磷脂酶A2激活介导中性粒细胞凋亡
作者：颜光涛 郝秀华 辛宏 王录焕 李英丽
单位：解放军总医院基础医学研究所生化室，北京 100853
关键词：磷酯酶A2；中性粒细胞；细胞凋亡
军医进修学院学报000205 【摘要】目的：探讨磷脂酶A2(PLA2)活性的变化对中性粒细胞凋亡的影响。方法：采用光镜、电镜、DNA电泳和FACS等方法，分析了磷脂酶A2内外源性激活剂和抑制剂对大鼠中性粒细胞凋亡的影响。结果：脂多糖(LPS 1μg/ml)和钙离子载体(A23187 1 μmol/L)等PLA2激动剂分别在共同培养6 h和12 h之内促进中性粒细胞凋亡，而PLA2阻断剂4-溴苯甲酰溴甲烷(p-BPB 0.01～1 mmol/L)可明显减弱上述激动剂的促凋亡作用。但另一种PLA2非特异性抑制剂氯喹和血小板激活因子受体拮抗剂SR27417A则无上述相同的作用。结论：结果表明PLA2激活可促进中性粒细胞凋亡过程，但该过程可能同PLA2的代谢产物血小板激活因子的直接作用无关。
, http://www.100md.com
中图号：R329 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0095-03
Phospholipose A2 Activation mediate neutrophil apoptosis
YAN Guang-tao,HAO Xiu-hua,XIN Hong,WANG Lu-huan,LI Yi-li
(Biochemistry Lab,Basic Medicine Inst,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To demonstrate the role of phospholipase A2 activity (PLA2) on the apoptosis of neutrophiles.Methods:The effect of PLA2 activity on neutrophil apoptosis was investigated by light,electron microscopy,DNA agarose electrophoresis and flow cytometry analysis.Results:The results showed that the apoptosis of neutrophiles was promoted by the treatment of 1 μg/ml LPS and 1 μm A23187,in 6 hours and 12 hours respectively.The apoptosis of neutrophil was markedly delayed by a PLA2 inhibitor,4-bromophanacyl bromid (p-BPB 0.01～1 mM).Chloroquine,another PLA2 inhibitor or SR27417A,a PAF receptor antagonist,were found without such an effect as p-BPB on neutrophil apoptosis.Conclusion:Results suggested that the neutrophile apoptosis may be promoted by phospholipase A2 activation,but this process may not be related with PAF,one of the important metabolites of PLA2.
, 百拇医药
Key words:phospholipase A2；neutrophil;apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)区别于坏死，它是一种机体保持内环境稳定的特殊方式。正常情况下，中性粒细胞(PMN)绝大部分通过凋亡而被清除，避免因坏死而造成组织损伤[1]。我们在研究磷脂酶 A2(PLA2)激活介导创伤和感染的机制时，发现 PLA2 活性介导TNF对PMN的激发作用[2]。由于大量证据显示 PLA2 及其代谢产物在细胞凋亡过程中发挥作用[3]，我们推测 PLA2 活性对PMN凋亡或坏死的影响，可能是控制炎症反应的主要途径。这方面的工作尚少见，本文初步报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料和试剂 雄性维斯它大鼠由本院动物中心提供。PI、p-BPB(4-bromophenacyl bromide)、A23187、Chloroquine、PAF等均为sigma产品，PAF受体阻断剂SR27417A为法国Herbert FM教授馈赠。
