CD44基因上皮源性亚型与造血源性亚型mRNA表达之比值与人大肠癌进展转移的关系
作者：高随宽 徐文怀 万远廉 高燕 肖宇 刘占兵
单位：高随宽(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；徐文怀(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；万远廉(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；高燕(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；肖宇(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)
关键词：结直肠癌；CD44基因；基因表达；多聚酶链反应
中国肿瘤临床000206
摘要 目的：CD44分子是多种细胞表面的跨膜糖蛋白。有研究表明其变异型如含V6、V8～10外显子的变异型表达增加与大肠癌进展转移有关。进一步探讨大肠癌组织表达的上皮源性亚型与造血源性亚型之比(E/H)与肿瘤转移等临床资料间的关系。方法：应用逆转录、多聚酶链反应和Southern杂交技术、检测26例大肠癌患者癌组织和正常大肠粘膜组织CD44mRNA表达，以上皮源性亚型与造血源性亚型之比(E/H)定量。结果：E/H值癌组织明显高于相应正常粘膜组织，但未发现与肿瘤转移、浸润深度等临床资料有关。结论：CD44上皮源性亚型mRNA在大肠癌组织中表达明显增高，E/H值与大肠肿瘤进展转移无明显相关性。上皮源性亚型在肿瘤进展转移中的作用有待深入研究。
, 百拇医药
Ratio of CD44 Epithelial Variant and CD44 Hematopoietic Variant as It Related to Progression and Metastasis of Human Colorectal Cancer
Gao Suikuan Xu Wenhuai Wan Yuanlian et al
(Department of Surgery, First Hospital, Beijing Medical University, Beijing )
Abstract Objective: CD44 molecule is a transmembrane glycoprotein expressed on various cell surface. Recent studies have shown that overexpression of some variant forms such as variants with exon 6 or 8～ 10 might be involved in tumor progression or metastasis in colorectal cancer. In this study, we determined the epithelial variant/hematopoietic variant (E/H- ratio) in human colorectal cancer and investigated its correlation with clinical features such as cancer metastasis. Methods: The expression of CD44 mRNA was examined in 52 specimens including cancers and adjacent noncancerous mucosa.In 26 patients with colorecxtal cancer, the E/H ratio was calculated to quantitate the level of the epithelial form by reverse transcription- polymerase chain reaction and Southern blot hybridization. Results: The E/H ratio in cancerous tissue was significantly higher than that in adjacent noncancerous mucosa;but significant correlations was not observed between the ratio and clinical features. Conclusion: Expression of CD44 epithelial form is obviously higher in colorectal cancer tissue than in matched normal mucosa.The E/H ratio is not associated with progression and metastasis in colorectal cancer. The role of CD44 variant forms in progression and metastasis of colorectal cancer needs to be elucidated.
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Key Words Colorectal cancer Gene CD44 PCR Expression
CD44分子是多种细胞均可表达的一种跨膜糖蛋白，具有多方面的功能，为循环淋巴细胞上的归巢受体，参与细胞与间质的相互作用，介导细胞与细胞的粘附。编码CD44分子细胞外功能区的外显子6～15，即变异性外显子1～10(简称V1～10)，可发生选择性剪接，因此CD44分子有多种亚型，其中主要有两类：一类是造血源性(hematopoietic)亚型即CD44H，中胚层和造血性细胞表达，V1～10不编码，分子量为95KD;另一类是上皮源性(epithelial)亚型即CD44E，也称变异型，正常上皮中弱表达，而在一些癌组织中高表达，分子量130～160KD，V1～10选择性编码[1,2]。我们探讨了一组大肠癌患者癌组织CD44E和CD44HmRNA表达之比与肿瘤转移等临床资料间的关系。
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1 材料与方法
26例大肠癌患者，男14例，女12例，平均年龄56岁。手术时取癌组织及远离肿瘤的正常粘膜组织，置液氮中保存。在本组病例中，A和B期15例，C和D期11例。复发癌2例，有肝转移者4例，有淋巴结转移者6例。肿瘤均为腺癌，中分化者23例，低分化者3例。浸润肌层者11例，浸润全层者13例。
