应用激光扫描共聚焦显微技术观察PDT导致癌细胞内钙水平的变化
作者：袁媛 周传农 李楠 陆庆国 王黎明
单位：袁媛 周传农(北京医科大学癌症所，北京 100021)；李楠 陆庆国 王黎明(解放军总医院仪器中心，北京 100853)
关键词：光动力治疗；钙离子；激光扫描共聚焦显微镜
军医进修学院学报000206 【摘要】目的：肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是现代癌症治疗中一种新的治疗法，为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法：用Fluo-3AM荧光探针负载培养的人肺腺癌GLC-82细胞，在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内Ca2+浓度的变化。结果：激光单独照射前后GLC-82细胞内Ca2+的浓度变化不大；在PDT作用下，激光照射前GLC-82细胞内Ca2+的浓度变化明显。结论：本方法灵敏、简单、快速，能实时监测细胞内游离钙的变化。
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中图号：R312 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0098-03
Changes of intracellular calcium level in GLC-82 cells induced by PDT: laser scanning confocal study
LI Nan,YUAN Yuan,LU Qing-guo,ZHOU Chuan-nong,WANG Li ming (Medical Experiment Analysis Center,PLA General Hospital,Beijing,100853 China)
【Abstract】 Objective:Photodynamic therapy (PDT) has become an important new modality in cancer treatment.In order to obtain a better understanding of the mechanisms of apoptpsis induced by PDT.Methods:Cultured GLC-82 cells were loaded with fluo-3/AM fluorescence probes,and the changes of intramyocytic Ca2+ concentration were examined by laser scanning confocal microscopy.Results:there were negligible changes of intracytoplasmic calcium concentration of GLC-82 cells after laser irradiation alone.There were remarkble changes of intracytoplasmic calcium concentration of GLC-82 cells after laser irradiation.Conclusion:it is sensitive,rapid,simple and most effective method for real-time quantitation of intracellular free calcium.
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Key words:photodynamic therapy (PDT); Ca2+; laser scanning confocal microscopy
肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是一种利用光敏剂和光辐射引起的光化学反应来杀伤和破坏肿瘤的一种方法[1,2]。光动力疗法杀伤肿瘤的体内作用机制比较复杂，至今还没有一种能普遍适用的完善解释。为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，并为临床上改进、提高疗效提供新的实验依据，笔者应用激光扫描共聚焦显微技术，选用人肺腺癌 GLC-82 细胞系作为研究对象，采用光敏剂血卟啉衍生物(hemaporphyrin Derivatve,HpD)观察HpD-PDT对GLC细胞内的Ca2+的作用。
1 材料和方法
1.1 激光扫描共聚焦显微镜原理[3] INSIGHT Plus激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian仪器公司出品)可以对活细胞的荧光强度实时定量检测。该仪器包括 200 mW 的激光器，激发 488 nm 的激光；OLYMPUS倒置显微镜；X-Y轴扫描载物台；Z轴步进马达控制器；冷电感耦合器件(cCCD)摄取荧光图像；光电倍增管PMT用于检测荧光信号；SONY监视器用于显示图像。