1.2 PMN分离 按文献进行[2]。
1.3 PMN凋亡诱导 采用 1% FCS-RPMI 1640,37 ℃，5% CO2 常规培养，新分离PMN为正常，观察药效时加入不同的 PLA2 激动剂(LPS或A23187)和抑制剂(p-BPB,Chloroquine,SR27417A)共同培养 20 h。
1.4 PMN凋亡形态分析 采用姬姆萨染色和透射电镜。
, 百拇医药
1.5 流式细胞分析 1×106 PMN经 70% 乙醇于 4 ℃ 过夜固定，染色前将细胞悬于PBS，加RNA酶至终浓度 100 μg/ml，避光保持 30 min 后测定细胞DNA，观察G1 峰前的二倍体亚峰并计算其百分数。
1.6 DNA电泳 1×106 PMN加 0.7 ml 裂解液(TE内含 1% SDS，蛋白酶K 100 μg/ml pH 8.0)，50 ℃ 水浴 2 h；酚提取、乙醇沉淀 DNA。 20 μl TE(含 100 μg/ml RNAse A)溶解DNA，置 37 ℃ 30 min 后，-20 ℃ 贮存。每次 3 μl 上述DNA样品加适量上样缓冲液后走 1.8% 琼酯电泳。本文实验结果均重复 3 次，取其代表性结果列出。
2 结 果
2.1 PMN自发性凋亡 流式细胞仪显示PMN在体外常规培养下凋亡逐渐增多，G1 峰出现前特有的二倍体亚峰(AP峰)，经光镜和电镜证实细胞皱缩、核固缩，DNA电泳出现“梯形”如附表和图 1，图 2 所示。
, 百拇医药
附表 流式细胞仪分析LPS和A23187对中性
粒细胞凋亡的影响 时间(h)
凋亡PMN(%)
Control**
LPS**
A23187**
3
2.1
8.5*
16.1*
, 百拇医药
6
10.1
20.9*
21.8*
9
17.0
18.8
26.7*
12
20.2
21.3
25.0*
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20
47.4
45.3
48.5
经U检验，同对照比较，*P<0.01；方差分析显示组间**P<0.01
图1 LPS(1μg/ml)和A23187(1μmol/L)，在体外培养中对
中性粒细胞凋亡的作用
同0h比较，*P<0.01
2.2 体外LPS和 A23187 对PMN凋亡的影响 LPS和 A23187 分别与PMN培养 20 h，凋亡细胞比例同对照组比较并不增加。但二者可分别在培养 6 和 12 h 之内增加PMN凋亡的数量。LPS和 A23187 可使PMN自发性凋亡提前如附表和图 1 所示。
, 百拇医药
图2 中性粒凋亡的凝胶电泳DNA梯形图
1～2分别为DNA标准、0h、20h、LPS、LPS加PBPB、A23187、A23187加PBPB、氯喹(1μmol/L)、PBPB(1μmol/L)、PAF(10ng/ml)、PAF加SR27417A(1μg/ml)及剪切后的正常细胞DNA
2.3 PLA2 阻断剂和SR27417对PMN自发性凋亡的影响 共同培养 20 h，PLA2 阻断剂P-BPB剂量相关性地阻断PMN凋亡，表现为细胞AP峰细胞群比例减少，DNA“梯形”消失。PLA2 的另一种阻断剂氯喹和血小板活化因子(PAF)受体阻断剂SR27417A却不能阻断PMN的自发性凋亡。如图 2 所示。
2.4 p-BPB对LPS和A23187促进PMN凋亡的影响 流式细胞仪分析发现p-BPB阻断LPS和A23187的促进凋亡作用，AP峰细胞群减少，DNA电泳“梯形”消失。如图 3 和 2 所示。
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图3 p-BPB(10μmol/L)对不同因素所致PMN凋亡的
影响
其中A为0h，B为20h对照，C为p-BPB，D为LPS(1μg/ml)，E为LPS+p-BPB，F为A23187(1μmol/L)，J为A23187+p-BPB，同A比较，*P<0.01
3 讨 论
PMN是机体防御反应的主要细胞，在清除病菌异物的同时，也造成对周围正常组织的损伤。PMN通过自发性凋亡而清除，可避免因坏死而造成炎症反应。研究表明，在体内外各种因素作用下PMN凋亡和坏死(激活)的平衡，对炎症反应的结局有重要影响[8]。
在体外培养时，我们发现PMN自发性凋亡可被 PLA2 激动剂LPS和 A23187 所促进，但共同培养 20 h 后，并不增加自发性凋亡的数量。提示由 PLA2 激活可能介入PMN早期的凋亡启动过程，并为外源性炎症介质或内源性Ca2+离子增加所致。PLA2 阻断剂p-BPB可完全阻断LPS和 A23187 的上述作用，也强烈支持这种观点。
, 百拇医药
