粉防己碱对缺氧和复氧损伤心室肌细胞内Ca2+超载的作用
作者：祝武强 曾秋棠 曹林生 张桂清
单位：祝武强(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；曾秋棠(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；曹林生(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；张桂清(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))
关键词：心肌再灌注损伤；粉防己碱；维拉帕米；Ca2+超载
临床心血管病杂志000215 摘 要：目的：研究粉防己碱(Tet)对培养大鼠心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载的作用。方法：采用荧光探针Fura-2/AM结合计算机图像处理技术测定单个心室肌细胞内Ca2+浓度。结果：对照组心室肌细胞在缺氧和复氧过程中出现2次细胞内Ca2+浓度明显上升，维拉帕米(Ver)处理组(10 μmol/L)心室肌细胞出现2次细胞内Ca2+浓度轻度上升；Tet处理组(300 μmol/L)心室肌细胞未出现细胞内Ca2+浓度上升。两处理组分别与对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)，两处理组间比较亦有显著性差异(P<0.05)。结论：Tet对缺氧和复氧损伤心室肌细胞内Ca2+超载有较强的阻抑作用。
, http://www.100md.com
Effect of tetrandrine on intracelluar Ca2+ overload of cultured rat cardiomyocytes during hypoxia and reoxygenation
ZHU Wu-qiang ZEN Qiu-tang CAO Lin-sheng ZHANG Gui-qing
(Institute of Cardiovascular Disease,Union Hospital,Tongji
Medical University,Wuhan 430022)
Abstract：Objective:To study the effect of tetrandrine (Tet) on intracelluar Ca2+ overload of cultured rat cardiomyocytes.Method:Fluorescent probes combined with digital image processing technique were used to measure free Ca2+ concentration in a cardiomyocyte.Result:Free Ca2+ concentration in cardiomyocytes rose obviously during hypoxia and reoxygenation in control group,while it rose slightly in verapamil group (verapamil concentration 10 μmol/L),and didn′t change in Tet group (Tet concentration 300 μmol/L).Conclusion:Tet could inhibit Ca2+ overload of cardiomyocytes remarkably during hypoxia and reoxygenation.
, 百拇医药
Key words：Myocardial reperfusion injury Tetrandrine Verapamil Ca2+ overload
粉防己碱(Tet)具有阻滞细胞膜Ca2+通道及阻抑肌浆网Ca2+释放作用〔1〕。本实验以培养大鼠的心室肌细胞制成缺氧和缺氧复氧的模型(此模型类似于在体的心脏缺血、再灌注损伤模型)，应用荧光探针Fura-2/AM结合计算机图像处理技术，观察Tet对损伤心室肌细胞内Ca2+超载的作用，试图阐明Tet对缺氧复氧损伤心脏是否具有保护作用及其机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新生SD大鼠购自同济医科大学实验动物学部，胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ为Sigma产品。Fura-2/AM购自中国医学科学院药物所。维拉帕米(Ver)系德国基诺药厂生产，Tet系渐江金华制药厂生产。
, 百拇医药
实验分3组：①对照组(Con)4只；②Ver处理组5只：缺氧实验前向平皿中加入Ver(最终浓度10 μmol/L)；③Tet处理组4只：缺氧实验前向平皿中加入Tet(最终浓度300 μmol/L)。3组均取缺氧前，缺氧5、10、20、30 min及复氧1、5、10、20、30 min时细胞内Ca2+浓度数值，进行统计学处理。
1.2 方法
1.2.1 心室肌细胞培养〔2〕：1～3 d龄SD大鼠，雌雄不拘。处死，开胸取出心脏，剪碎心室肌，经消化(0.125%胰蛋白酶加0.0125%胶原酶Ⅰ)得到单个心室肌细胞，置于RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清，Gibco产品)中，计数后按1×105细胞/孔接种于37℃24孔培养板，5% CO2条件培养。72 h后，取活性较好的细胞继续下步实验。
1.2.2 Fura-2/AM负载〔3〕：从培养板中取出玻片，置于Epc-9光电联合检测系统(HEKA Electronic，德国产)专用平皿中。使细胞与溶于DMSO中的Fura-2/AM(最终浓度5 μmol/L)在37℃避光条件下共同孵育30 min。
