眼外肌注射肉毒杆菌毒素A后的形态学改变
作者：邓宏伟 杨景存 曹木荣 吴怡丹
单位：450052 郑州，河南医科大学第一附属医院眼科
关键词：肉毒杆菌毒素A；兔眼外肌；透射电子显微镜
眼科研究000215 摘要 目的进一步观察肉毒杆菌毒素A(BTA)所致的眼外肌形态学改变并探讨其作用机制。方法用组化3种方法(HE染色，BEST卡红法，1%氯化金染色)对注射BTA后不同时间的兔眼外肌行光镜下组织结构检查，并用透射电子显微镜观察其超微结构的变化。结果注射BTA后1周出现肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多。注药后1月眼外肌出现肌糖原纤维的节段性痉挛。注药后两月眼外肌出现不可逆萎缩。结论BTA作用部位的眼外肌纤维出现节段性不可逆萎缩，随注药后时间的延长神经肌肉接头处神经再生，从而产生肌纤维的节段性增生，使眼外肌力得到部分或全部的恢复。
分类号 R 777.4
, 百拇医药
Morphologic changes in extraocular muscles after injection botulinum A toxin
Deng Hongwei，Yang Jingcun，Cao Murong，et al.
Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital，Henan Medical University，Zhengzhou 450052
Abstract ObjectiveTo investigate the morphologic changes of the effect of botulinum toxin A(BTA) into extraocular muscles.MethodsHistochemical methods including hematoxylin and eosin stain and gold chloride stain were used to study the extraocular muscles of rabbits at different time period after BTA injection by light microscope.Ultrastructural changes were determined by electron microscopy.ResultsOne week after BTA injection，the amount of sarcoplasmic reticulum had expanded，and the basement color of the mitochondria and the amount of muscle glycogen increased.One month after injection，segmental myofibril spasm was seen.Two months after injection，the extraocular muscle became atrophic.ConclusionAt the site of the BTA injection in the muscle irreversible atrophy was found in segments， where the nerve terminals regenerate after injection，the myofibrils demonstrate focal hyperplasia in suggesting the muscle function will partly recover.
, 百拇医药
Key word sbotulinum toxin A rabbit extraocular muscles electron microscope
肉毒杆菌毒素A(botulinum toxin A，BTA)在眼科的临床应用始于1978年，Scott首次成功地用此药物代替手术治疗斜视[1]。之后，又推广用于眼震[2]、面肌痉挛[3]、睑痉挛[3]等神经肌肉痉挛性疾病。该方法被认为是目前治疗这些疾病的较安全、有效的新方法。该研究表明：BTA对眼外肌局部所造成的形态学改变，从客观上解释了其临床疗效。
1 材料与方法
1.1 动物：新西兰白兔10只，体重3～4 kg。
1.2 药品：结晶型BTA(兰州生物制品研究所提供)。40 U/安瓿，储存于-4℃低温冰箱，注射前以无菌生理盐水按比例稀释。苏木素液和伊红液，用做组织常规HE染色。卡红储存液和Best分色液，用做组织Best红法显示组织中糖原的量。1%氯化金溶液等，用做标本组织染色显示眼外肌的运动终板的形态。常规2.5%戊二醛磷酸缓冲固定液，用做组织光镜学观察。
, 百拇医药
1.3 设备：日立7500型透射电子显微镜，各种组化设备。
1.4 步骤：新西兰白兔经2%戊巴比妥钠(1.5 ml/kg)麻醉后，分别于各兔右眼内、外直肌止端中后三分之二处[4]注射B TA 0.1 ml(2 U/0.1 ml)。分别于各兔左眼相应部位注入等量无菌生理盐水 。前组为实验组，后组为对照组。
分别取注药后饲养1周、1月及2月的注射部位兔眼外肌行各项组化染色及电镜形态学观察。
2 结果
2.1 光镜组织学观察
2.1.1 常规HE染色
注药后1周、1月及2月的实验组与对照组相比眼外肌形态无明显异常。
, 百拇医药
2.1.2 Best卡红法
显示注药后1周、1月及2月的实验组的糖原量多于对照组。见图1，2。
2.1.3 1%氯化金染色