有研究显示， A23187 通过增加胞内钙离子促进细胞凋亡过程[3]。但Osamu又报道LPS可阻断PMN自发性或TNF诱导性凋亡。推测其原因，可能同PMN纯度较低 (93%)，含有大量单核淋巴细胞，受LPS刺激后产生多量细胞因子，如 IL-1、IL-6 和 IL-8等阻碍PMN凋亡有关[4]。Agarwal的报道同我们结果相似，证明p-BPB和磷酯酶C的阻断剂 U73122 可阻断光诱导的淋巴瘤细胞的凋亡和DNA“梯形”出现，而环氧化物酶抑制剂消炎痛不能产生相同效应[5]。
研究结果显示 PLA2 代谢产物之一PAF的受体阻断剂并不能阻断PMN的自发性凋亡，提示前列腺素类或PAF同PMN的凋亡没有直接关系。p-BPB不仅阻断 PLA2 介导的胸腺细胞凋亡，也阻断蛋白激酶C激动剂佛波脂(PMA)介导的胸腺细胞凋亡，提示 PLA2 和蛋白激酶C之间的相互依赖关系[3]。表明 PLA2 可能是胞内凋亡信号传导中的一部分。
, http://www.100md.com
LPS和 A23187 可间接促进 PLA2 活性，是普遍使用的 PLA2 激活因子[7]。在预实验中采用 PLA2 和峰毒肽激发PMN，结果同文献[8]报道相同，大部分PMN出现坏死而不是凋亡。坏死PMN之DNA断裂破碎，电泳出现弥散状碎片。因此我们采用LPS和 A23187 作为 PLA2 激动剂。二种 PLA2 抑制剂对凋亡的不同效应，可能同其作用位点和机制不同有关。p-BPB是一种强烷化剂，直接作用于酶的活性中心位点，而氯喹则阻断酶和底物的结合或稳定细胞膜[9]。PLA2 非特异抑制剂糖皮质激素也可阻断人PMN的凋亡过程，在炎症的发生发展中有重要意义[8]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770716)
, 百拇医药
作者简介：颜光涛，男，1960年生，四川宜宾市人，1983年华西医科大学毕业，解放军总医院基础医学研究所生化研究室主任，研究员；发表论文40篇。电话：(010)66935272
参考文献
1，Savill FS,Henson PM,Haslett C.Phagocytosis of aged Human neutrophils by macrophages is mediated by a novel "charge-sensitive" recongnition mechanism[J].J Clin Invest,1989,84:1518-1523.
2，颜光涛，郝秀华，李振甲.磷酯酶A2介导肿瘤坏死因子诱发的中性粒细胞趋化和粘附增强[J].生理学报，1995，47：544-551.
, 百拇医药 3，Vera VS,Oksana RO,Lazar KH et al.Dependence of thymocytes apoptosis on protein kinase C and phosphotipase A2[J].FEBS Letters,1994,348:317-319.
4，Osamu H,Yuji T,Hiroaki M et al.Inhibition by bacterial lipopolysaccharide of spontaneous and TNF a induced human neutrophil apoptosis in vitro[J].Microbiol Immunol,1995,39(9):715-723.
5，Agarwal ML,Larkin HE,Zaide SIA et al.Phospholipase activation triggers apoptosis in photosinsitized mouse lymphoma cels[J].Cancer Research,1993,53:5897-5902.
, 百拇医药
6，Forehand JR,Johnston RB,John SB et al.Phospholipase A2 activity in human neutrophils[J].J Lmmunol,1993,151(9):4918-4925.
7，Shaposhnikova VV,Egorova MV,Kudryavtse AA.The effect of melittin on proliferation and death of thymocytes[J].FEBS Letters,1997,410:285-288.
8，Zidovetzki R,Sherman IW,Cardenas M,et al.Chloroquine stabilization of phospholipide membranes agains diacy-glycerol induced pertubation[J].Bichem Pharmacol,1993,45:183-189.
9，Cox G.Glucocorticorid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils[J].J Immunol,1995,54:4719-4725.