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1.2 试剂和仪器 ①荧光染料：Fluo-3 乙酰甲酯(Fluo-3AM)。Fluo-3AM用DMSO配制成 1 mmol/L 原液，-20 ℃ 冻存备用，美国Molecular Probe Inc产品。Pluronec-F127 (F127),用DMSO配制成 20% 溶液(W/V)，美国 Molecular Probe Inc产品。②激光扫描共聚焦显微镜：INSIGHT Plus美国Meridian仪器公司出品。③M-199:Sigma公司。④小牛血清：天津市生物制品厂。⑤血卟啉衍生物：扬洲生化制药厂。⑥无钙清洗液：含有 (mmol/L) NaCl 45,KCl 15,MgSO4 1,HePes 10，葡萄糖 10，pH 调至 7.4。
1.3 细胞培养 GLC-82 细胞系为人肺腺癌细胞系。M-199 培养基中加入 10% 的小牛血清，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 U/ml,37 ℃、5% CO2 条件下，细胞呈单层生长，待细胞长至布满瓶底的 80%～90% 时，用 1% TV消化，传代。
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1.4 荧光试剂的负载 细胞消化，离心，计数，接种浓度每孔 5000 个细胞，待进入指数增长期后，加HpD 12 h，荧光试剂Fluo-3AM的负载按参考文献方法进行[4]。待测细胞用培养基液洗 2 次，加入用M-199 稀释的 20 Fluo-3AM μmol/L 20 μl，并加入 20% F127 4 μl，于 37 ℃、5% CO2 条件下孵育 60 min。再用不含Ca2+、Mg2+的PBS洗 2 遍，即可用于观察。
1.5 激光扫描共聚焦显微镜的实时检测 将染好色的GLC-82 细胞样品置于载物台上，选择贴壁良好的细胞进行观察，确保在以后的照光和观察过程中细胞位置不变。在 40 倍长工作距离的物镜下，动态观察Fluo-3-/AM指示Ca2+的变化，在Time Series程序下，开始预扫描，调节扫描参数，以取得最大信号及最小光漂白和最佳信噪比。
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1.6 实验数据采集及处理测定 单纯He-Ne激光照射对GLC-82 细胞浆内游离钙的变化。数据采集间隔为 3s 1次，采集 5 次，测定静息状态下GLC-82 细胞浆内游离钙的水平后，每 15s 采集 1 次，共 4 次，在采集的间隔内给予光照，每次 15 s，共 45 次，照光计量 4 J/cm2，此后每 30 s 扫描 1 次，共 5 次。
测定PDT作用对GLC-82 细胞内游离钙的变化。首先进行基线扫描，间隔 10 s 一次，共 3 次，然后给予光照 3 次，每次 6 h；再给予光照 6 次，每次 30 s，在光照的间隙扫描，采集数据。照光结束后，扫描方式为：扫描 10 次，每次 30 s；扫描 15 次，每次 60 s。根据屏幕上动态显示细胞内与钙特异结合的 Fluo-3/AM 荧光强度的变化，后又决定追加扫描 3 次，其扫描方式为 20 s 20 次， 30 s 40 次，整修观察过程持续 50 min。
Fluo-3/AM与钙结合后，表现为荧光强度的增加。观察到的动态荧光强度变化，以伪彩色图象被微机高速逐帧存储。
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2 结 果
在本实验中，Fluo-3/AM负载的GLC-82 细胞用激光扫描共聚焦显微镜扫描，扫描图中细胞外型与倒置显微镜下所见相符。GLC -82 细胞单纯照光前后，其细胞浆内游离钙的水平并无显著变化，见图 1。
图1 激光扫描共聚焦显微镜检测单纯照光前后GLC-82
细胞细胞浆内游离钙水平的变化
GLC-82 细胞在PDT作用前后，其细胞浆内游离钙的水平有显著变化，见图 2。总体来看，这是一个较为缓慢的过程，但就单个细胞而言，有所不同。有些细胞的钙离子浓度变化很快，有些则缓慢，有些细胞钙离子浓度变化持续时间较长，而另一些则升高后迅速下降。从而使整个反应的持续时间较长，呈现“此起彼伏”的状态，实验中在PDT反应后曾扫描监测长达 1 h 之久，仍可看到新变化。
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图2 激光扫描共聚焦显微镜观察PDT作用后短期内
GLC-82细胞细胞浆内游离钙水平的变化
3 讨 论
本实验检测了PDT作用后细胞内钙的变化。发现PDT作用后细胞内钙的浓度有明显变化，且不同细胞内出现钙离子浓度变化的开始时间参差不同，有的早，有的晚；钙离子浓度升高的水平不一致，有的较高，有的较低；高钙状态维持的时间也长短不一。从连续采样扫描的结果来看，PDT作用使细胞浆内钙离子水平上升，维持一段时间后又恢复到原来的水平，是一个较慢的反应过程。出现这种现象的原因，可能与细胞处于不同周期有关，对外界刺激反应能力也不一样等。有文献报道，L5178 细胞应用光敏剂铝酞箐PDT作用后， 1～2 h 内迅速诱导大量的DNA片段化，从而引起细胞凋亡。通过对荧光染料indo-1 与钙的复合物的识别，发现胞内离子水平的升高在照光开始后就被启动了，照光后 40～60 s 达到最大值，数分钟内又回到基值。我们因经验不足和手段有限，未能检测到PDT作用极早期的细胞内钙的变化，不排除早期钙上升过又下降的可能。但本实验中观察到钙的缓慢变化，是否与GLC-82 细胞受PDT作用后较慢的凋亡过程相关？有待深入研究。
