碳铂壳聚糖缓解释微球的制备
作者：徐蔚 张纪
单位：徐蔚(解放军总医院神经外科博士研究生，北京 100853)；张纪(解放军总医院神经外科)
关键词：碳铂；壳聚糖；缓释剂；微球；制备
军医进修学院学报000204 【摘要】目的：碳铂由于其水溶性高、半衰期短极大地限制了它在颅脑恶性肿瘤化疗中的使用，为此我们选用了壳聚糖作为载体制备了碳铂壳聚糖缓释微球用于颅脑恶性肿瘤瘤内化疗。方法：我们参照了Gupta PK的统计学处理方法，引入“理想函数”全面优化微球的制备工艺，得到的微球载药量大，粒径分布适宜，工艺重现性好。通过多元线性回归分析，我们发现壳聚糖的浓度、固化时间、壳聚糖材料的类型及搅拌速度可能对粒径分布影响较大(P<0.01)，而壳聚糖的浓度与投药量的比例决定药物的包封率。结果：在我们制备的药物包封率为10%的微球中的到了良好的外观性状、达两周的控释能力和很好的微球刚性，体外释放实验证实药物微球的释放曲线平缓无突释现象。结论：我们制备的碳铂壳聚糖缓解微球物理性状良好，载药适中控释能力强，具有临床实际使用价值。
, 百拇医药
中图号：R944 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0092-03
The manufacture of chitoson polymer microsphere with carboplatin
XU Wei,ZHANG Ji
(Department of Neurosurgery,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:Because of high water resoluble and short half-life,the carboplatin is much limited in the use of treatment in craniocerebral malignant tumor.We manufactured carboplatin polymer microsphere with chitoson as the carrier to improve the treatment effect of carboplatin in craniocerebral malignant tumor.Methods:After careful consideration,we use "idea function" to arrange our manufacture process.We find that the concentration of chitoson,solid time,the type of chitoson structure and mixture speed affect the diameter of microsphere,but the concentration of chitoson and drug proportion affect drug envelopment into the microsphere.Results:Finally our chitoson polymer microsphere which carried 10% carboplatin have a good appearance without drug crystal on surface,have stable structure even after drug released two weeks,have a smooth release curve without any "burst effect".Conclusion:The chitoson polymer microsphere carried with carboplatin we made have a excellent physical quality,powerful controlled release ability and promising clinical future.
, http://www.100md.com
Key words:carboplatin;chitoson;polymer;microsphere;manufacture
碳铂(又名卡铂)作为第二代铂金属抗癌药物保持了第一代铂(顺铂)的抗瘤谱广，对实体瘤疗效高的优点，而其对肾、神经系统及胃肠的毒性较第一代铂制剂明显降低，使临床用药较为简便安全。卡铂的特点是水溶性较大，不易通过血脑屏障，难以在颅内达到足够的浓度，更由于卡铂在体内的半衰期短，作用于肿瘤的时间短，因而影响了疗效。针对这些问题，许多学者从不同的方面，就化疗方式，给药方法及途径等进行了许多有益的探索，以期提高化疗效果，改善患者的生存质量。近年来缓释剂型局部化疗的研究，开辟了恶性肿瘤治疗的又一新途径，尤其是对碳铂这类疗效高但半衰期短的药物，提供了扩展其疗效的可能性。我们进行了碳铂壳聚糖缓释剂的开发研究。
1 材料和方法
1.1 材料 ①壳聚糖：脱乙酰度 ≥90%，青岛百成公司提供。②卡铂：注射用，购于中国齐鲁制药厂。③橄榄油：CP，西班牙进口分装。④Tween 20:Care Roth进口上海化学试剂采购供应站试剂厂分装。
, http://www.100md.com
