是缺血区原有血管重构产生,对罂粟碱几乎无扩血管反应,而线性侧支可能来自已有血管的功能性开放和(或)扩张。
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VEGF基因治疗的I期临床研究:Isner等[11]用含有phVEGF165的水凝胶外衣球囊成形导管透视下对下肢严重缺血病人进行转基因治疗。两个病人分别接受100 μm和500 μg phVEGF165时,没有反应。1000 μg时5个病人中3个有下肢血流改善,但血管造影没有发现新的侧支血管,原因是新血管增生常发生在180 μm以下的血管,不能在常规造影中发现。第一次常规造影发现有增生血管网是在接受2000 μg phVEGF165的第8个下肢缺血病人。基因治疗后4个星期,DSA造影显示膝部、胫前动脉中部、踝部水平显示侧支血管增生,到12个星期检查时,血管内多普勒血流检查发现静息和最大血流都增加。基因转移一个星期后在右侧足踝区有3个蜘蛛血管瘤,而且右侧肢体有外周水肿,说明治疗获得成功。但基因治疗5个月后病人需行膝下的截肢,没有达到挽救肢体的目的[12]。
Baumgarter等[13]对9例下肢严重缺血的10条肢体进行治疗,其中7条肢体有非愈合性溃疡。每条缺血肢体总共注射phVEGF1654000 μg。治疗后踝肱指数增加,7条肢体造影直接显示新的可见的侧支血管,7个缺血性溃疡中4个愈合或者明显好转,还挽救了3条推荐行膝下截肢的肢体。并发症只限制在6个病人,有短暂的下肢水肿,与VEGF增加血管通透性有关。从而证明了用编码VEGF165的裸质粒DNA肌肉注射能有治疗性血管生成的作用,并证实了基因转移的安全性和可行性。
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4 国内研究状况
周爱儒等[14]首先报告了用基因缝线对下肢缺血大鼠进行肌肉内VEGF基因转移,有效促进血管新生和侧支循环建立。也报道在犬的下肢缺血模型[15],基因转移前3天,肌肉内注射肌肉再生剂布比卡因,并通过基因缝线和直接注射法,向缺血下肢肌肉内转移重组VEGF基因,可见缺血区肌肉组织内VEGF的表达明显高,血管造影可见明显的新生血管和侧支循环的形成。目前国内还未见VEGF基因治疗用于人的文献报道。
5 血管内皮生长因子治疗的潜在副作用[11～13]
促进潜伏的肿瘤生长,肿瘤细胞能分泌VEGF,能增加肿瘤细胞的血液供应,使肿瘤进一步生长。但是以前的实验研究已表明VEGF的表达虽然足够促进生长过程,但不会导致恶性的增生或转移。
理论上VEGF可恶化糖尿病引起的视力减退,但排除I型糖尿病和(或)眼科检查发现糖尿病眼病的病人可减少并发症的危险性。
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促进内膜的增生和动脉粥样斑块新血管形成,理论上VEGF还可增加斑块的通透性,这样有可能引起动脉粥样斑块的不稳定。
总之,VEGF的特异内皮细胞促有丝分裂特性,使其在治疗性血管生成中起到了重要的作用,随着外周严重缺血病人的治疗成功,以及载体和基因导入技术的发展,必将在其它缺血性疾病如冠心病的治疗中发挥重要作用。
作者简介:罗 杰(1965-男 主治医师 博士研究生 主要从事心内科临床工作和心脏 病学的研究
参考文献
1，Connolly DR,Olander JV,Heuvelamn D，et al.Human vascular permeability factor:isolation from U937 cells.J Biol Chem,1989,246:20017—20024.
, 百拇医药
2，Losordo DW,Pickering JG,Takeshita S,et al.Use of the rabbit ear artery to serially assess foreign protein secretion after site specific arterial gene transfer in vivo evidence that anatomic identification of successful gene transfer may underestimate the potential magnitude of transgene expression.Circulation,1994,89:785—792.
3，Brogi E,Schaheman G,Wu T,et al.Hypoxia—induced paracrine regulation of VEGF receptor expression.J Clin Invest，1996，97:469—476.