注药后1周、1月及2月的实验组与对照组相比眼外肌运动终板及肌纤维的形态无明显异常。从眼外肌运动终板的形态上分肌纤维为3种：(1)Felderstruktur肌纤维(亦称红肌纤维，慢肌纤维)为眼外肌特有肌纤维，司慢相运动，维持持久眼位，分布于眼外肌浅表面且近眼眶壁[5]。支配这类肌纤维的神经末梢是无髓神经末梢，在AuCl3压片中呈“葡萄串状”或“爪牙状”伸入肌束和肌纤维。(2)Filbriuenstrustur肌纤维[6](亦称白肌纤维，快肌纤维或牵拉型肌纤维)为司快相运动的粗大肌纤维，一般分布于肌肉中央，是有髓神经末梢支配。在AuCl3压片中呈“块状”或“平坦板状”伸入肌束和肌纤维。(3)为介于上述两者之间的肌纤维[6]，支配的神经末梢无特征性。
, 百拇医药
2.2 电镜超微结构观察
发现兔眼外肌随注药后时间的延长有以下改变：注药后1周出现肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多。见图3。注药后1月可见肌原纤维的节段性痉挛。肌浆网的增多和扩张更加明显，肌糖原颗粒增多更显著。线粒体嵴紊乱、消失。见图4。注药后2月出现肌原纤维的节段性溶解、消失。见图5。
图1，2 对照组(上)和实验组(下)Best卡红染色光镜照片，肌糖原呈红色(×10) 图3 注药后1周电镜照片见肌浆网的增多和扩张(空泡状)，线粒体的基质着色加深(黑色团状)，肌糖原颗粒增多(黑色点状散在)(×15 000) 图4 电镜下注药后1月眼外肌出现肌原纤维的阶段性痉挛(箭头)(×7 000)，线粒体嵴紊乱、消失(×60 000)，见右下脚小图 图5 电镜下注药后2月眼外肌出现不可逆萎缩(箭头)(×4 000) Fig.1，2 Best stain in pre-injected BTA extraocular muscles(up)and in test groups(down)by light microscope.LM×10 Fig.3 It’s been found that the amount of sarcoplasmic reticulum has developed and expanded(vacuole shape)，the basement color of the mitochon-dria has developed(black dumpling shape)，and the amount of muscle glycogen has also developed after one week injection(scatter black drops).EM×15 000 Fig.4 One-month after injection，it was found that myofibril has spasm in segments(arrow).EM×7 000 it was also found that the basement of the mitochondria disordered and vanished(right bellow).EM×60 000 Fig.5 Two months after injection，the extraocular muscle was found in an irreversible atrophy(arrow).EM×4 0003 讨论
, http://www.100md.com
BTA作用于神经末梢的药动学过程包括3步[7]：结合、内转、麻痹。毒素注射后迅速且牢固地呈饱和态结合于胆碱能神经末梢的受体位点上。内转是毒素在末端胞膜上，通过胞饮循环把毒素转入细胞内的过程。肌肉麻痹的产生是由于特异性抑制了乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)释放[8]。使肌梭内本体感受器传入冲动减少，从而出现肌麻痹。被注射区的肌肉组织病理显示[4]：肌肉萎缩，神经末梢轻度脱髓鞘改变，以神经肌肉接头处神经芽形成和洋葱头样结构为特征的神经再生。完全地从毒素效应中恢复过来一般需要6～9月[9]。被注射肌肉最终可以完全或部分恢复到注药前的功能[10]。
本研究进一步观察到了眼外肌随注药后时间的延长所产生的形态学改变，进一步解释了临床效应。注药后1周眼外肌不论从光镜(Best卡红法染色)或是从电镜下观察肌纤维形态与结构都证实：眼外肌处于功能代偿期，通过有氧呼吸的加强(显示为肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多)来代偿肌肉功能的减退。临床上表现为肌张力的下降。注药后1及2月眼外肌电镜下的结构改变可说明此时为眼外肌的功能失代偿状态(显示为肌原纤维的节段性痉挛，不可逆的肌萎缩)。临床上表现为肌张力的不可逆下降。由于注药后3月在临床上出现肌张力的恢复[7]，推测此时为神经肌肉再生期。
, http://www.100md.com
综上所述，推测BTA作用部位的病理改变为：先出现作用部位肌纤维的有氧呼吸增加，后出现肌纤维节段性萎缩，随注药后时间的延长神经肌肉接头处神经再生，从而产生肌纤维的节段性增生，使眼外肌的肌力得到部分或全部恢复。
由于牵拉型神经末梢出现有致密物质将神经末梢与肌肉分隔[4]，推测BTA主要致白肌纤维产生不可逆萎缩。当用BTA治疗神经肌肉痉挛性疾病或眼球震颤时，临床上取得良好疗效的原因可能是由于粗大的白肌纤维产生不可逆萎缩，使维持眼位的红肌纤维相对增加，眼肌痉挛或眼震得以减轻。但红肌纤维是否有数量上的绝对增加还需进一步的证实。
1，Scott AB.Botulinum toxin injection into extra-ocular muscles as an alternative to strabismus surgery.Ophthalmology，1980，87∶1044
, 百拇医药
2，Ruben ST，Lee JP，O’Neil D，et al.The use of bitulinum toxin for treatment of acquired nystagmus and oscillopsia.Ophthalmology，1994，101(4)∶783
