单种或多种相关基因突变对血浆同型半胱氨酸水平的影响
作者：许海燕 陈在嘉 杨跃进 陈纪林 张春玲 叶珏 惠汝太 汤健
单位：许海燕 陈在嘉 杨跃进 陈纪林(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血 管病研究所 阜外心血管病医院 冠心病研究室)；张春玲 叶珏 惠汝太(分子 医学中心)；汤健(北京医科大学 心血管病研究所)
关键词：同型半胱氨酸；基因
中国循环杂志000209 摘要
目的：研究同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关酶甲烯四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T和胱硫醚缩合酶(CBS)基因T833C位碱基突变对血浆Hcy水平的影响。
方法：采用多聚酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性技术检测MTHFR C677T基因型，用扩增阻滞突变体系法检测CBS基因T833C多态性，采用高压液相色谱法测定Hcy水平。
, 百拇医药
结果：MTHFR和CBS基因突变者血浆Hcy水平均高于无基因突变者(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，而两者同时存在突变者Hcy水平高于只有一种或均正常的基因型(P<0.05，P<0.01)。
结论：MTHFR基因C677T点突变和CBS基因T833C点突变可能是影响血浆同型半胱氨酸水平的重要遗传因素。
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1000-614(2000)02-083-2
The Effects of Genetic Mutation of Metabolism Related
Enzymes on Plasma Homocysteine Level
, 百拇医药
Xu Haiyan,Chen Zaijia,Tang Jian,et al.
Division of Coronary Heart Disease,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract
Objective:To study the effects of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)C677T and cystathionine β-synthase(CBS) T833C genetic mutation on plasma homocysteine(Hcy) level.
Methods:MTHFR genetic C677T polymorphism was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and CBS T833C polymorphism by amplification refractory mutation system.Plasma Hcy levels were detected by high pressure liquid chromatography.
, 百拇医药
Results:Plasma Hcy levels were markedly higher in cases with MTHFR of CBS genetic mutation than those in cases without mutation(p<0.05，or p<0.01,or p<0.001).Hcy levels increased significantly in cases with both MTHFR and CBS genetic mutations,compared with those with either MTHFR or CBS mutation and without mutation(p<0.05 or p<0.01).
Conclusion:Mutations of MTHFR and CBS gene play the important role in hyperhomocysteinemia.
Key words Homocysteine;Genes
, 百拇医药
(Chinese Circulation Journal,2000,15:83.)
近年来高同型半胱氨酸血症作为动脉粥样硬化和冠心病的新的独立危险因素引起人们关注,而同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在血中蓄积主要是由于甲硫氨酸代谢障碍所致,即代谢相关酶活性降低或辅助因子缺乏。其中甲烯四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)和胱硫醚缩合酶(cystathionine β-synthase,CBS)是其代谢部分相关酶,其基因变异可能是引起酶活性下降的主要原因。目前发现最常见的MTHFR基因突变是C677T点突变,CBS基因突变是T833C位点突变[1]。本研究从MTHFR基因和CBS基因突变探讨对血浆Hcy水平的影响。
1 资料和方法
研究对象 1997年5月～1999年2月期间在我院住院的冠心病患者209例(男184例，女25例)和正常健康体检者101例(男77例，女24例),共310例,平均年龄44.2±10.5岁,均无肝肾及代谢性疾患。
, 百拇医药