1.2 仪器 ①DF-101B集热式恒温磁力搅拌器：浙江乐清县乐成电器厂。②Olympus光学显微镜：日本Olympus公司。③SEM 505 电子扫描显微镜：荷兰Philips公司。④5100PC型原子吸收分光光度仪：美国Perkin-Elmer公司。
1.3 微球制备方法 称取 900 mg 壳聚糖(DAC)细粉，溶于 5% 醋酸溶液中配成 3% (W/V)的壳聚糖溶液，静止除去气泡后待用。取 15 ml 3% (W/V) DAC溶液于烧杯中，加入 100 mg 注射用卡铂冻干粉，另一部分不加(制成空白的壳聚糖微球作为对照)，搅拌均匀，取 7.5 ml 逐滴加入 100 ml 含 5% (W/V) Span 85 及 0.5% (W/V) Tween 20 的橄榄油中，以 1200 r/min 搅拌乳化 15 min，滴加 2 ml 50% 的戊二醛，固化 6 h。反应结束时加 40 ml 石油醚除去油相，微球用石油醚、异丙醇洗 3～5 次，用 G5 抽滤漏斗收集，室温干燥。微球干燥后过 120 目筛 2 次除去大颗粒后为流动性良好的黄色疏松粉末。所有操作均在避光条件下进行。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 载体材料用量对微球粒径及形态的影响 用 5% 的醋酸溶液配置 1%、2%、3% (W/V)的壳聚糖溶液，测定溶液的粘度如表 1。
表1 壳聚糖用量对微球制备的影响 壳聚糖浓度
粘度
(CP)
平均粒径
(μm)
微球性状
1%(W/V)
10.93
10.24±1.78
, 百拇医药
小球较多，粘连成团
2%(W/V)
85.23
57.12±15.68
球形良好，无粘连
3%(W/V)
166.10
71.84±14.27
球形良好，分散性好
2.2 加药量/载体比对微球粒及形态的影响 将碳铂原料微粉化后，过 600 目筛，加入壳聚糖溶液中混合均匀，使药物/壳聚糖之比例分别为 1∶9、 1∶4、 1∶1.5 (W/W)的比例，按制备条件分别制成三种微球，结果如表 2。表2 碳铂/壳聚糖比例对微球制备的影响 碳铂/壳聚糖
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(W/W)
微球含药量
(W/W%)
平均粒径
μm
包封率
%
微球性状
0
0
71.84±14.2
0
表面光滑球形好
, 百拇医药
1∶9
2.21
76.86±19.94
45.36
表面较光滑球形好
1∶4
5.93
82.98±21.74
54.80
表面粗糙球形好
1∶1.5
16.14
, 百拇医药 85.62±20.66
75.15
表面有结晶球形好
结果表明，随着药物在微球中比例的增高，微球的粒径增大，药物的包封率增高，但微球的性状变差。表 2 以 1∶9 的比例最佳。
2.3 微球形态及表面性状 在光镜下观察照射后的微球样品表面形态无显著变化，微球的流动性及分散性无显著改变。电子显微镜扫描显示，空白壳聚糖微球表面光滑、致密，无裂隙及孔洞，球形圆整。包载碳铂后对微球表面没有显著的影响，微球表面致密，球形良好，表面无药物结晶的存在。
2.4 微球粒径大小及分布 取适量的碳铂壳聚糖微球，在光镜下选择有代表性的区域计数 400 个粒子，按下式计算微球容积平均径：
, 百拇医药
d v为平均粒径，Δni为一定范围内粒子数目，d i为该范围内粒子等价径的中点值，也称粒子平均大小范围。结果表明，微球粒径呈偏正态分布，20～50 μm 范围内粒子占 83.5%，微球平均粒径为 41.08 μm。
2.5 碳铂壳聚糖微球的体外释放实验 微球的体外释放实验采用石墨炉原子吸收分光度法测定，实测结果见附图。
附图 药物的体外释放曲线
碳铂溶液在 24 h 内基本释放完毕，而碳铂壳聚糖微球在 24 h 内释放最为迅速，达到 45% 左右，以后释放速度逐渐减慢，到 2 周后仍有 15% 左右未释放，表现出碳铂壳聚糖微球良好的控释性能。
3 讨 论
, 百拇医药
改善恶性肿瘤的预后，提高化疗的效果一直是临床及基础科研的重点，改变投药的途径、变换药物的剂型及新的药物的研制，各种各样的尝试从未有过间断。微球是近年来新剂型研究的热点，它以天然、合成、半合成高分子材料为基质，将药物均匀分散或包埋在骨架中而制成球形载体给药系统。微球制剂具有对特定器官、组织的靶向性，药物在靶区缓慢释放，增强了抗癌效果。因而，微球技术正广泛用于临床的各种恶性肿瘤的治疗[1,2]。
药物在靶器官浓集并缓慢释放，维持较长时间的有效浓度是靶向给药的目的，药备的微球表面光洁无药物结晶，释放时间达 2 周，2 周后的微球形态大部保持不变，随机计数 400 个微球，微球的溶解坍塌率低于 2%。所以我们微球主要是以溶解扩散的方式释药[5]，具有较好的控释性。
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)，抗肿瘤药物就是通过使肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗的目的[6,7]。我们Gimesa染色的结果从形态学上显示了大量凋亡细胞群的存在，凋亡系的特征也非常明显：细胞浆和细胞核都固缩，染色质也固缩，边缘化，着色加深，有些细胞可见到胞膜外突出而着色较深的大泡。同时我们也观察到药物的作用的时间对肿瘤生长的抑制有明显的影响，药物微球着陆期，周围的肿瘤细胞不出现任何变化，1 h 后细胞分裂停止，随着药物作用的时间延长，药物微球周边的肿瘤细胞逐渐出现细胞失去梭形形态，变为圆形，并出现明显的凋亡细胞特征。释药早期，最接近药物微球的瘤细胞首先是发生凋亡，随后出现凋亡细胞群，晚期凋亡细胞群脱落，再晚期由于大量的凋亡细胞脱落而出现镜下大片空白区。碳铂壳聚糖微球为橘黄色半透明的均匀圆球，药物的作用总是从微球或微球浓集中心有内而外地产生，且由强变弱，药物弥散距离的影响十分明显，但对于药物弥散距离、速度及时间就我们目前的技术水平及仪器设备还不能进行精确的测量。
