HyTK/ACV对动脉内皮剥脱后新内膜增生抑制作用的观察
作者：张英谦 田时雨 吴小兵 张洪义
单位：张英谦(空军总医院神经科，北京 100036)；田时雨(第一军医大学附属珠江医院神经科)；吴小兵(第一军医大学分子生物学研究所)；张洪义(空军总医院肝胆外科)
关键词：再狭窄；逆转录病毒载体；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；无环鸟苷；血管平滑肌细胞
中国老年学杂志000226摘 要 目的 探讨HyTK/ACV治疗颈动脉内膜切除术后再狭窄的可能性。方法 利用“空气吹干法”造成大鼠颈动脉内皮损伤，1 w后用LNCHyTK病毒上清转染损伤的血管壁细胞，于转染后第2天开始使用ACV，14 d后取材进行光镜及电镜观察，并比较实验组及对照组大鼠的颈动脉I/M。结果 PCR方法检测到HyTK确实被转染进血管壁细胞中；光镜观察发现实验鼠颈动脉壁I/M较对照组减少；电镜观察发现实验鼠VSMC的凋亡。结论 LNCHyTK可以成功地转染血管壁细胞，联合使用ACV后，可抑制大鼠颈动脉损伤后引起的SMC的增殖。
, 百拇医药
颈动脉内膜切除是治疗颈动脉狭窄预防缺血性脑血管病发生的重要方法，而术后发生的再狭窄直接影响该手术的疗效。研究发现，由血管平滑肌细胞(VSMC)增生引起的新内膜的形成是再狭窄的主要原因。因此，早在1990年科学家〔1〕就提出，通过对VSMC进行遗传修饰，抑制VSMC的增殖，治疗再狭窄。1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)基因的表达产物可以使无环鸟苷(ACV)磷酸化形成三磷酸ACV(acGTP)，由于acGTP缺少形成DNA链所必需的3-OH，因此当其被掺入到DNA链中时，实际上即终止了DNA链的延伸，细胞分裂受到抑制。本实验即是应用这一原理，利用重组逆转录病毒为载体，将HSV-TK基因导入血管壁细胞中，并使其表达，辅助应用ACV，抑制内膜损伤后VSMC的增殖，减轻再狭窄的程度，探讨基因治疗再狭窄的可能性。
1 材料与方法
1.1 动物及主要材料 动物来源：采用国产SD大鼠，雄性300～400 g，12周龄以上，第一军医大学实验动物中心提供。LNCHyTK病毒上清：滴度2×105 CFU/ml。LNCX病毒上清：为不含HyTK基因的空载逆病毒载体。以上均由第一军医大学分子生物学研究所提供。DMEM粉剂：Gibco公司出品。无环鸟苷(acyclovir)由湖北潜江制药厂生产，批号960304。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 模型制作 根据参考文献〔2〕，应用“空气吹干法”造成大鼠颈动脉内皮脱落，Evens蓝染色法〔3〕检测动脉内皮剥脱。
1.2.2 动脉壁HyTK基因转移及ACV治疗 实验动物分四组：转染HyTK，给/不给ACV(HyTK/±ACV)；不转染HyTK，给ACV(LNCX/+ACV，DMEM/+ACV)；取接受“空气吹干法”手术1 w的大鼠，LNCHyTK病毒上清+polybrene血管内连续孵育2次，每次20 min〔4〕，间隔5 min。对照鼠分别以LNCX上清及DMEM液代替LNCHyTK上清，余操作相同。
1.2.3 ACV治疗 转基因后第2天开始ACV治疗，剂量1.5～2.0 mg/100g体重，腹腔内注射，q 8 h。对照鼠给等量无菌注射用水。
, http://www.100md.com
1.3 取材 光镜观察标本，取ACV治疗14 d大鼠，4%多聚甲醛主动脉灌注(高度为120 cm)固定，完整地取出大鼠的颈总动脉，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察。同时取大鼠脑、心、肾观察毒性反应。
1.4 内膜增生的形态学测量及分析 根据参考文献〔5〕略加改进，取需观察的动脉环切片(每例动脉取三个动脉环，每个动脉环至少取三张不连续切片)，应用Q520显微图像分析仪特征测量，检测动脉内膜(I)、中膜(M)厚度，计算内膜和中膜厚度之比(I/M)。
1.5 转染动脉壁中HSV1-TK和RCR基因片段的PCR检测。