, http://www.100md.com
4，Takeshita S,Isshiki T,Mori H,et al.Microangiographic assessment of collateral vessel formation following direct gene transfer of vascular endothelial growth factor in rats.Cardiovascular Res,1997,35:547—552.
5，Filkman J.Therapeutic angiogenesis in ischemic limbs(editorial).Circulation,1998,97:1108—1110.
6，Takeshita S,Pu LQ,Stein LA,et al.Intramuscular administration of vascular endothelial growth factor induces dose—dependent collateral artery augment in a rabbit model of chronic limb ischemia.Circulation,1994,90(5pt2):Ⅱ228—Ⅱ234.
, 百拇医药
7，Banai S,Jaklisch MT,Shou M,et al.Angiogenesic—induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs.Circulation,1994,89:2183—2189.
8，Riessen R,Chen D,Blessing E,et al.Arterial gene transfer using pure DNA applied directly to a hydrogel—coated angioplasty balloon.Human Gene Ther,1993,4:749—758.
9，Takeshita S，Tsurumi Y,Couffinahl T,et al.Gene transfer of naked DNA encoding for three isoforms of vascular endothelial growth factor stimulates collateral development in vivo.Lab Invest,1996,75:487—501.
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10，Muhlhause J,Merrill MJ,Pili R,et al.VEGF165 expressed by a replication—deficient recombinant adenovirus vector induces angiogenesis in vivo.Cir Res,1995,77:1077—1086.
11，Isner JM,Walsh K,Symes J,et al.Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease.Circulation,1995,91:2687—2692.
12，Isner JM,Pieczek A,chainfeld R,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of ph VEGF165 in patient with ischemic limb.Lancet,1996,348:370—374.
, 百拇医药
13，Baumgartner I,Pieczek A,Msnor O,et al.Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia.Circulation,1998,97:1114—1123.
14，周爱儒,郑卫,刑德智,等.“分子搭桥术”基因治疗闭塞性血管病的实验研究.中华医学杂志,1996,769:662—666.
15，郑卫,霍勇,刑德智,等.血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究.中华心血管病杂志,1998,26:62—64.
收稿:1999-06-03
修稿:1999-12-06, 百拇医药
单位：200001 上海市,上海第二医科大学附属仁济医院 心内科
关键词：血管内皮生长因子基因；治疗性血管生成；侧支循环
中国循环杂志000235 摘要 血管内皮生长因子(VEGF)是特异的有丝分裂素,除有促进内皮细胞增生、转移、增加血管通透性和血管生成的作用外,微血管造影证实VEGF可促进侧枝血管的形成。人重组VEGF和VEGF转基因治疗促进缺血模型的治疗性血管生成。VEGF基因还成功地用于严重下肢缺血病人的转基因治疗。
中图分类号:Q291 文献标识码:A
文章编号:1000-614(2000 )02-124-2
治疗性血管生成(Therapeutic angiogenesis)就是用血管生成因子加速和(或)增加侧支动脉的发育来治疗血管狭窄引起的缺血。其前提是血管组织固有的血管生长能力在适当的生长因子影响下可促进新血管的发育。
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1 血管内皮生长因子的作用