3，Wirtschafter JD.Clinical doxorubicin chemomyectomy an experimental treatment for benign essential blepharospasm and hemifacial spasm.Ophthalmology，1991，98∶357
4，荣翱.肉毒杆菌毒素A对眼肌的形态学研究.南京铁道医学院学报，1995，14(2)∶77
5，荣翱，粟国范，观前进，等.肉毒杆菌毒素A对眼外肌作用的实验研究(I).眼科研究，1990，8(4)∶245
, http://www.100md.com
6，Dolly J，Black J，Williams RS，et al.Acceptors for botulinum neurotoxin reside on motion nerve terminals and mediate its internalisation.Nature，1984，307∶457
7，Carruthers A，Kiene K，Carruthers J.Botulinum A exotoxin use in clinical dermatology.J Am Acad Dermatol，1996，34(5)∶788
8，Manni E，Bagolini B，Pettorossi VE，et al.Effect of botulinum toxin on extraocular muscle proprioceptor.Doc Ophthalmol，1989，72(2)∶189
9，Gammon JA.Chemodenervation treatment of strabismus and blepharospasm with botulinum toxin.Ocular Therapy，1984，1∶3
10，Scott AB.Clostridial toxin as therapeutic agents.In：Simpson LL，ed.Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin.New York：Academic Press，1989.399-412
(收稿：1999-03-20), 百拇医药
单位：450052 郑州，河南医科大学第一附属医院眼科
关键词：肉毒杆菌毒素A；兔眼外肌；透射电子显微镜
眼科研究000215 摘要 目的进一步观察肉毒杆菌毒素A(BTA)所致的眼外肌形态学改变并探讨其作用机制。方法用组化3种方法(HE染色，BEST卡红法，1%氯化金染色)对注射BTA后不同时间的兔眼外肌行光镜下组织结构检查，并用透射电子显微镜观察其超微结构的变化。结果注射BTA后1周出现肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多。注药后1月眼外肌出现肌糖原纤维的节段性痉挛。注药后两月眼外肌出现不可逆萎缩。结论BTA作用部位的眼外肌纤维出现节段性不可逆萎缩，随注药后时间的延长神经肌肉接头处神经再生，从而产生肌纤维的节段性增生，使眼外肌力得到部分或全部的恢复。
分类号 R 777.4
, 百拇医药
Morphologic changes in extraocular muscles after injection botulinum A toxin
Deng Hongwei，Yang Jingcun，Cao Murong，et al.
Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital，Henan Medical University，Zhengzhou 450052
Abstract ObjectiveTo investigate the morphologic changes of the effect of botulinum toxin A(BTA) into extraocular muscles.MethodsHistochemical methods including hematoxylin and eosin stain and gold chloride stain were used to study the extraocular muscles of rabbits at different time period after BTA injection by light microscope.Ultrastructural changes were determined by electron microscopy.ResultsOne week after BTA injection，the amount of sarcoplasmic reticulum had expanded，and the basement color of the mitochondria and the amount of muscle glycogen increased.One month after injection，segmental myofibril spasm was seen.Two months after injection，the extraocular muscle became atrophic.ConclusionAt the site of the BTA injection in the muscle irreversible atrophy was found in segments， where the nerve terminals regenerate after injection，the myofibrils demonstrate focal hyperplasia in suggesting the muscle function will partly recover.