1.5.1 引物合成 应用引物P1,P2和ENV1，ENV3分别检测被转染动脉段TK基因片段和可复制逆转录病毒(RCR)片段。引物在中科院上海生化研究所合成。序列如下：
ENV1 5-ACCTGCAGAGTCACCAACC-3
, 百拇医药
ENV3 5-TACTTTGGAGAGAGGTCGGTAGC-3
P1 5-GCGTCTGCGTTCGACCACCAGGA-3
P1 5-GGAGCCAGAACGGCGTCGG-3
1.5.2 PCR反应 参考文献〔6〕利用酚-氯仿抽提法提取微量组织中的DNA。PCR反应体系如下：总反应体积25 μl，其中含引物P1、P2各1.0 μl(25 pmol/L)，2 mmol/L dNTP 1.0 μl，10×Buffer2.5 μl，模板DNA 1.0 μl，Taq酶2.0 U。反应条件为94 ℃变性，60 ℃退火，73 ℃延伸各45 s。最后一个循环73 ℃延伸5 min，共30个循环。
取动脉壁组织DNA 1.0～2.0 μl按上述反应体系进行扩增，并以tgCMV-HyTK质粒及PA317细胞DNA为阳性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 动脉壁中HyTK基因的检测 用HSV1-TK基因特异性引物P1、P2对转染的血管壁组织DNA进行PCR扩增，可见未转染血管壁DNA的扩增结果为阴性，而转染组织的DNA可扩增出一条略小于404 bp的片段，与预期的395 bp大小相符，表明用LNCHyTK病毒上清转染血管壁是成功的。
2.2 HyTK/ACV对动脉壁增生抑制作用的观察 光镜观察各组均可见明显的新内膜形成，其内膜面无内皮细胞覆盖，HyTK/+ACV 14 d大鼠颈动脉增厚较轻，各组I/M(n=3)分别为：HyTK/+ACV 0.250，HyTK/-ACV 0.550，LNCX/+ACV 0.614，DMEM/+ACV 0.586。电镜观察发现HyTK/+ACV大鼠新生内膜中的SMC核固缩，核内染色质聚集在核膜处，对照组未发现上述改变。
2.3 HyTK/ACV毒副作用的观察 以PA317细胞为阳性对照，用检测RCRENV基因的引物ENV1、ENV3对血管壁组织DNA和脑组织DNA进行PCR扩增，结果为阴性，表明转染组织中不含RCR。光镜观察HyTK/ACV治疗14 d的大鼠颈动脉壁、心、脑、肾等组织结构正常，无炎性反应改变。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 逆转录病毒介导的HyTK基因转移及其安全性 本实验采用in vivo方法，用LNCHyTK病毒上清直接转染血管壁细胞，经PCR方法检测，证明TK基因转移成功。对被转染段血管及其远端脑组织的PCR检测结果，表明不含RCR，组织学观察HyTK/+ACV大鼠的脑、心、肾等脏器均未发现明显异常，提示LNCHyTK/+ACV方法是安全的，短期应用无明显毒副作用。
3.2 LNCHyTK/ACV对SMC增殖的抑制及其意义 本实验发现HyTK/ACV治疗14 d动脉壁新生I和I/M较对照组有明显减少，提示LNCHyTK/ACV能够抑制新生内膜的形成。透射电镜观察发现HSV1-TK/ACV治疗鼠颈动脉壁中存在SMC凋亡，提示诱发SMC凋亡可能是其抑制SMC增殖的方式之一。此与Barbee〔4〕的实验结果不同。我们认为恰当地选择转基因的时机，适当延长病毒上清与血管壁接触时间，短时间内重复转染，均有助于提高逆转录病毒载体的转染效率。
, http://www.100md.com
研究表明〔7〕颈动脉内膜切除术后2～3年出现的早期再狭窄主要表现为新生内膜中的纤维肌性增生及糖蛋白沉积；晚期再狭窄(术后2～3年后)则主要由AS成份组成，包括泡沫细胞、胆固醇斑、大量胶原纤维和钙化，其间夹杂有局灶性的内膜纤维肌性增生。因此，SMC增殖的影响贯穿再狭窄发生的始终，抑制VSMC的早期增殖，其意义不仅仅在于减少管壁的细胞数，还可能影响到随后出现的间质沉积、SMC的泡沫化、粥样斑块形成和钙化等〔8〕，目前这类研究仍在进行中。