实验方法 ①血浆总Hcy水平测定:取静脉血5 ml,加入含0.5 ml 2%依地酸二钠试管,混匀,在半小时内离心,吸取上层血浆,冻存待测。采用高压液相色谱分析法检测血浆总Hcy水平,批内变异为3.5%,批间变异为4.2%。②MTHFR基因C677T突变检测:采用聚合酶链式反应—限制性内切酶片段长度多态性。③CBS基因T833C突变检测:采用扩增阻滞突变体系方法[2]。
统计学分析 数据采用均数±标准差(
±s)表示,样本间比较采用t检验和方差分析,应用微软EXCEL软件处理。
2 结果
MTHFR基因和CBS基因突变对血浆Hcy水平的影响 MTHFR的C677T基因型有3种,即T纯合+/+基因型、杂合+/-基因型、C纯合-/-基因型即野生基因型。MTHFR存在基因突变者无论纯合子突变还是杂合子,血浆Hcy水平均明显高于野生基因型(P<0.001),纯合子Hcy水平高于杂合子Hcy水平(P<0.05)。CBS 833位基因突变,纯合子和杂合子的血浆Hcy水平均明显高于野生基因型(P<0.01)。MTHFR和CBS的纯合子或杂合子之间Hcy水平无明显统计学差异,只有两者野生基因型的Hcy水平之间有轻度统计学差异(P<0.05)。(表1)
, 百拇医药
表1 甲烯四氢叶酸还原酶和胱硫醚缩合酶不同基因型血浆同型半胱氨酸水平比较(±s) 基因
例数
血浆同型半胱氨酸水平(μmol/L)
+/+
+/-
-/-
MTHFR
310
35.10±35.06**△
18.57±19.48**
, 百拇医药
12.32±6.28▲
(n=81)
(n=130)
(n=99)
CBS
310
40.02±28.54*△
22.84±22.27*
16.07±20.86
(n=23)
(n=122)
, 百拇医药
(n=165)
注:与同基因-/-型比较*P<0.01**P<0.001;与同基因+/-型比较△P<0.05;与CBS基因-/-型比较▲P<0.05。MTHFR:甲烯四氢叶酸还原酶 CBS:胱硫醚缩合酶 +/+：纯合基因型 +/-：杂合基因型 -/-：野生基因型 MTHFR基因和CBS基因突变共同对血浆Hcy水平的影响 对MTHFR基因C677T和CBS基因T833C突变进行不同组合的比较,结果显示,MTHFR和CBS基因同时存在突变者比只有一个基因突变者血浆Hcy水平高,纯合子比杂合子Hcy水平升高(P<0.05),比野生基因型者升高更显著(P<0.01)。(表2)
表2 甲烯四氢叶酸还原酶和胱硫醚缩合酶不同基因
型组合血浆同型半胱氨酸水平比较(±s) 血浆同型半胱氨酸水平(μmol/L)
, 百拇医药
胱硫醚缩合
酶基因型
甲烯四氢叶酸还原酶基因型
+/+
+/-
-/-
+/+
53.63±56.98(n=9)
35.56±32.21(n=33)
27.45±29.42(n=39)*
+/-
35.13±34.25(n=9)
, 百拇医药
23.56±22.60(n=51)*
15.25±10.26(n=70)*
-/-
24.96±18.36(n=5)*
13.84±5.80(n=38)*
11.11±2.72(n=56)**
注:与甲烯四氢叶酸还原酶、胱硫醚缩合酶均为+/+基因型者比较*P<0.05 **P<0.01。余注同表1
3 讨论
, http://www.100md.com
Hcy是体内3种含硫氨基酸之一,是甲硫氨酸的中间代谢产物,主要有两条去路,一是经CBS催化与丝氨酸缩合为胱硫醚,后者再裂解为高丝氨酸和半胱氨酸,CBS依赖于磷酸吡哆醇(维生素B6的活性形式),二是经甲硫氨酸合酶催化,以5-甲基四氢叶酸作甲基供体再重新合成甲硫氨酸,而5-甲基四氢叶酸是由5,10-甲烯四氢叶酸在其MTHFR作用下生成,反应过程需要甲基钴胺素(维生素B12的活性形式)为辅助因子。高同型半胱氨酸血症是由于甲硫氨酸代谢障碍所致,原因包括遗传和环境营养两种因素,遗传因素指代谢关键酶CBS、MTHFR和甲硫氨酸合成酶基因发生变异造成酶活性降低,环境营养因素即叶酸、维生素B6、维生素B12缺乏[3]。
MTHFR基因目前已发现了近二十种突变,其中最常见的是C677T点突变,此突变纯合子使MTHFR的酶活性降低50%,杂合子使其降至正常的75%以下,点突变的分布在不同种族、地域、国家的正常人群之间差异较大[4,5]。本结果表明,MTHFR基因碱基发生点突变者血浆Hcy水平明显高于无基因突变者。
, http://www.100md.com
CBS基因从1993年克隆互补脱氧核糖核酸以来,到目前已发现近三十种突变,较为常见的是833位碱基突变,但它与血浆Hcy水平的关系尚不明确[6]。本结果表明,CBS基因T833C突变者血浆Hcy水平明显高于无突变的野生基因型者。
MTHFR基因C677T突变和CBS基因T833C突变对血浆Hcy水平的影响显示两者的纯合子或杂合子之间无明显差异,如果MTHFR基因和CBS基因同时存在突变,将可能会严重影响Hcy代谢,血浆Hcy水平可能会更加升高。本研究发现MTHFR和CBS两者都为基因纯合突变者血浆Hcy水平明显高于两个基因杂合突变者或正常无基因突变者,也明显高于只有一个基因纯合突变者,两种酶均为野生基因型则Hcy水平与文献报道的正常值相近[7]。进一步证实相关酶基因突变导致代谢障碍,从而Hcy血中蓄积,可能促进动脉粥样硬化和冠心病的发生和发展。
作者简介：许海燕(1971-)女 主治医师 博士 主要从事冠心病临床与实验研究
, 百拇医药
参考文献
1 ，Moghadasian MH,McManus BM,Frohlich JJ.Homocysteine and coronary artery disease.Arch Intern Med,1997,157:2299—2308.