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钙离子是胞内重要的第二信使，准确了解静息和受刺激时细胞内钙的水平，对于确定钙离子在刺激-反应偶联中作用至为重要。自从美籍华人科学家钱氏于 80 年代初合成第一代钙荧光探针Quin-2 以来，钱氏继续研制成功能用于双波长比例测定的第二代钙荧光探针indo-1 和fura-2，之后又合成了不需紫外激发的fluo-3 第一系列第三代钙荧光探针。这些钙荧光探针以钙螯合剂EGTA为基础合成，有相同的钙结合部位羰基，与钙结合后即有荧光变化，从而可测定钙的变化。
本实验所采用的荧光染料Fluo-3/AM为单一激发波长 480 nm 的荧光染料，与细胞内游离钙结合， 530 nm 处荧光强度明显加强，达基础值的 40 倍，与其他的荧光染料相比，更利于钙离子浓度的测定。此外，本实验所采用的激光扫描共聚焦显微镜为狭缝扫描方式，较其他扫描方式的激光扫描共聚焦显微镜采集数据更为准确、迅速。
作者简介：李楠，女，1967-11-09生，汉族，1993年后勤工程学院仪器分析专业硕士毕业；主编科技专著2部，发表论文15篇。电话：(010)66937199
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参考文献
1，Manyak MJ,Russo A,Smith PD et al.Photodynamic therapy[J].J Oncol,1988,6:380-391.
2，Dougherty TJ,Marcus SL.Photodynamic therapy[J].Eur J Cancer,1992,28a:1734-1742.
3，李 楠，尹 玲，苏振轮.激光扫描共聚焦显微术[M].北京：人民军医出版社，1997，85-100.
4，李 楠，王俊玫，杨 军.激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙的方法[J].中国体视学与图像分析，1997，2(3)：188.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-11-24, 百拇医药
单位：袁媛 周传农(北京医科大学癌症所，北京 100021)；李楠 陆庆国 王黎明(解放军总医院仪器中心，北京 100853)
关键词：光动力治疗；钙离子；激光扫描共聚焦显微镜
军医进修学院学报000206 【摘要】目的：肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是现代癌症治疗中一种新的治疗法，为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。方法：用Fluo-3AM荧光探针负载培养的人肺腺癌GLC-82细胞，在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内Ca2+浓度的变化。结果：激光单独照射前后GLC-82细胞内Ca2+的浓度变化不大；在PDT作用下，激光照射前GLC-82细胞内Ca2+的浓度变化明显。结论：本方法灵敏、简单、快速，能实时监测细胞内游离钙的变化。
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中图号：R312 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0098-03
Changes of intracellular calcium level in GLC-82 cells induced by PDT: laser scanning confocal study
LI Nan,YUAN Yuan,LU Qing-guo,ZHOU Chuan-nong,WANG Li ming (Medical Experiment Analysis Center,PLA General Hospital,Beijing,100853 China)
【Abstract】 Objective:Photodynamic therapy (PDT) has become an important new modality in cancer treatment.In order to obtain a better understanding of the mechanisms of apoptpsis induced by PDT.Methods:Cultured GLC-82 cells were loaded with fluo-3/AM fluorescence probes,and the changes of intramyocytic Ca2+ concentration were examined by laser scanning confocal microscopy.Results:there were negligible changes of intracytoplasmic calcium concentration of GLC-82 cells after laser irradiation alone.There were remarkble changes of intracytoplasmic calcium concentration of GLC-82 cells after laser irradiation.Conclusion:it is sensitive,rapid,simple and most effective method for real-time quantitation of intracellular free calcium.