3.3 HyTK/AVC对内皮细胞修复的影响 以往的实验发现，受损的动脉壁为新生内皮覆盖后，内膜中SMC的增殖即停止，其机制可能与内皮细胞产生NO有关〔10〕。我们观察到，至损伤后3 w，HyTK/+ACV鼠的动脉腔面仍无内皮细胞覆盖，推测是因为HyTK/+ACV同时抑制了内皮细胞的修复。与SMC相比，内皮细胞的再生能力十分低下，而LNCHyTK/ACV对具有活跃增殖能力的细胞具有选择性。同样条件下，血管壁中内皮细胞被LNCHyTK转染并被ACV杀死的可能性远远小于增殖活跃SMC。Gutzman〔11〕等人的实验表明，更昔洛韦治疗结束后内皮细胞的再生可以恢复，因此HyTK/ACV可能只是暂时影响内皮细胞修复，且程度不大。
, http://www.100md.com
作者简介：张英谦，女，35岁，主治医师，从事脑血管病研究
参考文献
1，Bauters C.Gene therapy for cardiovascular disease.Eur Heart J，1995；16(9)：1166
2，Jay A Fishman,Graeme B Ryan,Morris J Karnovsky.Endothelial regeneration in the rat carotid artery and significance of endothelial of myointimal thickenig.Lab Invest，1975；32(3)：339
3，Clowes AW，Clowes MM Reidy MA.Kinetics of cellular proliferation after arterial injury，I:Smooth muscle growth in the absence of endothelium.Lab Invest，1983；49：327
, http://www.100md.com
4，Barbee RW，Stapleton DD,Madras DE et al.Retroviral sucide vector does not inhibit neointimal growth in a porcine model of restenosis.Biochem Biophys Res Commun，1995；207：89
5，Franz F，Weidinger,James M Mclenachan,Myron I Cybulsky et al.Persistent dysfunction of regenerated endothelium after balloon angioplasty of rabbit iliac artery.Circulation，1990；81：1667
6，吴小兵，彭朝辉，徐 钤 et al.人乳头瘤病毒在大肠瘤中的检出.第一军医大学学报，1992；12：289
, 百拇医药
7，Philip J Rossi,Stuart L Myers,G Patrick Clagett.Reoperative approcaches for carotid restenosis.Seminars in Vascular Surg，1994；7(3)：195
8，张英谦，田时雨.平滑肌细胞和动脉粥样硬化.国外医学*老年医学分册，1997；6：243
9，Garg UC，Hassid A.Nitric oxide-generating vasodilition and 8-bromo-cyclic guanaine monophosphate inhibition mitogenesia and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells.J Clin Invest，1989；3：1774
10，Raul J Gutzman,Edward A Hirschowitz,Steven L Brody et al.In vivo supperssion of injury-induced vascular smooth muscle cell accumulation using adenovirus-mediated transfer of the herpes simples virus thymidine kinase gene.Proc Natl Acad Sci USA，1994；91：10732
