北方汉族Grave病与HLA相关性研究
作者：鲁梅花 邵文硕
单位：(首都医科大学宣武医院内分泌科)
关键词：Grave病；组织相容性白细胞抗原(HLA)；多聚酶链反应(PCR)；序列特异性寡核苷酸引物(SSP)
首都医科大学学报000210 提要： 利用序列特异性寡核苷酸引物多聚酶链反应(PCR/SSP)的方法，对北方汉族42例Grave病患者及52 例正常对照组的HLA-DR2 、DR3的分布频率进行了分析。结果：Grave病患者组HLA-DR3抗原的频率明显高于正常对照组(P<0.05)，相对危险度为3.84，而HLA-DR2抗原的频率在2组间无明显差异(P>0.05)。提示：HLA-DR3与北方汉族Grave病的发病有相关性。
中图分类号： R581.1
The Study of Grave Disease Associated
, 百拇医药
with HLA in Northern Han Chinese
Lu Meihua Shao Wenshuo
(Department of endocrine, Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: 42 Northern Han Chinese patients with Grave disease and 52 healthy controls were randomly chosen. Ploymerase chain reaction and sequence specific primer (PCR/SSP) were used to determine the frequency of HLA-DR2 and DR3. The frequency of DR3 was increased in Grave disease patients, the relative risk (RR) was 3.84(P<0.05). The RR of DR2 was 1.16(P>0.05). The above results suggested that HLA-DR3 is associated with Grave disease in Northern Han Chinese.
, 百拇医药
Key words: Grave disease; HLA; PCR; SSP
Grave病(弥漫性毒性甲状腺肿)是1种伴甲状腺激素(TH)分泌增高的器官特异性自身免疫性疾病。临床上以甲状腺肿大、高代谢症状伴突眼为特征。通过对Grave病患者的家系分析，发现Grave病有遗传倾向，而近年来多项研究显示，Grave病的发病与组织相容性白细胞抗原(HLA)的某些位点相关联[1～4]。HLA是1组紧密相关抗原的总称，根据它们之间个别氨基酸的差异，可分为若干亚型[5]。本研究采用PCR/SSP(多聚酶链反应/序列特异性寡核苷酸引物)方法对北方汉族Grave病患者及正常人群进行了HLA分型，研究北方汉族Grave病患者及正常人群的DR2、DR3的分布频率，旨在从免疫遗传学角度分析Grave病患者的可能发病机制。
1 材料和方法
选择1995年9月至1999年12月在我院就诊的无血缘关系的Grave病患者42例为Graves组。42例患者均为北方汉族人，其中男8人，女34人，年龄22～55岁。
, 百拇医药
选择同期无血缘关系的北方汉族健康志愿者52例作为对照组，其中男30人，女22人，年龄25～57岁。
引物：根据第12届国际组织不相容工作专题会议(IHWC)的标准，对HLA-DR基因进行组特异性扩增。所用引物均由北京红十字血液中心提供。
实验方法：①DNA提取(采用第12届IHWC推荐的盐析法)：分离白细胞，于离心沉淀的白细胞中加入：160 μL 5×蛋白酶K缓冲液、40 μL蛋白酶K溶液(10 g/L双蒸水溶解)、40 μL 20% SDS(十二烷基硫酸钠)、300 μL双蒸水(反应总体积800 μL)，转移至1.5 mL管中，于55 ℃轻摇孵育2～4 h，并于1 h后再加入20 μL蛋白酶K，于室温下放凉。 加入200 μL 6 mol/L NaCl，用力振荡15～30 s后13 000 r/min离心10 min，析出蛋白。取上清于另一1.5 mL试管13 000 r/min离心5～10 min，重复此步骤至上清液清亮透明。将此上清液分装于2个1.5 mL试管内(各450 μL)，加入2倍无水乙醇(室温)使DNA析出，将析出的DNA转移至另一1.5 mL试管内，加入70%乙醇脱盐。13 000 r/min，离心5 min，离下DNA弃去乙醇，空气干燥。用Tris和EDTE(TE)溶液(或双蒸水)于4 ℃下溶解DNA并稀释至1～2 g/ L。②采用PCR/SSP方法对样本进行HLA-DR2及DR3组特异性扩增：引起HLA-DR多态性产生的氨基酸差异主要发生在 β链。从氨基酸分析结果来看，氨基酸的变异主要集中在β1区，此区主要由DRB基因的第2外显子编码。