采用盐酸胍苯酚一步法提取组织总RNA。逆转录反应体系含5μg总RNA，2.5μgOligo(dT)15，200IUM-MLV逆转录酶(Gibco)，共20μl，37℃温浴1h，合成cDNA。以cDNA为模板，P1和P2为引物做PCR，取PCR产物，行12g/L琼脂糖凝胶电泳，然后转移到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上。寡核苷酸P3在末端转移酶作用下标记上α-32P-dCTP，作为探针。预杂交、杂交、放射自显影，灰度扫描仪定量分析。统计学方法采用t检验。寡核苷酸P1、P2和P3的核苷酸序列为：P1:5′-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC-3′;P2:5′-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT-3′;P3:5′-CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC-3′。
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2 结果
应用PT-PCR扩增了CD44mRNA，PCR产物电泳及应用寡核苷酸探针进行Southern杂交，结果主要表现有2个主要片段。0.48kb大小PCR产物代表CD44H，0.88kb大小PCR产物主要代表CD44E。经灰度扫描，可计算出2个主要片段含量的比值(E/H)。CD44H在26例肿瘤及相应正常粘膜组织中均表达，而CD44E主要在肿瘤组织中表达(图1，2)。26例中有24例(92%)E/H值癌组织明显高于相应正常粘膜组织，而CD44E在少数10例(38%)正常粘膜组织中仅轻度表达。E/H平均值正常粘膜组织为0，肿瘤组织为1.4，肿瘤组织明显高于正常粘膜组织。A和B期肿瘤E/H为1.4±1.0，C和D期肿瘤E/H为1.4±0.9，二者间差异无统计学意义(P=NS);肿瘤浸润肌层者E/H为1.6±1.0，肿瘤浸润全层者E/H为1.3±0.9(P=NS);有肝或淋巴结转移者E/H为1.4±0.9，无转移者为1.4±1.0(P=NS)。4例肝转移者E/H均值为0.7，3例低分化腺癌E/H均值为1.2。
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图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外线下所见
N：正常粘膜组织;Ca：癌组织;LN：转移淋巴结
图2PCR产物Southern杂交结果
N：正常粘膜组织;Ca：癌组织;LN：转移淋巴结
3 讨论
CD44变异型在上皮性癌和非霍奇金淋巴瘤的进展转移过程中具有重要作用。人们分离到仅在小鼠自发性胰腺癌高转移细胞株表达的CD44亚型，把这种亚型转染到无明显转移能力的细胞株，结果这种细胞株发生了淋巴结肺转移[3]。CD44变异型转录水平在人大肠癌和乳腺癌中增高，并且有转移的病例比无转移的病例原发灶中CD44变异型转录增高更显著[4]。具有V6外显子的CD44亚型过表达的病例预后差[5]。V8～10表达增高与大肠癌肝转移有关[6]。有人研究胃癌，癌组织E/H值明显高于正常粘膜组织，并且E/H值与淋巴结转移、浸润深度、血管浸润、淋巴管浸润有关，被认为是判断胃癌进展的有用指标[7]。
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RT-PCR结合Southern杂交为分析CD44选择性剪接亚型较敏感的方法，并可用E/H值来定量上皮源性亚型表达水平。本实验表明CD44mRNA表达情况，大肠癌组织与正常粘膜组织明显不同。E/H值在肿瘤不同临床分期、有无转移、浸润深度方面无明显差别。E/H值在4例肝转移者不但没有增高，反而较低。3例低分化癌，E/H平均值较所有肿瘤组织E/H均值为低[8]。CD44基因表达在肿瘤发生发展过程中发生了明显变化，在多种肿瘤中得到证实。但是CD44基因结构、选择性剪接机制、不同器官组织中的表达方式等十分复杂，所以CD44基因表达在肿瘤发生发展中的意义和作用有待进一步研究。
(杨红欣校对)
刘占兵(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)
参考文献:
, 百拇医药
1，Screaton GR,Bell MV,Jackson DG,et al. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:12160
2，Stamenkovic I,Aruffo A,Amiot M，et al. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate- bearing cells. EMBO J,1991;10:343
3，Gunther U,Hofmann M,Rudy W,et al. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell,1991;65:13
, 百拇医药
4，Matsumura Y,Tarin D.Significance of CD44 gene products for cancer diagnosis and disease evaluation. Lancet,1992;340:1053
5，Mulder JWR,Kruyt PM,Sewnath M,et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon- v6- containing CD44 proteins. Lancet,1994;344:1470
6，Takeuchi K,Yamaguchi A,Urano T,et al. Expression of CD44 variant exons 8～ 10 in colorectal cancer and its relationship to metastasis. Jpn J Cancer Res,1995;86:292
, http://www.100md.com
7，Miwa T,Watanabe A,Yamada Y,et al. Progression in gastric carcinoma relative to the ratio of CD44 epithelial variant transcript to CD44 hematopoietic variant transcript. Cancer,1996;77:25
8，Imazeki F,Yokosuka O,Yamaguchi T,et al. Expression of variant CD44- messenger RNA in colorectal adenocarcinomas and adenomatous polyps in humans.Gastroenterology,1996;110:362