收稿日期：1999-11-23
修回日期：1999-12-10, 百拇医药
单位：解放军总医院基础医学研究所生化室，北京 100853
关键词：磷酯酶A2；中性粒细胞；细胞凋亡
军医进修学院学报000205 【摘要】目的：探讨磷脂酶A2(PLA2)活性的变化对中性粒细胞凋亡的影响。方法：采用光镜、电镜、DNA电泳和FACS等方法，分析了磷脂酶A2内外源性激活剂和抑制剂对大鼠中性粒细胞凋亡的影响。结果：脂多糖(LPS 1μg/ml)和钙离子载体(A23187 1 μmol/L)等PLA2激动剂分别在共同培养6 h和12 h之内促进中性粒细胞凋亡，而PLA2阻断剂4-溴苯甲酰溴甲烷(p-BPB 0.01～1 mmol/L)可明显减弱上述激动剂的促凋亡作用。但另一种PLA2非特异性抑制剂氯喹和血小板激活因子受体拮抗剂SR27417A则无上述相同的作用。结论：结果表明PLA2激活可促进中性粒细胞凋亡过程，但该过程可能同PLA2的代谢产物血小板激活因子的直接作用无关。
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中图号：R329 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0095-03
Phospholipose A2 Activation mediate neutrophil apoptosis
YAN Guang-tao,HAO Xiu-hua,XIN Hong,WANG Lu-huan,LI Yi-li
(Biochemistry Lab,Basic Medicine Inst,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To demonstrate the role of phospholipase A2 activity (PLA2) on the apoptosis of neutrophiles.Methods:The effect of PLA2 activity on neutrophil apoptosis was investigated by light,electron microscopy,DNA agarose electrophoresis and flow cytometry analysis.Results:The results showed that the apoptosis of neutrophiles was promoted by the treatment of 1 μg/ml LPS and 1 μm A23187,in 6 hours and 12 hours respectively.The apoptosis of neutrophil was markedly delayed by a PLA2 inhibitor,4-bromophanacyl bromid (p-BPB 0.01～1 mM).Chloroquine,another PLA2 inhibitor or SR27417A,a PAF receptor antagonist,were found without such an effect as p-BPB on neutrophil apoptosis.Conclusion:Results suggested that the neutrophile apoptosis may be promoted by phospholipase A2 activation,but this process may not be related with PAF,one of the important metabolites of PLA2.
, 百拇医药
Key words:phospholipase A2；neutrophil;apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)区别于坏死，它是一种机体保持内环境稳定的特殊方式。正常情况下，中性粒细胞(PMN)绝大部分通过凋亡而被清除，避免因坏死而造成组织损伤[1]。我们在研究磷脂酶 A2(PLA2)激活介导创伤和感染的机制时，发现 PLA2 活性介导TNF对PMN的激发作用[2]。由于大量证据显示 PLA2 及其代谢产物在细胞凋亡过程中发挥作用[3]，我们推测 PLA2 活性对PMN凋亡或坏死的影响，可能是控制炎症反应的主要途径。这方面的工作尚少见，本文初步报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料和试剂 雄性维斯它大鼠由本院动物中心提供。PI、p-BPB(4-bromophenacyl bromide)、A23187、Chloroquine、PAF等均为sigma产品，PAF受体阻断剂SR27417A为法国Herbert FM教授馈赠。
1.2 PMN分离 按文献进行[2]。