, 百拇医药
1.2.3 缺氧和复氧〔4〕：塑料封口膜封住平皿口，自制多孔塑料管伸入平皿，通入95% N2、5% CO2混合气以造成细胞缺氧(PO2<2.7 kPa)，缺氧时间为30 min。经缺氧实验后，向平皿中通入95% O2、5% CO2混合气，复氧时间为30 min。
1.2.4 单个心室肌细胞内Ca2+浓度测定：Epc-9光电联合检测系统在40×物镜下确定单个细胞位置，用340 nm波长激发，500 nm波长处可探测到荧光发射，Fura-2结合Ca2+后荧光强度可指示细胞内Ca2+浓度相对变化。Ca2+荧光图像经计算机处理后输出细胞内Ca2+浓度随时间变化曲线。
1.3 统计学处理
, 百拇医药
计数资料以
±s表示。实验结果用SAS统计分析软件包作方差分析(SNK检验)。
2 结果
3组心室肌细胞在缺氧、复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化见表1。
表1 3组于缺氧和复氧不同时点心室肌细胞内Ca2+浓度变化 nmol/L,±s 时间(min)
Con组
Ver组
Tet组
, 百拇医药 缺
氧
0
393.13±115.65
368.50±73.051)
454.25±24.581)2)
5
444.85±85.58
384.13±83.681)
453.43±23.611)2)
10
, 百拇医药
474.44±89.87
387.12±81.771)
452.73±23.931)2)
20
486.17±134.40
386.38±78.591)
450.54±24.131)2)
30
488.44±153.13
405.10±79.771)
, 百拇医药
457.00±24.221)2)
复
氧
1
488.07±151.97
407.45±79.071)
456.10±24.801)2)
5
495.06±142.88
415.88±79.771)
453.24±23.291)2)
, http://www.100md.com
10
495.64±119.52
417.07±75.991)
454.03±26.841)2)
20
492.00±76.80
407.09±65.161)
454.28±25.941)2)
30
545.89±121.31
, http://www.100md.com
409.87±65.671)
454.51±26.891)2)
与Con组相比1)P<0.01；与Ver组相比2)P<0.05
3组心室肌细胞在缺氧、复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化曲线见图1。
图1 心室肌细胞在缺氧和复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化曲线
3 讨论
本文采用Epc-9光电联合检测系统，直接测定单个心肌细胞内Ca2+浓度，且可通过计算机连续记录，测量结果比传统的分光光度计和液体闪烁计数仪更准确。
, 百拇医药
国外报道Tet能抑制培养的幼鼠心室肌细胞Ca2+通道电流〔5〕。本实验证明，Tet和Ver对培养大鼠的心室肌细胞在缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载均有显著抑制作用，而Tet作用更强。
Tet对培养大鼠心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载抑制作用机制目前推测与以下作用有关：①阻滞细胞膜Ca2+通道〔1，5〕；②清除自由基、抗脂质过氧化作用和保护线粒体功能〔6〕；③稳定生物膜，维持细胞完整性和保持细胞内能源物质〔7〕。
综上所述，心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载机制是多方面的，而Tet是一种具有一定临床应用前景的阻抑Ca2+超载的药物。
参考文献：
, 百拇医药
1 方达超，江明性.粉防己碱抗钙作用的研究.中华医学杂志，1983，63：772～774
2 Toroe Y N,Kiyoshi G,Tadashi O,et al.Contractile and morphological impairment of cultured fetal mouse myocytes induced by oxygen radicals and oxidants.Circ Res,1993,73:758～770
3 熊鹰，随建峰，张长城.Fura-2荧光探针测定突触体胞浆游离Ca2+浓度.第三军医大学学报，1995，17：345～346
4 Lakatta E G,Nayler W G,Poole-Wilson P A.Calcium overload and mechanical function in posthypoxic myocardium:Biphasic of PH during hypoxia.Eur J Cardiol,1979,10:77～87
, 百拇医药
5 Liu Q Y,Karpinski E,Pang P K T.Tetrandrine inhibits both T and L calcium channel currents in ventricular cells.J Cardiovasc Pharmacol,1992,20:513～519
6 任佐军，曾定尹，章新华，等.粉防己碱对家兔实验性心肌缺血及再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1995，9：303～304
7 李庆平，杨解人，饶曼人.预先给予粉防己碱对大鼠工作心脏缺血再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1994，8：114～118
收稿日期：1998-11-24
修稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com
单位：祝武强(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；曾秋棠(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；曹林生(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))；张桂清(同济医科大学心血管病研究所 同济医科大学附属协和医院心内科(武汉，430022))
关键词：心肌再灌注损伤；粉防己碱；维拉帕米；Ca2+超载
临床心血管病杂志000215 摘 要：目的：研究粉防己碱(Tet)对培养大鼠心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载的作用。方法：采用荧光探针Fura-2/AM结合计算机图像处理技术测定单个心室肌细胞内Ca2+浓度。结果：对照组心室肌细胞在缺氧和复氧过程中出现2次细胞内Ca2+浓度明显上升，维拉帕米(Ver)处理组(10 μmol/L)心室肌细胞出现2次细胞内Ca2+浓度轻度上升；Tet处理组(300 μmol/L)心室肌细胞未出现细胞内Ca2+浓度上升。两处理组分别与对照组比较均有极显著性差异(P<0.01)，两处理组间比较亦有显著性差异(P<0.05)。结论：Tet对缺氧和复氧损伤心室肌细胞内Ca2+超载有较强的阻抑作用。
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Effect of tetrandrine on intracelluar Ca2+ overload of cultured rat cardiomyocytes during hypoxia and reoxygenation
ZHU Wu-qiang ZEN Qiu-tang CAO Lin-sheng ZHANG Gui-qing
(Institute of Cardiovascular Disease,Union Hospital,Tongji
Medical University,Wuhan 430022)
Abstract：Objective:To study the effect of tetrandrine (Tet) on intracelluar Ca2+ overload of cultured rat cardiomyocytes.Method:Fluorescent probes combined with digital image processing technique were used to measure free Ca2+ concentration in a cardiomyocyte.Result:Free Ca2+ concentration in cardiomyocytes rose obviously during hypoxia and reoxygenation in control group,while it rose slightly in verapamil group (verapamil concentration 10 μmol/L),and didn′t change in Tet group (Tet concentration 300 μmol/L).Conclusion:Tet could inhibit Ca2+ overload of cardiomyocytes remarkably during hypoxia and reoxygenation.
, 百拇医药
Key words：Myocardial reperfusion injury Tetrandrine Verapamil Ca2+ overload
粉防己碱(Tet)具有阻滞细胞膜Ca2+通道及阻抑肌浆网Ca2+释放作用〔1〕。本实验以培养大鼠的心室肌细胞制成缺氧和缺氧复氧的模型(此模型类似于在体的心脏缺血、再灌注损伤模型)，应用荧光探针Fura-2/AM结合计算机图像处理技术，观察Tet对损伤心室肌细胞内Ca2+超载的作用，试图阐明Tet对缺氧复氧损伤心脏是否具有保护作用及其机制，为临床用药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
新生SD大鼠购自同济医科大学实验动物学部，胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ为Sigma产品。Fura-2/AM购自中国医学科学院药物所。维拉帕米(Ver)系德国基诺药厂生产，Tet系渐江金华制药厂生产。
, 百拇医药
实验分3组：①对照组(Con)4只；②Ver处理组5只：缺氧实验前向平皿中加入Ver(最终浓度10 μmol/L)；③Tet处理组4只：缺氧实验前向平皿中加入Tet(最终浓度300 μmol/L)。3组均取缺氧前，缺氧5、10、20、30 min及复氧1、5、10、20、30 min时细胞内Ca2+浓度数值，进行统计学处理。
1.2 方法
1.2.1 心室肌细胞培养〔2〕：1～3 d龄SD大鼠，雌雄不拘。处死，开胸取出心脏，剪碎心室肌，经消化(0.125%胰蛋白酶加0.0125%胶原酶Ⅰ)得到单个心室肌细胞，置于RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清，Gibco产品)中，计数后按1×105细胞/孔接种于37℃24孔培养板，5% CO2条件培养。72 h后，取活性较好的细胞继续下步实验。
1.2.2 Fura-2/AM负载〔3〕：从培养板中取出玻片，置于Epc-9光电联合检测系统(HEKA Electronic，德国产)专用平皿中。使细胞与溶于DMSO中的Fura-2/AM(最终浓度5 μmol/L)在37℃避光条件下共同孵育30 min。