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-04-04, 百拇医药
单位：张英谦(空军总医院神经科，北京 100036)；田时雨(第一军医大学附属珠江医院神经科)；吴小兵(第一军医大学分子生物学研究所)；张洪义(空军总医院肝胆外科)
关键词：再狭窄；逆转录病毒载体；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；无环鸟苷；血管平滑肌细胞
中国老年学杂志000226摘 要 目的 探讨HyTK/ACV治疗颈动脉内膜切除术后再狭窄的可能性。方法 利用“空气吹干法”造成大鼠颈动脉内皮损伤，1 w后用LNCHyTK病毒上清转染损伤的血管壁细胞，于转染后第2天开始使用ACV，14 d后取材进行光镜及电镜观察，并比较实验组及对照组大鼠的颈动脉I/M。结果 PCR方法检测到HyTK确实被转染进血管壁细胞中；光镜观察发现实验鼠颈动脉壁I/M较对照组减少；电镜观察发现实验鼠VSMC的凋亡。结论 LNCHyTK可以成功地转染血管壁细胞，联合使用ACV后，可抑制大鼠颈动脉损伤后引起的SMC的增殖。
, 百拇医药
颈动脉内膜切除是治疗颈动脉狭窄预防缺血性脑血管病发生的重要方法，而术后发生的再狭窄直接影响该手术的疗效。研究发现，由血管平滑肌细胞(VSMC)增生引起的新内膜的形成是再狭窄的主要原因。因此，早在1990年科学家〔1〕就提出，通过对VSMC进行遗传修饰，抑制VSMC的增殖，治疗再狭窄。1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)基因的表达产物可以使无环鸟苷(ACV)磷酸化形成三磷酸ACV(acGTP)，由于acGTP缺少形成DNA链所必需的3-OH，因此当其被掺入到DNA链中时，实际上即终止了DNA链的延伸，细胞分裂受到抑制。本实验即是应用这一原理，利用重组逆转录病毒为载体，将HSV-TK基因导入血管壁细胞中，并使其表达，辅助应用ACV，抑制内膜损伤后VSMC的增殖，减轻再狭窄的程度，探讨基因治疗再狭窄的可能性。
1 材料与方法
1.1 动物及主要材料 动物来源：采用国产SD大鼠，雄性300～400 g，12周龄以上，第一军医大学实验动物中心提供。LNCHyTK病毒上清：滴度2×105 CFU/ml。LNCX病毒上清：为不含HyTK基因的空载逆病毒载体。以上均由第一军医大学分子生物学研究所提供。DMEM粉剂：Gibco公司出品。无环鸟苷(acyclovir)由湖北潜江制药厂生产，批号960304。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 模型制作 根据参考文献〔2〕，应用“空气吹干法”造成大鼠颈动脉内皮脱落，Evens蓝染色法〔3〕检测动脉内皮剥脱。
1.2.2 动脉壁HyTK基因转移及ACV治疗 实验动物分四组：转染HyTK，给/不给ACV(HyTK/±ACV)；不转染HyTK，给ACV(LNCX/+ACV，DMEM/+ACV)；取接受“空气吹干法”手术1 w的大鼠，LNCHyTK病毒上清+polybrene血管内连续孵育2次，每次20 min〔4〕，间隔5 min。对照鼠分别以LNCX上清及DMEM液代替LNCHyTK上清，余操作相同。
1.2.3 ACV治疗 转基因后第2天开始ACV治疗，剂量1.5～2.0 mg/100g体重，腹腔内注射，q 8 h。对照鼠给等量无菌注射用水。
, http://www.100md.com
1.3 取材 光镜观察标本，取ACV治疗14 d大鼠，4%多聚甲醛主动脉灌注(高度为120 cm)固定，完整地取出大鼠的颈总动脉，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察。同时取大鼠脑、心、肾观察毒性反应。
1.4 内膜增生的形态学测量及分析 根据参考文献〔5〕略加改进，取需观察的动脉环切片(每例动脉取三个动脉环，每个动脉环至少取三张不连续切片)，应用Q520显微图像分析仪特征测量，检测动脉内膜(I)、中膜(M)厚度，计算内膜和中膜厚度之比(I/M)。
1.5 转染动脉壁中HSV1-TK和RCR基因片段的PCR检测。