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Key words:photodynamic therapy (PDT); Ca2+; laser scanning confocal microscopy
肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是一种利用光敏剂和光辐射引起的光化学反应来杀伤和破坏肿瘤的一种方法[1,2]。光动力疗法杀伤肿瘤的体内作用机制比较复杂，至今还没有一种能普遍适用的完善解释。为了更好地认识光动力诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，并为临床上改进、提高疗效提供新的实验依据，笔者应用激光扫描共聚焦显微技术，选用人肺腺癌 GLC-82 细胞系作为研究对象，采用光敏剂血卟啉衍生物(hemaporphyrin Derivatve,HpD)观察HpD-PDT对GLC细胞内的Ca2+的作用。
1 材料和方法
1.1 激光扫描共聚焦显微镜原理[3] INSIGHT Plus激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian仪器公司出品)可以对活细胞的荧光强度实时定量检测。该仪器包括 200 mW 的激光器，激发 488 nm 的激光；OLYMPUS倒置显微镜；X-Y轴扫描载物台；Z轴步进马达控制器；冷电感耦合器件(cCCD)摄取荧光图像；光电倍增管PMT用于检测荧光信号；SONY监视器用于显示图像。
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1.2 试剂和仪器 ①荧光染料：Fluo-3 乙酰甲酯(Fluo-3AM)。Fluo-3AM用DMSO配制成 1 mmol/L 原液，-20 ℃ 冻存备用，美国Molecular Probe Inc产品。Pluronec-F127 (F127),用DMSO配制成 20% 溶液(W/V)，美国 Molecular Probe Inc产品。②激光扫描共聚焦显微镜：INSIGHT Plus美国Meridian仪器公司出品。③M-199:Sigma公司。④小牛血清：天津市生物制品厂。⑤血卟啉衍生物：扬洲生化制药厂。⑥无钙清洗液：含有 (mmol/L) NaCl 45,KCl 15,MgSO4 1,HePes 10，葡萄糖 10，pH 调至 7.4。
1.3 细胞培养 GLC-82 细胞系为人肺腺癌细胞系。M-199 培养基中加入 10% 的小牛血清，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 U/ml,37 ℃、5% CO2 条件下，细胞呈单层生长，待细胞长至布满瓶底的 80%～90% 时，用 1% TV消化，传代。
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1.4 荧光试剂的负载 细胞消化，离心，计数，接种浓度每孔 5000 个细胞，待进入指数增长期后，加HpD 12 h，荧光试剂Fluo-3AM的负载按参考文献方法进行[4]。待测细胞用培养基液洗 2 次，加入用M-199 稀释的 20 Fluo-3AM μmol/L 20 μl，并加入 20% F127 4 μl，于 37 ℃、5% CO2 条件下孵育 60 min。再用不含Ca2+、Mg2+的PBS洗 2 遍，即可用于观察。
1.5 激光扫描共聚焦显微镜的实时检测 将染好色的GLC-82 细胞样品置于载物台上，选择贴壁良好的细胞进行观察，确保在以后的照光和观察过程中细胞位置不变。在 40 倍长工作距离的物镜下，动态观察Fluo-3-/AM指示Ca2+的变化，在Time Series程序下，开始预扫描，调节扫描参数，以取得最大信号及最小光漂白和最佳信噪比。
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1.6 实验数据采集及处理测定 单纯He-Ne激光照射对GLC-82 细胞浆内游离钙的变化。数据采集间隔为 3s 1次，采集 5 次，测定静息状态下GLC-82 细胞浆内游离钙的水平后，每 15s 采集 1 次，共 4 次，在采集的间隔内给予光照，每次 15 s，共 45 次，照光计量 4 J/cm2，此后每 30 s 扫描 1 次，共 5 次。
测定PDT作用对GLC-82 细胞内游离钙的变化。首先进行基线扫描，间隔 10 s 一次，共 3 次，然后给予光照 3 次，每次 6 h；再给予光照 6 次，每次 30 s，在光照的间隙扫描，采集数据。照光结束后，扫描方式为：扫描 10 次，每次 30 s；扫描 15 次，每次 60 s。根据屏幕上动态显示细胞内与钙特异结合的 Fluo-3/AM 荧光强度的变化，后又决定追加扫描 3 次，其扫描方式为 20 s 20 次， 30 s 40 次，整修观察过程持续 50 min。