2，许海燕,陈在嘉,汤健,等.冠心病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性的研究.中华医学杂志,1999,79:414—416.
3，Ueland per M,Refsum H.Plasma homocysteine,a risk factor for vascular disease:plasma levels in health,disease,and drug therapy.J Lab Clin Med,1989,114:473—501.
4，Frosst P,Blom HJ,Goyette MP,et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase.Nature Genetics,1995,10:111—113.
, http://www.100md.com
5，Jacques PF,Bostom AG,Williams RR,et al.Relation between folate status,a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase,and plasma homocysteine concentrations.Circulation,1996,93:7—9.
6，Tsai MY,Bigell M,Schwichtenberg K,et al.High prevalence of a mutation in the cystathionine β-synthase gene.Am J Hum Genet,1996,59:1262—1267.
7，Jacobsen DW,Gatautis VJ,Green R,et al.Rapid HPLC determination of total homocysteine and other thiols in serum and plasma:sex differences and correlation with cobalamin and folate concentrations in healthy subjects.Clin Chem,1994,40:873—881.
收稿:1999-09-16
修回:2000-02-22, 百拇医药
单位：许海燕 陈在嘉 杨跃进 陈纪林(100037 北京市，中国医学科学院 中国协和医科大学 心血 管病研究所 阜外心血管病医院 冠心病研究室)；张春玲 叶珏 惠汝太(分子 医学中心)；汤健(北京医科大学 心血管病研究所)
关键词：同型半胱氨酸；基因
中国循环杂志000209 摘要
目的：研究同型半胱氨酸(Hcy)代谢相关酶甲烯四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T和胱硫醚缩合酶(CBS)基因T833C位碱基突变对血浆Hcy水平的影响。
方法：采用多聚酶链反应—限制性内切酶片段长度多态性技术检测MTHFR C677T基因型，用扩增阻滞突变体系法检测CBS基因T833C多态性，采用高压液相色谱法测定Hcy水平。
, 百拇医药
结果：MTHFR和CBS基因突变者血浆Hcy水平均高于无基因突变者(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，而两者同时存在突变者Hcy水平高于只有一种或均正常的基因型(P<0.05，P<0.01)。
结论：MTHFR基因C677T点突变和CBS基因T833C点突变可能是影响血浆同型半胱氨酸水平的重要遗传因素。
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1000-614(2000)02-083-2
The Effects of Genetic Mutation of Metabolism Related
Enzymes on Plasma Homocysteine Level
, 百拇医药
Xu Haiyan,Chen Zaijia,Tang Jian,et al.
Division of Coronary Heart Disease,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMS and PUMC,Beijing(100037)
Abstract
Objective:To study the effects of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)C677T and cystathionine β-synthase(CBS) T833C genetic mutation on plasma homocysteine(Hcy) level.
Methods:MTHFR genetic C677T polymorphism was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and CBS T833C polymorphism by amplification refractory mutation system.Plasma Hcy levels were detected by high pressure liquid chromatography.
, 百拇医药
Results:Plasma Hcy levels were markedly higher in cases with MTHFR of CBS genetic mutation than those in cases without mutation(p<0.05，or p<0.01,or p<0.001).Hcy levels increased significantly in cases with both MTHFR and CBS genetic mutations,compared with those with either MTHFR or CBS mutation and without mutation(p<0.05 or p<0.01).