1.5.1 引物合成 应用引物P1,P2和ENV1，ENV3分别检测被转染动脉段TK基因片段和可复制逆转录病毒(RCR)片段。引物在中科院上海生化研究所合成。序列如下：
ENV1 5-ACCTGCAGAGTCACCAACC-3
, 百拇医药
ENV3 5-TACTTTGGAGAGAGGTCGGTAGC-3
P1 5-GCGTCTGCGTTCGACCACCAGGA-3
P1 5-GGAGCCAGAACGGCGTCGG-3
1.5.2 PCR反应 参考文献〔6〕利用酚-氯仿抽提法提取微量组织中的DNA。PCR反应体系如下：总反应体积25 μl，其中含引物P1、P2各1.0 μl(25 pmol/L)，2 mmol/L dNTP 1.0 μl，10×Buffer2.5 μl，模板DNA 1.0 μl，Taq酶2.0 U。反应条件为94 ℃变性，60 ℃退火，73 ℃延伸各45 s。最后一个循环73 ℃延伸5 min，共30个循环。
取动脉壁组织DNA 1.0～2.0 μl按上述反应体系进行扩增，并以tgCMV-HyTK质粒及PA317细胞DNA为阳性对照。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 动脉壁中HyTK基因的检测 用HSV1-TK基因特异性引物P1、P2对转染的血管壁组织DNA进行PCR扩增，可见未转染血管壁DNA的扩增结果为阴性，而转染组织的DNA可扩增出一条略小于404 bp的片段，与预期的395 bp大小相符，表明用LNCHyTK病毒上清转染血管壁是成功的。
2.2 HyTK/ACV对动脉壁增生抑制作用的观察 光镜观察各组均可见明显的新内膜形成，其内膜面无内皮细胞覆盖，HyTK/+ACV 14 d大鼠颈动脉增厚较轻，各组I/M(n=3)分别为：HyTK/+ACV 0.250，HyTK/-ACV 0.550，LNCX/+ACV 0.614，DMEM/+ACV 0.586。电镜观察发现HyTK/+ACV大鼠新生内膜中的SMC核固缩，核内染色质聚集在核膜处，对照组未发现上述改变。
2.3 HyTK/ACV毒副作用的观察 以PA317细胞为阳性对照，用检测RCRENV基因的引物ENV1、ENV3对血管壁组织DNA和脑组织DNA进行PCR扩增，结果为阴性，表明转染组织中不含RCR。光镜观察HyTK/ACV治疗14 d的大鼠颈动脉壁、心、脑、肾等组织结构正常，无炎性反应改变。
, http://www.100md.com
3 讨 论
3.1 逆转录病毒介导的HyTK基因转移及其安全性 本实验采用in vivo方法，用LNCHyTK病毒上清直接转染血管壁细胞，经PCR方法检测，证明TK基因转移成功。对被转染段血管及其远端脑组织的PCR检测结果，表明不含RCR，组织学观察HyTK/+ACV大鼠的脑、心、肾等脏器均未发现明显异常，提示LNCHyTK/+ACV方法是安全的，短期应用无明显毒副作用。
3.2 LNCHyTK/ACV对SMC增殖的抑制及其意义 本实验发现HyTK/ACV治疗14 d动脉壁新生I和I/M较对照组有明显减少，提示LNCHyTK/ACV能够抑制新生内膜的形成。透射电镜观察发现HSV1-TK/ACV治疗鼠颈动脉壁中存在SMC凋亡，提示诱发SMC凋亡可能是其抑制SMC增殖的方式之一。此与Barbee〔4〕的实验结果不同。我们认为恰当地选择转基因的时机，适当延长病毒上清与血管壁接触时间，短时间内重复转染，均有助于提高逆转录病毒载体的转染效率。
, http://www.100md.com
研究表明〔7〕颈动脉内膜切除术后2～3年出现的早期再狭窄主要表现为新生内膜中的纤维肌性增生及糖蛋白沉积；晚期再狭窄(术后2～3年后)则主要由AS成份组成，包括泡沫细胞、胆固醇斑、大量胶原纤维和钙化，其间夹杂有局灶性的内膜纤维肌性增生。因此，SMC增殖的影响贯穿再狭窄发生的始终，抑制VSMC的早期增殖，其意义不仅仅在于减少管壁的细胞数，还可能影响到随后出现的间质沉积、SMC的泡沫化、粥样斑块形成和钙化等〔8〕，目前这类研究仍在进行中。