选择超可变区的部分保守序列为模板，使用DNA合成仪人工合成相对应的引物。在0.5 mL Eppenorf 管中加入：模板DNA 1 μg、10×PCR缓冲液5 μL(2.5 mmol/L MgCl2)、10×脱氧核苷二磷酸腺苷(dNTP，2 mmol/L)5 μL、HLA-DR2、DR3序列特异性寡核苷酸引物1对、多肽酶2 U，消毒双蒸水补至50 μL。短暂离心后，96 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s→60 ℃退火40s→72 ℃延伸1 min，循环30周，72 ℃延伸10 min。③扩增产物的检测：1.5%琼脂糖电泳，电压50 V，电泳30～60 min，EB染色，紫外灯下观察。每次加样时均加入阳性标准参照标本，扩增产物保存在-20 ℃环境中，如长期保存，应储存于-80 ℃冰箱内。
, 百拇医药
统计学方法：
1)先计算各组不同的HLA-DR2及DR3的分布频率，然后使用Woolf方法计算相对危险度(relative risk, RR)
式中Pd为患者组抗原(基因)频率，Pc为对照组抗原(基因)频率。或根据直接代入各组的实际观察数值计算RR。
n1+代表抗原(基因)阳性病人数，n1-代表抗原(基因)阴性病人数，n2+代表抗原(基因)阳性对照组数，n2-代表抗原(基因)阴性对照组数。
, 百拇医药
2)Grave病组及对照组HLA-DR2及DR3抗原阳性率的差异用χ2检验和Yates连续校正公式判定。
2 结果
用序列特异性寡核苷酸引物多聚酶链式反应扩增样本，HLA-DR2组特异性扩增产物为206 bp，HLA-DR3组特异性扩增产物为221 bp。
10例(23.8%)Grave病患者有HLA-DR2特异性扩增产物，正常对照组中11例(17.3%)有HLA-DR2特异性扩增产物，2组比较无明显差异(P>0.05)，RR(HLA-DR2)=1.16。8例(19.0%)Grave病患者有HLA-DR3特异性扩增产物，正常对照组中3例(5.8%)有HLA-DR3特异性扩增产物，Grave病组HLA-DR3抗原的频率明显高于正常对照组(P<0.05)，RR(HLA-DR3)=3.84。
3 讨论
, 百拇医药
多组研究表明，Grave病与HLA的某些位点相关，HLA-DR3在西欧及印度Grave病发病人群中升高且统计结果有显著性差异。HLA-DR3阳性病例伴重度Grave病、突眼及复发的病例也增多。然而，HLA与Grave病的易感性在不同种族中也有不同，如在希腊Grave病发病人群中HLA-DRB11601(HLA-DR2的1个亚型)明显升高[1～4]。
本研究显示：HLA-DR3在北方汉族Grave病患者中的比例明显升高(P<0.05)，而DR2的比例与对照组大致相同。表明HLA-DR3与北方汉族Grave病的发病具有相关性。
近年来随着生物学技术的进步及对主要组织相容复合物(MHC)分子功能的深入研究，人们对HLAⅡ类抗原与疾病的关系有了进一步的认识，特别是对IDDM(胰岛素依赖性糖尿病)的研究，为搞清HLA在自身免疫性疾病发病中的作用提供了很好的范例，也有助于我们理解HLA 的某些抗原分子在Grave病发病中的作用。目前我们认为可能的机制有：①HLA分子对一些导致Grave病的自身抗原及病毒抗原肽的优先结合及呈递[6～9]。②易感基因与抵抗基因竞争与致病的多肽结合是一些自身免疫性疾病的发病基础，抵抗基因与这些多肽的结合导致的免疫反应，防止了易感基因与这些多肽的结合,在Grave病患者是否如此有待考证[10]。③近年来对启动子Ybox的研究显示其多态性改变与疾病易感性之间存在很强的关联。④非HLA基因的作用及环境因素的影响：虽然HLA在一些疾病中显示与遗传易感性强相关，但许多非HLA基因及环境因素起了很大作用，在这些疾病中特定HLA基因并不是发病所必需的，提示还有很多除HLA易感基因以外的因素参与发病[11]。HLA分子在Grave病的发病中具体是通过以上哪种机制作用的，目前尚难肯定，而方法学的进步显然是至关重要的,相信随着生物学技术的进步，我们将最终搞清HLA与Grave病的关系。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Semana G, Allanic H. Implication of the HLA DRB3 genes in Graves′ disease: Predominance of allele Dw24. Hum Immunol, 1990,29:143～149
2，Farid N, Thompson C. HLA and autoimmune endocrine disease. Mol Biol Med, 1985,3:85～97
3，Ratanachaiyavong S, Lloyd L, Dark C, et al. MHC extended haplotypes in families of patients with Graves′ disease. Hum Immunol, 1993,36:99～111