Fluo-3/AM与钙结合后，表现为荧光强度的增加。观察到的动态荧光强度变化，以伪彩色图象被微机高速逐帧存储。
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2 结 果
在本实验中，Fluo-3/AM负载的GLC-82 细胞用激光扫描共聚焦显微镜扫描，扫描图中细胞外型与倒置显微镜下所见相符。GLC -82 细胞单纯照光前后，其细胞浆内游离钙的水平并无显著变化，见图 1。
图1 激光扫描共聚焦显微镜检测单纯照光前后GLC-82
细胞细胞浆内游离钙水平的变化
GLC-82 细胞在PDT作用前后，其细胞浆内游离钙的水平有显著变化，见图 2。总体来看，这是一个较为缓慢的过程，但就单个细胞而言，有所不同。有些细胞的钙离子浓度变化很快，有些则缓慢，有些细胞钙离子浓度变化持续时间较长，而另一些则升高后迅速下降。从而使整个反应的持续时间较长，呈现“此起彼伏”的状态，实验中在PDT反应后曾扫描监测长达 1 h 之久，仍可看到新变化。
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图2 激光扫描共聚焦显微镜观察PDT作用后短期内
GLC-82细胞细胞浆内游离钙水平的变化
3 讨 论
本实验检测了PDT作用后细胞内钙的变化。发现PDT作用后细胞内钙的浓度有明显变化，且不同细胞内出现钙离子浓度变化的开始时间参差不同，有的早，有的晚；钙离子浓度升高的水平不一致，有的较高，有的较低；高钙状态维持的时间也长短不一。从连续采样扫描的结果来看，PDT作用使细胞浆内钙离子水平上升，维持一段时间后又恢复到原来的水平，是一个较慢的反应过程。出现这种现象的原因，可能与细胞处于不同周期有关，对外界刺激反应能力也不一样等。有文献报道，L5178 细胞应用光敏剂铝酞箐PDT作用后， 1～2 h 内迅速诱导大量的DNA片段化，从而引起细胞凋亡。通过对荧光染料indo-1 与钙的复合物的识别，发现胞内离子水平的升高在照光开始后就被启动了，照光后 40～60 s 达到最大值，数分钟内又回到基值。我们因经验不足和手段有限，未能检测到PDT作用极早期的细胞内钙的变化，不排除早期钙上升过又下降的可能。但本实验中观察到钙的缓慢变化，是否与GLC-82 细胞受PDT作用后较慢的凋亡过程相关？有待深入研究。
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钙离子是胞内重要的第二信使，准确了解静息和受刺激时细胞内钙的水平，对于确定钙离子在刺激-反应偶联中作用至为重要。自从美籍华人科学家钱氏于 80 年代初合成第一代钙荧光探针Quin-2 以来，钱氏继续研制成功能用于双波长比例测定的第二代钙荧光探针indo-1 和fura-2，之后又合成了不需紫外激发的fluo-3 第一系列第三代钙荧光探针。这些钙荧光探针以钙螯合剂EGTA为基础合成，有相同的钙结合部位羰基，与钙结合后即有荧光变化，从而可测定钙的变化。
本实验所采用的荧光染料Fluo-3/AM为单一激发波长 480 nm 的荧光染料，与细胞内游离钙结合， 530 nm 处荧光强度明显加强，达基础值的 40 倍，与其他的荧光染料相比，更利于钙离子浓度的测定。此外，本实验所采用的激光扫描共聚焦显微镜为狭缝扫描方式，较其他扫描方式的激光扫描共聚焦显微镜采集数据更为准确、迅速。
作者简介：李楠，女，1967-11-09生，汉族，1993年后勤工程学院仪器分析专业硕士毕业；主编科技专著2部，发表论文15篇。电话：(010)66937199
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参考文献
1，Manyak MJ,Russo A,Smith PD et al.Photodynamic therapy[J].J Oncol,1988,6:380-391.
2，Dougherty TJ,Marcus SL.Photodynamic therapy[J].Eur J Cancer,1992,28a:1734-1742.
3，李 楠，尹 玲，苏振轮.激光扫描共聚焦显微术[M].北京：人民军医出版社，1997，85-100.
4，李 楠，王俊玫，杨 军.激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙的方法[J].中国体视学与图像分析，1997，2(3)：188.
收稿日期：1999-10-21
修回日期：1999-11-24, 百拇医药