1.3 PMN凋亡诱导 采用 1% FCS-RPMI 1640,37 ℃，5% CO2 常规培养，新分离PMN为正常，观察药效时加入不同的 PLA2 激动剂(LPS或A23187)和抑制剂(p-BPB,Chloroquine,SR27417A)共同培养 20 h。
1.4 PMN凋亡形态分析 采用姬姆萨染色和透射电镜。
, 百拇医药
1.5 流式细胞分析 1×106 PMN经 70% 乙醇于 4 ℃ 过夜固定，染色前将细胞悬于PBS，加RNA酶至终浓度 100 μg/ml，避光保持 30 min 后测定细胞DNA，观察G1 峰前的二倍体亚峰并计算其百分数。
1.6 DNA电泳 1×106 PMN加 0.7 ml 裂解液(TE内含 1% SDS，蛋白酶K 100 μg/ml pH 8.0)，50 ℃ 水浴 2 h；酚提取、乙醇沉淀 DNA。 20 μl TE(含 100 μg/ml RNAse A)溶解DNA，置 37 ℃ 30 min 后，-20 ℃ 贮存。每次 3 μl 上述DNA样品加适量上样缓冲液后走 1.8% 琼酯电泳。本文实验结果均重复 3 次，取其代表性结果列出。
2 结 果
2.1 PMN自发性凋亡 流式细胞仪显示PMN在体外常规培养下凋亡逐渐增多，G1 峰出现前特有的二倍体亚峰(AP峰)，经光镜和电镜证实细胞皱缩、核固缩，DNA电泳出现“梯形”如附表和图 1，图 2 所示。
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附表 流式细胞仪分析LPS和A23187对中性
粒细胞凋亡的影响 时间(h)
凋亡PMN(%)
Control**
LPS**
A23187**
3
2.1
8.5*
16.1*
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6
10.1
20.9*
21.8*
9
17.0
18.8
26.7*
12
20.2
21.3
25.0*
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20
47.4
45.3
48.5
经U检验，同对照比较，*P<0.01；方差分析显示组间**P<0.01
图1 LPS(1μg/ml)和A23187(1μmol/L)，在体外培养中对
中性粒细胞凋亡的作用
同0h比较，*P<0.01
2.2 体外LPS和 A23187 对PMN凋亡的影响 LPS和 A23187 分别与PMN培养 20 h，凋亡细胞比例同对照组比较并不增加。但二者可分别在培养 6 和 12 h 之内增加PMN凋亡的数量。LPS和 A23187 可使PMN自发性凋亡提前如附表和图 1 所示。
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图2 中性粒凋亡的凝胶电泳DNA梯形图
1～2分别为DNA标准、0h、20h、LPS、LPS加PBPB、A23187、A23187加PBPB、氯喹(1μmol/L)、PBPB(1μmol/L)、PAF(10ng/ml)、PAF加SR27417A(1μg/ml)及剪切后的正常细胞DNA
2.3 PLA2 阻断剂和SR27417对PMN自发性凋亡的影响 共同培养 20 h，PLA2 阻断剂P-BPB剂量相关性地阻断PMN凋亡，表现为细胞AP峰细胞群比例减少，DNA“梯形”消失。PLA2 的另一种阻断剂氯喹和血小板活化因子(PAF)受体阻断剂SR27417A却不能阻断PMN的自发性凋亡。如图 2 所示。
2.4 p-BPB对LPS和A23187促进PMN凋亡的影响 流式细胞仪分析发现p-BPB阻断LPS和A23187的促进凋亡作用，AP峰细胞群减少，DNA电泳“梯形”消失。如图 3 和 2 所示。
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图3 p-BPB(10μmol/L)对不同因素所致PMN凋亡的
影响
其中A为0h，B为20h对照，C为p-BPB，D为LPS(1μg/ml)，E为LPS+p-BPB，F为A23187(1μmol/L)，J为A23187+p-BPB，同A比较，*P<0.01
3 讨 论
PMN是机体防御反应的主要细胞，在清除病菌异物的同时，也造成对周围正常组织的损伤。PMN通过自发性凋亡而清除，可避免因坏死而造成炎症反应。研究表明，在体内外各种因素作用下PMN凋亡和坏死(激活)的平衡，对炎症反应的结局有重要影响[8]。
在体外培养时，我们发现PMN自发性凋亡可被 PLA2 激动剂LPS和 A23187 所促进，但共同培养 20 h 后，并不增加自发性凋亡的数量。提示由 PLA2 激活可能介入PMN早期的凋亡启动过程，并为外源性炎症介质或内源性Ca2+离子增加所致。PLA2 阻断剂p-BPB可完全阻断LPS和 A23187 的上述作用，也强烈支持这种观点。