, 百拇医药
Key word sbotulinum toxin A rabbit extraocular muscles electron microscope
肉毒杆菌毒素A(botulinum toxin A，BTA)在眼科的临床应用始于1978年，Scott首次成功地用此药物代替手术治疗斜视[1]。之后，又推广用于眼震[2]、面肌痉挛[3]、睑痉挛[3]等神经肌肉痉挛性疾病。该方法被认为是目前治疗这些疾病的较安全、有效的新方法。该研究表明：BTA对眼外肌局部所造成的形态学改变，从客观上解释了其临床疗效。
1 材料与方法
1.1 动物：新西兰白兔10只，体重3～4 kg。
1.2 药品：结晶型BTA(兰州生物制品研究所提供)。40 U/安瓿，储存于-4℃低温冰箱，注射前以无菌生理盐水按比例稀释。苏木素液和伊红液，用做组织常规HE染色。卡红储存液和Best分色液，用做组织Best红法显示组织中糖原的量。1%氯化金溶液等，用做标本组织染色显示眼外肌的运动终板的形态。常规2.5%戊二醛磷酸缓冲固定液，用做组织光镜学观察。
, 百拇医药
1.3 设备：日立7500型透射电子显微镜，各种组化设备。
1.4 步骤：新西兰白兔经2%戊巴比妥钠(1.5 ml/kg)麻醉后，分别于各兔右眼内、外直肌止端中后三分之二处[4]注射B TA 0.1 ml(2 U/0.1 ml)。分别于各兔左眼相应部位注入等量无菌生理盐水 。前组为实验组，后组为对照组。
分别取注药后饲养1周、1月及2月的注射部位兔眼外肌行各项组化染色及电镜形态学观察。
2 结果
2.1 光镜组织学观察
2.1.1 常规HE染色
注药后1周、1月及2月的实验组与对照组相比眼外肌形态无明显异常。
, 百拇医药
2.1.2 Best卡红法
显示注药后1周、1月及2月的实验组的糖原量多于对照组。见图1，2。
2.1.3 1%氯化金染色
注药后1周、1月及2月的实验组与对照组相比眼外肌运动终板及肌纤维的形态无明显异常。从眼外肌运动终板的形态上分肌纤维为3种：(1)Felderstruktur肌纤维(亦称红肌纤维，慢肌纤维)为眼外肌特有肌纤维，司慢相运动，维持持久眼位，分布于眼外肌浅表面且近眼眶壁[5]。支配这类肌纤维的神经末梢是无髓神经末梢，在AuCl3压片中呈“葡萄串状”或“爪牙状”伸入肌束和肌纤维。(2)Filbriuenstrustur肌纤维[6](亦称白肌纤维，快肌纤维或牵拉型肌纤维)为司快相运动的粗大肌纤维，一般分布于肌肉中央，是有髓神经末梢支配。在AuCl3压片中呈“块状”或“平坦板状”伸入肌束和肌纤维。(3)为介于上述两者之间的肌纤维[6]，支配的神经末梢无特征性。
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2.2 电镜超微结构观察
发现兔眼外肌随注药后时间的延长有以下改变：注药后1周出现肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多。见图3。注药后1月可见肌原纤维的节段性痉挛。肌浆网的增多和扩张更加明显，肌糖原颗粒增多更显著。线粒体嵴紊乱、消失。见图4。注药后2月出现肌原纤维的节段性溶解、消失。见图5。
图1，2 对照组(上)和实验组(下)Best卡红染色光镜照片，肌糖原呈红色(×10) 图3 注药后1周电镜照片见肌浆网的增多和扩张(空泡状)，线粒体的基质着色加深(黑色团状)，肌糖原颗粒增多(黑色点状散在)(×15 000) 图4 电镜下注药后1月眼外肌出现肌原纤维的阶段性痉挛(箭头)(×7 000)，线粒体嵴紊乱、消失(×60 000)，见右下脚小图 图5 电镜下注药后2月眼外肌出现不可逆萎缩(箭头)(×4 000) Fig.1，2 Best stain in pre-injected BTA extraocular muscles(up)and in test groups(down)by light microscope.LM×10 Fig.3 It’s been found that the amount of sarcoplasmic reticulum has developed and expanded(vacuole shape)，the basement color of the mitochon-dria has developed(black dumpling shape)，and the amount of muscle glycogen has also developed after one week injection(scatter black drops).EM×15 000 Fig.4 One-month after injection，it was found that myofibril has spasm in segments(arrow).EM×7 000 it was also found that the basement of the mitochondria disordered and vanished(right bellow).EM×60 000 Fig.5 Two months after injection，the extraocular muscle was found in an irreversible atrophy(arrow).EM×4 0003 讨论