, 百拇医药
4，Badenhoop K, Schleusener H. Immunogenetics of endocrine ophtalmopathy and Graves′ disease. Dev Ophthalmol, 1993,25:11～19
5，John Lee. The HLA system. New York: Springer-Verlag New York Incomprated, 1991
6，Wucherpfennig K W,Strominger J L. Selective binding of self peptide to disease-associated major histocompatibility complex(MHC)molecules: A mechanism for MHC-linked susceptibility to human autoimmune disease.J Exp Med,1995,181:1597～1601
, 百拇医药
7，Rammensee H G, Friede T. MHC ligands and peptide motifs first listing. Immunogenetics,1995,41:178～228
8，Stern L J. Crystal structure of human class II MHC protein HLA DR1 complexed with an influenza virus peptide. Nature, 1994,386:215～223
9，Kwok W W, Nepom G T. HLA-DQ polymorphisms are highly selective for peptide binding interactions. Immunology, 1996,156:2171～2177
10，Nepom G T. A unified hypothesis for the complex genetics of HLA associations with IDDM. Diabetes, 1990,39:1153～1157
11，Thorby E. HLA-associated disease susceptibility, which genes are primarily involved? Immunologist, 1995,3:51～58
收稿日期：1999-06-20, http://www.100md.com
单位：(首都医科大学宣武医院内分泌科)
关键词：Grave病；组织相容性白细胞抗原(HLA)；多聚酶链反应(PCR)；序列特异性寡核苷酸引物(SSP)
首都医科大学学报000210 提要： 利用序列特异性寡核苷酸引物多聚酶链反应(PCR/SSP)的方法，对北方汉族42例Grave病患者及52 例正常对照组的HLA-DR2 、DR3的分布频率进行了分析。结果：Grave病患者组HLA-DR3抗原的频率明显高于正常对照组(P<0.05)，相对危险度为3.84，而HLA-DR2抗原的频率在2组间无明显差异(P>0.05)。提示：HLA-DR3与北方汉族Grave病的发病有相关性。
中图分类号： R581.1
The Study of Grave Disease Associated
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with HLA in Northern Han Chinese
Lu Meihua Shao Wenshuo
(Department of endocrine, Xuanwu Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: 42 Northern Han Chinese patients with Grave disease and 52 healthy controls were randomly chosen. Ploymerase chain reaction and sequence specific primer (PCR/SSP) were used to determine the frequency of HLA-DR2 and DR3. The frequency of DR3 was increased in Grave disease patients, the relative risk (RR) was 3.84(P<0.05). The RR of DR2 was 1.16(P>0.05). The above results suggested that HLA-DR3 is associated with Grave disease in Northern Han Chinese.