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有研究显示， A23187 通过增加胞内钙离子促进细胞凋亡过程[3]。但Osamu又报道LPS可阻断PMN自发性或TNF诱导性凋亡。推测其原因，可能同PMN纯度较低 (93%)，含有大量单核淋巴细胞，受LPS刺激后产生多量细胞因子，如 IL-1、IL-6 和 IL-8等阻碍PMN凋亡有关[4]。Agarwal的报道同我们结果相似，证明p-BPB和磷酯酶C的阻断剂 U73122 可阻断光诱导的淋巴瘤细胞的凋亡和DNA“梯形”出现，而环氧化物酶抑制剂消炎痛不能产生相同效应[5]。
研究结果显示 PLA2 代谢产物之一PAF的受体阻断剂并不能阻断PMN的自发性凋亡，提示前列腺素类或PAF同PMN的凋亡没有直接关系。p-BPB不仅阻断 PLA2 介导的胸腺细胞凋亡，也阻断蛋白激酶C激动剂佛波脂(PMA)介导的胸腺细胞凋亡，提示 PLA2 和蛋白激酶C之间的相互依赖关系[3]。表明 PLA2 可能是胞内凋亡信号传导中的一部分。
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LPS和 A23187 可间接促进 PLA2 活性，是普遍使用的 PLA2 激活因子[7]。在预实验中采用 PLA2 和峰毒肽激发PMN，结果同文献[8]报道相同，大部分PMN出现坏死而不是凋亡。坏死PMN之DNA断裂破碎，电泳出现弥散状碎片。因此我们采用LPS和 A23187 作为 PLA2 激动剂。二种 PLA2 抑制剂对凋亡的不同效应，可能同其作用位点和机制不同有关。p-BPB是一种强烷化剂，直接作用于酶的活性中心位点，而氯喹则阻断酶和底物的结合或稳定细胞膜[9]。PLA2 非特异抑制剂糖皮质激素也可阻断人PMN的凋亡过程，在炎症的发生发展中有重要意义[8]。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770716)
, 百拇医药
作者简介：颜光涛，男，1960年生，四川宜宾市人，1983年华西医科大学毕业，解放军总医院基础医学研究所生化研究室主任，研究员；发表论文40篇。电话：(010)66935272
参考文献
1，Savill FS,Henson PM,Haslett C.Phagocytosis of aged Human neutrophils by macrophages is mediated by a novel "charge-sensitive" recongnition mechanism[J].J Clin Invest,1989,84:1518-1523.
2，颜光涛，郝秀华，李振甲.磷酯酶A2介导肿瘤坏死因子诱发的中性粒细胞趋化和粘附增强[J].生理学报，1995，47：544-551.
, 百拇医药 3，Vera VS,Oksana RO,Lazar KH et al.Dependence of thymocytes apoptosis on protein kinase C and phosphotipase A2[J].FEBS Letters,1994,348:317-319.
4，Osamu H,Yuji T,Hiroaki M et al.Inhibition by bacterial lipopolysaccharide of spontaneous and TNF a induced human neutrophil apoptosis in vitro[J].Microbiol Immunol,1995,39(9):715-723.
5，Agarwal ML,Larkin HE,Zaide SIA et al.Phospholipase activation triggers apoptosis in photosinsitized mouse lymphoma cels[J].Cancer Research,1993,53:5897-5902.
, 百拇医药
6，Forehand JR,Johnston RB,John SB et al.Phospholipase A2 activity in human neutrophils[J].J Lmmunol,1993,151(9):4918-4925.
7，Shaposhnikova VV,Egorova MV,Kudryavtse AA.The effect of melittin on proliferation and death of thymocytes[J].FEBS Letters,1997,410:285-288.
8，Zidovetzki R,Sherman IW,Cardenas M,et al.Chloroquine stabilization of phospholipide membranes agains diacy-glycerol induced pertubation[J].Bichem Pharmacol,1993,45:183-189.
9，Cox G.Glucocorticorid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils[J].J Immunol,1995,54:4719-4725.
收稿日期：1999-11-23
修回日期：1999-12-10, 百拇医药