Conclusion:Mutations of MTHFR and CBS gene play the important role in hyperhomocysteinemia.
Key words Homocysteine;Genes
, 百拇医药
(Chinese Circulation Journal,2000,15:83.)
近年来高同型半胱氨酸血症作为动脉粥样硬化和冠心病的新的独立危险因素引起人们关注,而同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在血中蓄积主要是由于甲硫氨酸代谢障碍所致,即代谢相关酶活性降低或辅助因子缺乏。其中甲烯四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)和胱硫醚缩合酶(cystathionine β-synthase,CBS)是其代谢部分相关酶,其基因变异可能是引起酶活性下降的主要原因。目前发现最常见的MTHFR基因突变是C677T点突变,CBS基因突变是T833C位点突变[1]。本研究从MTHFR基因和CBS基因突变探讨对血浆Hcy水平的影响。
1 资料和方法
研究对象 1997年5月～1999年2月期间在我院住院的冠心病患者209例(男184例，女25例)和正常健康体检者101例(男77例，女24例),共310例,平均年龄44.2±10.5岁,均无肝肾及代谢性疾患。
, 百拇医药
实验方法 ①血浆总Hcy水平测定:取静脉血5 ml,加入含0.5 ml 2%依地酸二钠试管,混匀,在半小时内离心,吸取上层血浆,冻存待测。采用高压液相色谱分析法检测血浆总Hcy水平,批内变异为3.5%,批间变异为4.2%。②MTHFR基因C677T突变检测:采用聚合酶链式反应—限制性内切酶片段长度多态性。③CBS基因T833C突变检测:采用扩增阻滞突变体系方法[2]。
统计学分析 数据采用均数±标准差(
±s)表示,样本间比较采用t检验和方差分析,应用微软EXCEL软件处理。2 结果
MTHFR基因和CBS基因突变对血浆Hcy水平的影响 MTHFR的C677T基因型有3种,即T纯合+/+基因型、杂合+/-基因型、C纯合-/-基因型即野生基因型。MTHFR存在基因突变者无论纯合子突变还是杂合子,血浆Hcy水平均明显高于野生基因型(P<0.001),纯合子Hcy水平高于杂合子Hcy水平(P<0.05)。CBS 833位基因突变,纯合子和杂合子的血浆Hcy水平均明显高于野生基因型(P<0.01)。MTHFR和CBS的纯合子或杂合子之间Hcy水平无明显统计学差异,只有两者野生基因型的Hcy水平之间有轻度统计学差异(P<0.05)。(表1)
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表1 甲烯四氢叶酸还原酶和胱硫醚缩合酶不同基因型血浆同型半胱氨酸水平比较(
±s) 基因例数
血浆同型半胱氨酸水平(μmol/L)
+/+
+/-
-/-
MTHFR
310
35.10±35.06**△
18.57±19.48**
, 百拇医药
12.32±6.28▲
(n=81)
(n=130)
(n=99)
CBS
310
40.02±28.54*△
22.84±22.27*
16.07±20.86
(n=23)
(n=122)
, 百拇医药
(n=165)
注:与同基因-/-型比较*P<0.01**P<0.001;与同基因+/-型比较△P<0.05;与CBS基因-/-型比较▲P<0.05。MTHFR:甲烯四氢叶酸还原酶 CBS:胱硫醚缩合酶 +/+：纯合基因型 +/-：杂合基因型 -/-：野生基因型 MTHFR基因和CBS基因突变共同对血浆Hcy水平的影响 对MTHFR基因C677T和CBS基因T833C突变进行不同组合的比较,结果显示,MTHFR和CBS基因同时存在突变者比只有一个基因突变者血浆Hcy水平高,纯合子比杂合子Hcy水平升高(P<0.05),比野生基因型者升高更显著(P<0.01)。(表2)
表2 甲烯四氢叶酸还原酶和胱硫醚缩合酶不同基因
型组合血浆同型半胱氨酸水平比较(
±s) 血浆同型半胱氨酸水平(μmol/L), 百拇医药
胱硫醚缩合
酶基因型
甲烯四氢叶酸还原酶基因型
+/+
+/-
-/-
+/+
53.63±56.98(n=9)
35.56±32.21(n=33)
27.45±29.42(n=39)*
+/-
35.13±34.25(n=9)
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23.56±22.60(n=51)*
15.25±10.26(n=70)*
-/-
24.96±18.36(n=5)*
13.84±5.80(n=38)*
11.11±2.72(n=56)**
注:与甲烯四氢叶酸还原酶、胱硫醚缩合酶均为+/+基因型者比较*P<0.05 **P<0.01。余注同表1
3 讨论