1999-03-25收稿, http://www.100md.com
单位：高随宽(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；徐文怀(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；万远廉(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；高燕(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)；肖宇(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)
关键词：结直肠癌；CD44基因；基因表达；多聚酶链反应
中国肿瘤临床000206
摘要 目的：CD44分子是多种细胞表面的跨膜糖蛋白。有研究表明其变异型如含V6、V8～10外显子的变异型表达增加与大肠癌进展转移有关。进一步探讨大肠癌组织表达的上皮源性亚型与造血源性亚型之比(E/H)与肿瘤转移等临床资料间的关系。方法：应用逆转录、多聚酶链反应和Southern杂交技术、检测26例大肠癌患者癌组织和正常大肠粘膜组织CD44mRNA表达，以上皮源性亚型与造血源性亚型之比(E/H)定量。结果：E/H值癌组织明显高于相应正常粘膜组织，但未发现与肿瘤转移、浸润深度等临床资料有关。结论：CD44上皮源性亚型mRNA在大肠癌组织中表达明显增高，E/H值与大肠肿瘤进展转移无明显相关性。上皮源性亚型在肿瘤进展转移中的作用有待深入研究。
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Ratio of CD44 Epithelial Variant and CD44 Hematopoietic Variant as It Related to Progression and Metastasis of Human Colorectal Cancer
Gao Suikuan Xu Wenhuai Wan Yuanlian et al
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Abstract Objective: CD44 molecule is a transmembrane glycoprotein expressed on various cell surface. Recent studies have shown that overexpression of some variant forms such as variants with exon 6 or 8～ 10 might be involved in tumor progression or metastasis in colorectal cancer. In this study, we determined the epithelial variant/hematopoietic variant (E/H- ratio) in human colorectal cancer and investigated its correlation with clinical features such as cancer metastasis. Methods: The expression of CD44 mRNA was examined in 52 specimens including cancers and adjacent noncancerous mucosa.In 26 patients with colorecxtal cancer, the E/H ratio was calculated to quantitate the level of the epithelial form by reverse transcription- polymerase chain reaction and Southern blot hybridization. Results: The E/H ratio in cancerous tissue was significantly higher than that in adjacent noncancerous mucosa;but significant correlations was not observed between the ratio and clinical features. Conclusion: Expression of CD44 epithelial form is obviously higher in colorectal cancer tissue than in matched normal mucosa.The E/H ratio is not associated with progression and metastasis in colorectal cancer. The role of CD44 variant forms in progression and metastasis of colorectal cancer needs to be elucidated.
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Key Words Colorectal cancer Gene CD44 PCR Expression
CD44分子是多种细胞均可表达的一种跨膜糖蛋白，具有多方面的功能，为循环淋巴细胞上的归巢受体，参与细胞与间质的相互作用，介导细胞与细胞的粘附。编码CD44分子细胞外功能区的外显子6～15，即变异性外显子1～10(简称V1～10)，可发生选择性剪接，因此CD44分子有多种亚型，其中主要有两类：一类是造血源性(hematopoietic)亚型即CD44H，中胚层和造血性细胞表达，V1～10不编码，分子量为95KD;另一类是上皮源性(epithelial)亚型即CD44E，也称变异型，正常上皮中弱表达，而在一些癌组织中高表达，分子量130～160KD，V1～10选择性编码[1,2]。我们探讨了一组大肠癌患者癌组织CD44E和CD44HmRNA表达之比与肿瘤转移等临床资料间的关系。
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1 材料与方法
26例大肠癌患者，男14例，女12例，平均年龄56岁。手术时取癌组织及远离肿瘤的正常粘膜组织，置液氮中保存。在本组病例中，A和B期15例，C和D期11例。复发癌2例，有肝转移者4例，有淋巴结转移者6例。肿瘤均为腺癌，中分化者23例，低分化者3例。浸润肌层者11例，浸润全层者13例。