血管内皮生长因子(VEGF)是一种肝素结合的二聚体多肽糖蛋白,分子量为45 KD[1],4种异构体VEGF121,VEGF165,VEGF189和VEGF206都是血管内皮细胞特异的有丝分裂素,有促进内皮细胞增生、转移、增加血管通透性和血管生成的作用[2]。VEGF有两种高亲和力的酪氨酸激酶受体FLT-1,FLK-1/KDR。不论是静止的还是增生期的细胞,这些受体只在内皮细胞表达。缺氧时,VEGF受体表达上调,尤其是KDR可上调13倍[3]。
另外,VEGF还改善血液动力学功能,减少对乙酰胆碱的异常收缩反应,增加二磷酸腺苷(ADP)的内皮舒张反应,可增加罂粟碱的血管扩张作用。由于VEGF特异性地作用于内皮细胞,引起内皮细胞增生,对平滑肌细胞(SMCs)和成纤维细胞则无直接有丝分裂作用,故缺血区出现毛细血管密度增加。但在血管造影时发现较大的血管(200 μm～800 μm)的密度也增加,提示血管发生可继发于微血管水平新血管的形成[4]。微血管造影也证实VEGF可促进侧支血管的形成[5]。
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2 重组血管内皮生长因子引起治疗性血管生成
Takeshita[6]等用兔的缺血后肢模型研究人重组VEGF165的治疗性血管生成,缺血局部肌肉注射不同剂量的人重组VEGF165,可见肢体的侧支血管形成增多,灌注压增加,与VEGF的注射剂量成正相关。全身静脉给药也得到同样结果。在狗的慢性心脏缺血模型,向缺血区注入重组VEGF16545 μg,28天后侧支血流增加[7]。
3 血管内皮生长因子基因治疗引起的治疗性血管生成
VEGF基因的外显子1编码的N端分泌信号序列,使其即使在转染率很低的情况下也能通过不断的旁分泌而发挥生物学效应,这与细胞内的蛋白质不同,如bFGF,它需较大的转染率才能有生物学效应[2]。
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动物缺血模型的转VEGF基因治疗:在兔后肢缺模型把含有400 μg裸脱氧核糖核酸(DNA)的水凝胶外衣球囊成形导管送入阻塞动脉的近端,扩张,使裸DNA在特定位置转染髂动脉内膜,造影示侧支血管的发育增加,在信使核糖核酸(mRNA)水平的基因表达可持续21天[8]。在同样模型直接用裸DNA肌肉注射30天后与对照组比较,phVEGF165治疗组侧支血管增多,毛细血管密度增加。在引起血管生成方面编码VEGF121,VEGF165和VEGF189的人cDNA质粒有相同的生物学活性[9]。用编码人VEGF165的缺陷型重组单纯疱疹病毒,感染NIH3T3成纤维细胞,在基质胶悬浮后,注入大鼠皮下,一个星期后在栓子上就有新生血管。用重组的缺陷型腺病毒作载体,注入小鼠皮下组织也感染决定新生血管的周围组织[10]。
微血管造影显示VEGF基因治疗组侧支网络明显广泛,在微血管水平(直径〈100 μm),除了有线性侧支血管外,还有波状的侧支血管。这种波状侧支血管可能是新形成的或者是缺血区原有血管重构产生,对罂粟碱几乎无扩血管反应,而线性侧支可能来自已有血管的功能性开放和(或)扩张。
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VEGF基因治疗的I期临床研究:Isner等[11]用含有phVEGF165的水凝胶外衣球囊成形导管透视下对下肢严重缺血病人进行转基因治疗。两个病人分别接受100 μm和500 μg phVEGF165时,没有反应。1000 μg时5个病人中3个有下肢血流改善,但血管造影没有发现新的侧支血管,原因是新血管增生常发生在180 μm以下的血管,不能在常规造影中发现。第一次常规造影发现有增生血管网是在接受2000 μg phVEGF165的第8个下肢缺血病人。基因治疗后4个星期,DSA造影显示膝部、胫前动脉中部、踝部水平显示侧支血管增生,到12个星期检查时,血管内多普勒血流检查发现静息和最大血流都增加。基因转移一个星期后在右侧足踝区有3个蜘蛛血管瘤,而且右侧肢体有外周水肿,说明治疗获得成功。但基因治疗5个月后病人需行膝下的截肢,没有达到挽救肢体的目的[12]。
Baumgarter等[13]对9例下肢严重缺血的10条肢体进行治疗,其中7条肢体有非愈合性溃疡。每条缺血肢体总共注射phVEGF1654000 μg。治疗后踝肱指数增加,7条肢体造影直接显示新的可见的侧支血管,7个缺血性溃疡中4个愈合或者明显好转,还挽救了3条推荐行膝下截肢的肢体。并发症只限制在6个病人,有短暂的下肢水肿,与VEGF增加血管通透性有关。从而证明了用编码VEGF165的裸质粒DNA肌肉注射能有治疗性血管生成的作用,并证实了基因转移的安全性和可行性。
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4 国内研究状况
周爱儒等[14]首先报告了用基因缝线对下肢缺血大鼠进行肌肉内VEGF基因转移,有效促进血管新生和侧支循环建立。也报道在犬的下肢缺血模型[15],基因转移前3天,肌肉内注射肌肉再生剂布比卡因,并通过基因缝线和直接注射法,向缺血下肢肌肉内转移重组VEGF基因,可见缺血区肌肉组织内VEGF的表达明显高,血管造影可见明显的新生血管和侧支循环的形成。目前国内还未见VEGF基因治疗用于人的文献报道。
5 血管内皮生长因子治疗的潜在副作用[11～13]
促进潜伏的肿瘤生长,肿瘤细胞能分泌VEGF,能增加肿瘤细胞的血液供应,使肿瘤进一步生长。但是以前的实验研究已表明VEGF的表达虽然足够促进生长过程,但不会导致恶性的增生或转移。
理论上VEGF可恶化糖尿病引起的视力减退,但排除I型糖尿病和(或)眼科检查发现糖尿病眼病的病人可减少并发症的危险性。