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Hcy是体内3种含硫氨基酸之一,是甲硫氨酸的中间代谢产物,主要有两条去路,一是经CBS催化与丝氨酸缩合为胱硫醚,后者再裂解为高丝氨酸和半胱氨酸,CBS依赖于磷酸吡哆醇(维生素B6的活性形式),二是经甲硫氨酸合酶催化,以5-甲基四氢叶酸作甲基供体再重新合成甲硫氨酸,而5-甲基四氢叶酸是由5,10-甲烯四氢叶酸在其MTHFR作用下生成,反应过程需要甲基钴胺素(维生素B12的活性形式)为辅助因子。高同型半胱氨酸血症是由于甲硫氨酸代谢障碍所致,原因包括遗传和环境营养两种因素,遗传因素指代谢关键酶CBS、MTHFR和甲硫氨酸合成酶基因发生变异造成酶活性降低,环境营养因素即叶酸、维生素B6、维生素B12缺乏[3]。
MTHFR基因目前已发现了近二十种突变,其中最常见的是C677T点突变,此突变纯合子使MTHFR的酶活性降低50%,杂合子使其降至正常的75%以下,点突变的分布在不同种族、地域、国家的正常人群之间差异较大[4,5]。本结果表明,MTHFR基因碱基发生点突变者血浆Hcy水平明显高于无基因突变者。
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CBS基因从1993年克隆互补脱氧核糖核酸以来,到目前已发现近三十种突变,较为常见的是833位碱基突变,但它与血浆Hcy水平的关系尚不明确[6]。本结果表明,CBS基因T833C突变者血浆Hcy水平明显高于无突变的野生基因型者。
MTHFR基因C677T突变和CBS基因T833C突变对血浆Hcy水平的影响显示两者的纯合子或杂合子之间无明显差异,如果MTHFR基因和CBS基因同时存在突变,将可能会严重影响Hcy代谢,血浆Hcy水平可能会更加升高。本研究发现MTHFR和CBS两者都为基因纯合突变者血浆Hcy水平明显高于两个基因杂合突变者或正常无基因突变者,也明显高于只有一个基因纯合突变者,两种酶均为野生基因型则Hcy水平与文献报道的正常值相近[7]。进一步证实相关酶基因突变导致代谢障碍,从而Hcy血中蓄积,可能促进动脉粥样硬化和冠心病的发生和发展。
作者简介：许海燕(1971-)女 主治医师 博士 主要从事冠心病临床与实验研究
, 百拇医药
参考文献
1 ，Moghadasian MH,McManus BM,Frohlich JJ.Homocysteine and coronary artery disease.Arch Intern Med,1997,157:2299—2308.
2，许海燕,陈在嘉,汤健,等.冠心病患者同型半胱氨酸代谢相关酶基因多态性的研究.中华医学杂志,1999,79:414—416.
3，Ueland per M,Refsum H.Plasma homocysteine,a risk factor for vascular disease:plasma levels in health,disease,and drug therapy.J Lab Clin Med,1989,114:473—501.
4，Frosst P,Blom HJ,Goyette MP,et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase.Nature Genetics,1995,10:111—113.
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5，Jacques PF,Bostom AG,Williams RR,et al.Relation between folate status,a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase,and plasma homocysteine concentrations.Circulation,1996,93:7—9.
6，Tsai MY,Bigell M,Schwichtenberg K,et al.High prevalence of a mutation in the cystathionine β-synthase gene.Am J Hum Genet,1996,59:1262—1267.
7，Jacobsen DW,Gatautis VJ,Green R,et al.Rapid HPLC determination of total homocysteine and other thiols in serum and plasma:sex differences and correlation with cobalamin and folate concentrations in healthy subjects.Clin Chem,1994,40:873—881.
收稿:1999-09-16
修回:2000-02-22, 百拇医药