, 百拇医药
1.2.3 缺氧和复氧〔4〕：塑料封口膜封住平皿口，自制多孔塑料管伸入平皿，通入95% N2、5% CO2混合气以造成细胞缺氧(PO2<2.7 kPa)，缺氧时间为30 min。经缺氧实验后，向平皿中通入95% O2、5% CO2混合气，复氧时间为30 min。
1.2.4 单个心室肌细胞内Ca2+浓度测定：Epc-9光电联合检测系统在40×物镜下确定单个细胞位置，用340 nm波长激发，500 nm波长处可探测到荧光发射，Fura-2结合Ca2+后荧光强度可指示细胞内Ca2+浓度相对变化。Ca2+荧光图像经计算机处理后输出细胞内Ca2+浓度随时间变化曲线。
1.3 统计学处理
, 百拇医药
计数资料以
±s表示。实验结果用SAS统计分析软件包作方差分析(SNK检验)。2 结果
3组心室肌细胞在缺氧、复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化见表1。
表1 3组于缺氧和复氧不同时点心室肌细胞内Ca2+浓度变化 nmol/L,
±s 时间(min)Con组
Ver组
Tet组
, 百拇医药 缺
氧
0
393.13±115.65
368.50±73.051)
454.25±24.581)2)
5
444.85±85.58
384.13±83.681)
453.43±23.611)2)
10
, 百拇医药
474.44±89.87
387.12±81.771)
452.73±23.931)2)
20
486.17±134.40
386.38±78.591)
450.54±24.131)2)
30
488.44±153.13
405.10±79.771)
, 百拇医药
457.00±24.221)2)
复
氧
1
488.07±151.97
407.45±79.071)
456.10±24.801)2)
5
495.06±142.88
415.88±79.771)
453.24±23.291)2)
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10
495.64±119.52
417.07±75.991)
454.03±26.841)2)
20
492.00±76.80
407.09±65.161)
454.28±25.941)2)
30
545.89±121.31
, http://www.100md.com
409.87±65.671)
454.51±26.891)2)
与Con组相比1)P<0.01；与Ver组相比2)P<0.05
3组心室肌细胞在缺氧、复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化曲线见图1。
图1 心室肌细胞在缺氧和复氧不同时点细胞内Ca2+浓度变化曲线3 讨论
本文采用Epc-9光电联合检测系统，直接测定单个心肌细胞内Ca2+浓度，且可通过计算机连续记录，测量结果比传统的分光光度计和液体闪烁计数仪更准确。
, 百拇医药
国外报道Tet能抑制培养的幼鼠心室肌细胞Ca2+通道电流〔5〕。本实验证明，Tet和Ver对培养大鼠的心室肌细胞在缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载均有显著抑制作用，而Tet作用更强。
Tet对培养大鼠心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载抑制作用机制目前推测与以下作用有关：①阻滞细胞膜Ca2+通道〔1，5〕；②清除自由基、抗脂质过氧化作用和保护线粒体功能〔6〕；③稳定生物膜，维持细胞完整性和保持细胞内能源物质〔7〕。
综上所述，心室肌细胞缺氧和复氧损伤时细胞内Ca2+超载机制是多方面的，而Tet是一种具有一定临床应用前景的阻抑Ca2+超载的药物。
参考文献：
, 百拇医药
1 方达超，江明性.粉防己碱抗钙作用的研究.中华医学杂志，1983，63：772～774
2 Toroe Y N,Kiyoshi G,Tadashi O,et al.Contractile and morphological impairment of cultured fetal mouse myocytes induced by oxygen radicals and oxidants.Circ Res,1993,73:758～770
3 熊鹰，随建峰，张长城.Fura-2荧光探针测定突触体胞浆游离Ca2+浓度.第三军医大学学报，1995，17：345～346
4 Lakatta E G,Nayler W G,Poole-Wilson P A.Calcium overload and mechanical function in posthypoxic myocardium:Biphasic of PH during hypoxia.Eur J Cardiol,1979,10:77～87
, 百拇医药
5 Liu Q Y,Karpinski E,Pang P K T.Tetrandrine inhibits both T and L calcium channel currents in ventricular cells.J Cardiovasc Pharmacol,1992,20:513～519
6 任佐军，曾定尹，章新华，等.粉防己碱对家兔实验性心肌缺血及再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1995，9：303～304
7 李庆平，杨解人，饶曼人.预先给予粉防己碱对大鼠工作心脏缺血再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1994，8：114～118
收稿日期：1998-11-24
修稿日期：1999-03-26, http://www.100md.com