采用盐酸胍苯酚一步法提取组织总RNA。逆转录反应体系含5μg总RNA，2.5μgOligo(dT)15，200IUM-MLV逆转录酶(Gibco)，共20μl，37℃温浴1h，合成cDNA。以cDNA为模板，P1和P2为引物做PCR，取PCR产物，行12g/L琼脂糖凝胶电泳，然后转移到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上。寡核苷酸P3在末端转移酶作用下标记上α-32P-dCTP，作为探针。预杂交、杂交、放射自显影，灰度扫描仪定量分析。统计学方法采用t检验。寡核苷酸P1、P2和P3的核苷酸序列为：P1:5′-GACACATATTGCTTCAATGCTTCAGC-3′;P2:5′-GATGCCAAGATGATCAGCCATTCTGGAAT-3′;P3:5′-CCTGAAGAAGATTGTACATCAGTCACAGAC-3′。
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应用PT-PCR扩增了CD44mRNA，PCR产物电泳及应用寡核苷酸探针进行Southern杂交，结果主要表现有2个主要片段。0.48kb大小PCR产物代表CD44H，0.88kb大小PCR产物主要代表CD44E。经灰度扫描，可计算出2个主要片段含量的比值(E/H)。CD44H在26例肿瘤及相应正常粘膜组织中均表达，而CD44E主要在肿瘤组织中表达(图1，2)。26例中有24例(92%)E/H值癌组织明显高于相应正常粘膜组织，而CD44E在少数10例(38%)正常粘膜组织中仅轻度表达。E/H平均值正常粘膜组织为0，肿瘤组织为1.4，肿瘤组织明显高于正常粘膜组织。A和B期肿瘤E/H为1.4±1.0，C和D期肿瘤E/H为1.4±0.9，二者间差异无统计学意义(P=NS);肿瘤浸润肌层者E/H为1.6±1.0，肿瘤浸润全层者E/H为1.3±0.9(P=NS);有肝或淋巴结转移者E/H为1.4±0.9，无转移者为1.4±1.0(P=NS)。4例肝转移者E/H均值为0.7，3例低分化腺癌E/H均值为1.2。
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N：正常粘膜组织;Ca：癌组织;LN：转移淋巴结
图2PCR产物Southern杂交结果
N：正常粘膜组织;Ca：癌组织;LN：转移淋巴结
3 讨论
CD44变异型在上皮性癌和非霍奇金淋巴瘤的进展转移过程中具有重要作用。人们分离到仅在小鼠自发性胰腺癌高转移细胞株表达的CD44亚型，把这种亚型转染到无明显转移能力的细胞株，结果这种细胞株发生了淋巴结肺转移[3]。CD44变异型转录水平在人大肠癌和乳腺癌中增高，并且有转移的病例比无转移的病例原发灶中CD44变异型转录增高更显著[4]。具有V6外显子的CD44亚型过表达的病例预后差[5]。V8～10表达增高与大肠癌肝转移有关[6]。有人研究胃癌，癌组织E/H值明显高于正常粘膜组织，并且E/H值与淋巴结转移、浸润深度、血管浸润、淋巴管浸润有关，被认为是判断胃癌进展的有用指标[7]。
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RT-PCR结合Southern杂交为分析CD44选择性剪接亚型较敏感的方法，并可用E/H值来定量上皮源性亚型表达水平。本实验表明CD44mRNA表达情况，大肠癌组织与正常粘膜组织明显不同。E/H值在肿瘤不同临床分期、有无转移、浸润深度方面无明显差别。E/H值在4例肝转移者不但没有增高，反而较低。3例低分化癌，E/H平均值较所有肿瘤组织E/H均值为低[8]。CD44基因表达在肿瘤发生发展过程中发生了明显变化，在多种肿瘤中得到证实。但是CD44基因结构、选择性剪接机制、不同器官组织中的表达方式等十分复杂，所以CD44基因表达在肿瘤发生发展中的意义和作用有待进一步研究。
(杨红欣校对)
刘占兵(北京医科大学第一医院普外科 北京市100034)
参考文献:
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1，Screaton GR,Bell MV,Jackson DG,et al. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:12160
2，Stamenkovic I,Aruffo A,Amiot M，et al. The hematopoietic and epithelial forms of CD44 are distinct polypeptides with different adhesion potentials for hyaluronate- bearing cells. EMBO J,1991;10:343
3，Gunther U,Hofmann M,Rudy W,et al. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell,1991;65:13
, 百拇医药
4，Matsumura Y,Tarin D.Significance of CD44 gene products for cancer diagnosis and disease evaluation. Lancet,1992;340:1053
5，Mulder JWR,Kruyt PM,Sewnath M,et al. Colorectal cancer prognosis and expression of exon- v6- containing CD44 proteins. Lancet,1994;344:1470
6，Takeuchi K,Yamaguchi A,Urano T,et al. Expression of CD44 variant exons 8～ 10 in colorectal cancer and its relationship to metastasis. Jpn J Cancer Res,1995;86:292
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7，Miwa T,Watanabe A,Yamada Y,et al. Progression in gastric carcinoma relative to the ratio of CD44 epithelial variant transcript to CD44 hematopoietic variant transcript. Cancer,1996;77:25
8，Imazeki F,Yokosuka O,Yamaguchi T,et al. Expression of variant CD44- messenger RNA in colorectal adenocarcinomas and adenomatous polyps in humans.Gastroenterology,1996;110:362
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