3.3 HyTK/AVC对内皮细胞修复的影响 以往的实验发现，受损的动脉壁为新生内皮覆盖后，内膜中SMC的增殖即停止，其机制可能与内皮细胞产生NO有关〔10〕。我们观察到，至损伤后3 w，HyTK/+ACV鼠的动脉腔面仍无内皮细胞覆盖，推测是因为HyTK/+ACV同时抑制了内皮细胞的修复。与SMC相比，内皮细胞的再生能力十分低下，而LNCHyTK/ACV对具有活跃增殖能力的细胞具有选择性。同样条件下，血管壁中内皮细胞被LNCHyTK转染并被ACV杀死的可能性远远小于增殖活跃SMC。Gutzman〔11〕等人的实验表明，更昔洛韦治疗结束后内皮细胞的再生可以恢复，因此HyTK/ACV可能只是暂时影响内皮细胞修复，且程度不大。
, http://www.100md.com
作者简介：张英谦，女，35岁，主治医师，从事脑血管病研究
参考文献
1，Bauters C.Gene therapy for cardiovascular disease.Eur Heart J，1995；16(9)：1166
2，Jay A Fishman,Graeme B Ryan,Morris J Karnovsky.Endothelial regeneration in the rat carotid artery and significance of endothelial of myointimal thickenig.Lab Invest，1975；32(3)：339
3，Clowes AW，Clowes MM Reidy MA.Kinetics of cellular proliferation after arterial injury，I:Smooth muscle growth in the absence of endothelium.Lab Invest，1983；49：327
, http://www.100md.com
4，Barbee RW，Stapleton DD,Madras DE et al.Retroviral sucide vector does not inhibit neointimal growth in a porcine model of restenosis.Biochem Biophys Res Commun，1995；207：89
5，Franz F，Weidinger,James M Mclenachan,Myron I Cybulsky et al.Persistent dysfunction of regenerated endothelium after balloon angioplasty of rabbit iliac artery.Circulation，1990；81：1667
6，吴小兵，彭朝辉，徐 钤 et al.人乳头瘤病毒在大肠瘤中的检出.第一军医大学学报，1992；12：289
, 百拇医药
7，Philip J Rossi,Stuart L Myers,G Patrick Clagett.Reoperative approcaches for carotid restenosis.Seminars in Vascular Surg，1994；7(3)：195
8，张英谦，田时雨.平滑肌细胞和动脉粥样硬化.国外医学*老年医学分册，1997；6：243
9，Garg UC，Hassid A.Nitric oxide-generating vasodilition and 8-bromo-cyclic guanaine monophosphate inhibition mitogenesia and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells.J Clin Invest，1989；3：1774
10，Raul J Gutzman,Edward A Hirschowitz,Steven L Brody et al.In vivo supperssion of injury-induced vascular smooth muscle cell accumulation using adenovirus-mediated transfer of the herpes simples virus thymidine kinase gene.Proc Natl Acad Sci USA，1994；91：10732
收稿日期：1999-01-17
修回日期：1999-04-04, 百拇医药