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Key words: Grave disease; HLA; PCR; SSP
Grave病(弥漫性毒性甲状腺肿)是1种伴甲状腺激素(TH)分泌增高的器官特异性自身免疫性疾病。临床上以甲状腺肿大、高代谢症状伴突眼为特征。通过对Grave病患者的家系分析，发现Grave病有遗传倾向，而近年来多项研究显示，Grave病的发病与组织相容性白细胞抗原(HLA)的某些位点相关联[1～4]。HLA是1组紧密相关抗原的总称，根据它们之间个别氨基酸的差异，可分为若干亚型[5]。本研究采用PCR/SSP(多聚酶链反应/序列特异性寡核苷酸引物)方法对北方汉族Grave病患者及正常人群进行了HLA分型，研究北方汉族Grave病患者及正常人群的DR2、DR3的分布频率，旨在从免疫遗传学角度分析Grave病患者的可能发病机制。
1 材料和方法
选择1995年9月至1999年12月在我院就诊的无血缘关系的Grave病患者42例为Graves组。42例患者均为北方汉族人，其中男8人，女34人，年龄22～55岁。
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选择同期无血缘关系的北方汉族健康志愿者52例作为对照组，其中男30人，女22人，年龄25～57岁。
引物：根据第12届国际组织不相容工作专题会议(IHWC)的标准，对HLA-DR基因进行组特异性扩增。所用引物均由北京红十字血液中心提供。
实验方法：①DNA提取(采用第12届IHWC推荐的盐析法)：分离白细胞，于离心沉淀的白细胞中加入：160 μL 5×蛋白酶K缓冲液、40 μL蛋白酶K溶液(10 g/L双蒸水溶解)、40 μL 20% SDS(十二烷基硫酸钠)、300 μL双蒸水(反应总体积800 μL)，转移至1.5 mL管中，于55 ℃轻摇孵育2～4 h，并于1 h后再加入20 μL蛋白酶K，于室温下放凉。 加入200 μL 6 mol/L NaCl，用力振荡15～30 s后13 000 r/min离心10 min，析出蛋白。取上清于另一1.5 mL试管13 000 r/min离心5～10 min，重复此步骤至上清液清亮透明。将此上清液分装于2个1.5 mL试管内(各450 μL)，加入2倍无水乙醇(室温)使DNA析出，将析出的DNA转移至另一1.5 mL试管内，加入70%乙醇脱盐。13 000 r/min，离心5 min，离下DNA弃去乙醇，空气干燥。用Tris和EDTE(TE)溶液(或双蒸水)于4 ℃下溶解DNA并稀释至1～2 g/ L。②采用PCR/SSP方法对样本进行HLA-DR2及DR3组特异性扩增：引起HLA-DR多态性产生的氨基酸差异主要发生在 β链。从氨基酸分析结果来看，氨基酸的变异主要集中在β1区，此区主要由DRB基因的第2外显子编码。选择超可变区的部分保守序列为模板，使用DNA合成仪人工合成相对应的引物。在0.5 mL Eppenorf 管中加入：模板DNA 1 μg、10×PCR缓冲液5 μL(2.5 mmol/L MgCl2)、10×脱氧核苷二磷酸腺苷(dNTP，2 mmol/L)5 μL、HLA-DR2、DR3序列特异性寡核苷酸引物1对、多肽酶2 U，消毒双蒸水补至50 μL。短暂离心后，96 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s→60 ℃退火40s→72 ℃延伸1 min，循环30周，72 ℃延伸10 min。③扩增产物的检测：1.5%琼脂糖电泳，电压50 V，电泳30～60 min，EB染色，紫外灯下观察。每次加样时均加入阳性标准参照标本，扩增产物保存在-20 ℃环境中，如长期保存，应储存于-80 ℃冰箱内。
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统计学方法：
1)先计算各组不同的HLA-DR2及DR3的分布频率，然后使用Woolf方法计算相对危险度(relative risk, RR)
式中Pd为患者组抗原(基因)频率，Pc为对照组抗原(基因)频率。或根据直接代入各组的实际观察数值计算RR。
n1+代表抗原(基因)阳性病人数，n1-代表抗原(基因)阴性病人数，n2+代表抗原(基因)阳性对照组数，n2-代表抗原(基因)阴性对照组数。
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2)Grave病组及对照组HLA-DR2及DR3抗原阳性率的差异用χ2检验和Yates连续校正公式判定。
2 结果
用序列特异性寡核苷酸引物多聚酶链式反应扩增样本，HLA-DR2组特异性扩增产物为206 bp，HLA-DR3组特异性扩增产物为221 bp。
10例(23.8%)Grave病患者有HLA-DR2特异性扩增产物，正常对照组中11例(17.3%)有HLA-DR2特异性扩增产物，2组比较无明显差异(P>0.05)，RR(HLA-DR2)=1.16。8例(19.0%)Grave病患者有HLA-DR3特异性扩增产物，正常对照组中3例(5.8%)有HLA-DR3特异性扩增产物，Grave病组HLA-DR3抗原的频率明显高于正常对照组(P<0.05)，RR(HLA-DR3)=3.84。
3 讨论