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BTA作用于神经末梢的药动学过程包括3步[7]：结合、内转、麻痹。毒素注射后迅速且牢固地呈饱和态结合于胆碱能神经末梢的受体位点上。内转是毒素在末端胞膜上，通过胞饮循环把毒素转入细胞内的过程。肌肉麻痹的产生是由于特异性抑制了乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)释放[8]。使肌梭内本体感受器传入冲动减少，从而出现肌麻痹。被注射区的肌肉组织病理显示[4]：肌肉萎缩，神经末梢轻度脱髓鞘改变，以神经肌肉接头处神经芽形成和洋葱头样结构为特征的神经再生。完全地从毒素效应中恢复过来一般需要6～9月[9]。被注射肌肉最终可以完全或部分恢复到注药前的功能[10]。
本研究进一步观察到了眼外肌随注药后时间的延长所产生的形态学改变，进一步解释了临床效应。注药后1周眼外肌不论从光镜(Best卡红法染色)或是从电镜下观察肌纤维形态与结构都证实：眼外肌处于功能代偿期，通过有氧呼吸的加强(显示为肌浆网的增多和扩张，线粒体的基质着色加深，肌糖原颗粒增多)来代偿肌肉功能的减退。临床上表现为肌张力的下降。注药后1及2月眼外肌电镜下的结构改变可说明此时为眼外肌的功能失代偿状态(显示为肌原纤维的节段性痉挛，不可逆的肌萎缩)。临床上表现为肌张力的不可逆下降。由于注药后3月在临床上出现肌张力的恢复[7]，推测此时为神经肌肉再生期。
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综上所述，推测BTA作用部位的病理改变为：先出现作用部位肌纤维的有氧呼吸增加，后出现肌纤维节段性萎缩，随注药后时间的延长神经肌肉接头处神经再生，从而产生肌纤维的节段性增生，使眼外肌的肌力得到部分或全部恢复。
由于牵拉型神经末梢出现有致密物质将神经末梢与肌肉分隔[4]，推测BTA主要致白肌纤维产生不可逆萎缩。当用BTA治疗神经肌肉痉挛性疾病或眼球震颤时，临床上取得良好疗效的原因可能是由于粗大的白肌纤维产生不可逆萎缩，使维持眼位的红肌纤维相对增加，眼肌痉挛或眼震得以减轻。但红肌纤维是否有数量上的绝对增加还需进一步的证实。
1，Scott AB.Botulinum toxin injection into extra-ocular muscles as an alternative to strabismus surgery.Ophthalmology，1980，87∶1044
, 百拇医药
2，Ruben ST，Lee JP，O’Neil D，et al.The use of bitulinum toxin for treatment of acquired nystagmus and oscillopsia.Ophthalmology，1994，101(4)∶783
3，Wirtschafter JD.Clinical doxorubicin chemomyectomy an experimental treatment for benign essential blepharospasm and hemifacial spasm.Ophthalmology，1991，98∶357
4，荣翱.肉毒杆菌毒素A对眼肌的形态学研究.南京铁道医学院学报，1995，14(2)∶77
5，荣翱，粟国范，观前进，等.肉毒杆菌毒素A对眼外肌作用的实验研究(I).眼科研究，1990，8(4)∶245
, http://www.100md.com
6，Dolly J，Black J，Williams RS，et al.Acceptors for botulinum neurotoxin reside on motion nerve terminals and mediate its internalisation.Nature，1984，307∶457
7，Carruthers A，Kiene K，Carruthers J.Botulinum A exotoxin use in clinical dermatology.J Am Acad Dermatol，1996，34(5)∶788
8，Manni E，Bagolini B，Pettorossi VE，et al.Effect of botulinum toxin on extraocular muscle proprioceptor.Doc Ophthalmol，1989，72(2)∶189
9，Gammon JA.Chemodenervation treatment of strabismus and blepharospasm with botulinum toxin.Ocular Therapy，1984，1∶3
10，Scott AB.Clostridial toxin as therapeutic agents.In：Simpson LL，ed.Botulinum Neurotoxin and Tetanus Toxin.New York：Academic Press，1989.399-412
(收稿：1999-03-20), 百拇医药