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促进内膜的增生和动脉粥样斑块新血管形成,理论上VEGF还可增加斑块的通透性,这样有可能引起动脉粥样斑块的不稳定。
总之,VEGF的特异内皮细胞促有丝分裂特性,使其在治疗性血管生成中起到了重要的作用,随着外周严重缺血病人的治疗成功,以及载体和基因导入技术的发展,必将在其它缺血性疾病如冠心病的治疗中发挥重要作用。
作者简介:罗 杰(1965-男 主治医师 博士研究生 主要从事心内科临床工作和心脏 病学的研究
参考文献
1，Connolly DR,Olander JV,Heuvelamn D，et al.Human vascular permeability factor:isolation from U937 cells.J Biol Chem,1989,246:20017—20024.
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2，Losordo DW,Pickering JG,Takeshita S,et al.Use of the rabbit ear artery to serially assess foreign protein secretion after site specific arterial gene transfer in vivo evidence that anatomic identification of successful gene transfer may underestimate the potential magnitude of transgene expression.Circulation,1994,89:785—792.
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4，Takeshita S,Isshiki T,Mori H,et al.Microangiographic assessment of collateral vessel formation following direct gene transfer of vascular endothelial growth factor in rats.Cardiovascular Res,1997,35:547—552.
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6，Takeshita S,Pu LQ,Stein LA,et al.Intramuscular administration of vascular endothelial growth factor induces dose—dependent collateral artery augment in a rabbit model of chronic limb ischemia.Circulation,1994,90(5pt2):Ⅱ228—Ⅱ234.
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7，Banai S,Jaklisch MT,Shou M,et al.Angiogenesic—induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs.Circulation,1994,89:2183—2189.
8，Riessen R,Chen D,Blessing E,et al.Arterial gene transfer using pure DNA applied directly to a hydrogel—coated angioplasty balloon.Human Gene Ther,1993,4:749—758.
9，Takeshita S，Tsurumi Y,Couffinahl T,et al.Gene transfer of naked DNA encoding for three isoforms of vascular endothelial growth factor stimulates collateral development in vivo.Lab Invest,1996,75:487—501.
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12，Isner JM,Pieczek A,chainfeld R,et al.Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of ph VEGF165 in patient with ischemic limb.Lancet,1996,348:370—374.
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13，Baumgartner I,Pieczek A,Msnor O,et al.Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia.Circulation,1998,97:1114—1123.
14，周爱儒,郑卫,刑德智,等.“分子搭桥术”基因治疗闭塞性血管病的实验研究.中华医学杂志,1996,769:662—666.
15，郑卫,霍勇,刑德智,等.血管内皮生长因子基因治疗犬闭塞性血管病的初步研究.中华心血管病杂志,1998,26:62—64.
收稿:1999-06-03
修稿:1999-12-06, 百拇医药