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多组研究表明，Grave病与HLA的某些位点相关，HLA-DR3在西欧及印度Grave病发病人群中升高且统计结果有显著性差异。HLA-DR3阳性病例伴重度Grave病、突眼及复发的病例也增多。然而，HLA与Grave病的易感性在不同种族中也有不同，如在希腊Grave病发病人群中HLA-DRB11601(HLA-DR2的1个亚型)明显升高[1～4]。
本研究显示：HLA-DR3在北方汉族Grave病患者中的比例明显升高(P<0.05)，而DR2的比例与对照组大致相同。表明HLA-DR3与北方汉族Grave病的发病具有相关性。
近年来随着生物学技术的进步及对主要组织相容复合物(MHC)分子功能的深入研究，人们对HLAⅡ类抗原与疾病的关系有了进一步的认识，特别是对IDDM(胰岛素依赖性糖尿病)的研究，为搞清HLA在自身免疫性疾病发病中的作用提供了很好的范例，也有助于我们理解HLA 的某些抗原分子在Grave病发病中的作用。目前我们认为可能的机制有：①HLA分子对一些导致Grave病的自身抗原及病毒抗原肽的优先结合及呈递[6～9]。②易感基因与抵抗基因竞争与致病的多肽结合是一些自身免疫性疾病的发病基础，抵抗基因与这些多肽的结合导致的免疫反应，防止了易感基因与这些多肽的结合,在Grave病患者是否如此有待考证[10]。③近年来对启动子Ybox的研究显示其多态性改变与疾病易感性之间存在很强的关联。④非HLA基因的作用及环境因素的影响：虽然HLA在一些疾病中显示与遗传易感性强相关，但许多非HLA基因及环境因素起了很大作用，在这些疾病中特定HLA基因并不是发病所必需的，提示还有很多除HLA易感基因以外的因素参与发病[11]。HLA分子在Grave病的发病中具体是通过以上哪种机制作用的，目前尚难肯定，而方法学的进步显然是至关重要的,相信随着生物学技术的进步，我们将最终搞清HLA与Grave病的关系。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Semana G, Allanic H. Implication of the HLA DRB3 genes in Graves′ disease: Predominance of allele Dw24. Hum Immunol, 1990,29:143～149
2，Farid N, Thompson C. HLA and autoimmune endocrine disease. Mol Biol Med, 1985,3:85～97
3，Ratanachaiyavong S, Lloyd L, Dark C, et al. MHC extended haplotypes in families of patients with Graves′ disease. Hum Immunol, 1993,36:99～111
, 百拇医药
4，Badenhoop K, Schleusener H. Immunogenetics of endocrine ophtalmopathy and Graves′ disease. Dev Ophthalmol, 1993,25:11～19
5，John Lee. The HLA system. New York: Springer-Verlag New York Incomprated, 1991
6，Wucherpfennig K W,Strominger J L. Selective binding of self peptide to disease-associated major histocompatibility complex(MHC)molecules: A mechanism for MHC-linked susceptibility to human autoimmune disease.J Exp Med,1995,181:1597～1601
, 百拇医药
7，Rammensee H G, Friede T. MHC ligands and peptide motifs first listing. Immunogenetics,1995,41:178～228
8，Stern L J. Crystal structure of human class II MHC protein HLA DR1 complexed with an influenza virus peptide. Nature, 1994,386:215～223
9，Kwok W W, Nepom G T. HLA-DQ polymorphisms are highly selective for peptide binding interactions. Immunology, 1996,156:2171～2177
10，Nepom G T. A unified hypothesis for the complex genetics of HLA associations with IDDM. Diabetes, 1990,39:1153～1157
11，Thorby E. HLA-associated disease susceptibility, which genes are primarily involved? Immunologist, 1995,3:51～58
收稿日期：1999-06-20, http://www.100md.com