, 百拇医药
碘化丙啶(propidiumiodide,PI)常用于固定细胞法检测DNA含量。我们即采用了固定细胞法以PI染色进行流式细胞仪的检测，观察到明显的凋亡细胞峰，凋亡细胞达 35%，确定了凋亡细胞群的大量存在。
作者简介：徐蔚，男，1962-05-12生，江苏南通人，汉族，1999年解放军总医院神经外科博士毕业，研究方向：颅脑肿瘤；发表论文2篇。电话：(010)66937811
参考文献
1，Alesssandro Olivi,MG Ewend,Duncan KL et al.Interstitial delivery of carboplatin via Biodegradable polymers is effective against experimental glioma in rat[J].Can Chemother Pharmacol,1996,39:90-96.
, 百拇医药
2，Weller M,Frei K,Groscurth P et al.Anti-Fas/Apo-1 antibody mediates apoptosis of cultured human glioma cells[J].J Clin Invest,1994,94:954.
3，Eric P,Sipos EP,Tyler B et al.Optimizing Interstitial delivery of BCNU from controlled release polymers for the treatment of brain tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol,1997,39:383-389.
4，Sipos EP,Tyler B,Piantadosi S et al.Optimizing interstitial delivery of BCNU from controlled release polymers for the treatment of brain tumors.Cancer Chemother Pharmacol,1997,39:383-389.
, http://www.100md.com
5，Wenbin Dang,Todd Daviau,Henry Brem.Morphological characterization of polyanhydride biodegradable implant Gliadel during in vitro and in vivo erosion using scanning electron microscopy[J].Pharmaceutical Research,1996,13(5):683-691.
6，Spaule Hauer G,Vert M,Brem H et al.Biodegradable cisplatin microspheres prepare by the solvent evaporation method:Morphology and release characteristics[J].J Controlled Rese，1988,7:217-229.
7，Wylie AH.Glucocorcoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation[J].Nature,1980,284:555.
收稿日期：1999-12-08
修回日期：2000-01-06, http://www.100md.com
单位：徐蔚(解放军总医院神经外科博士研究生，北京 100853)；张纪(解放军总医院神经外科)
关键词：碳铂；壳聚糖；缓释剂；微球；制备
军医进修学院学报000204 【摘要】目的：碳铂由于其水溶性高、半衰期短极大地限制了它在颅脑恶性肿瘤化疗中的使用，为此我们选用了壳聚糖作为载体制备了碳铂壳聚糖缓释微球用于颅脑恶性肿瘤瘤内化疗。方法：我们参照了Gupta PK的统计学处理方法，引入“理想函数”全面优化微球的制备工艺，得到的微球载药量大，粒径分布适宜，工艺重现性好。通过多元线性回归分析，我们发现壳聚糖的浓度、固化时间、壳聚糖材料的类型及搅拌速度可能对粒径分布影响较大(P<0.01)，而壳聚糖的浓度与投药量的比例决定药物的包封率。结果：在我们制备的药物包封率为10%的微球中的到了良好的外观性状、达两周的控释能力和很好的微球刚性，体外释放实验证实药物微球的释放曲线平缓无突释现象。结论：我们制备的碳铂壳聚糖缓解微球物理性状良好，载药适中控释能力强，具有临床实际使用价值。
, 百拇医药
中图号：R944 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0092-03
The manufacture of chitoson polymer microsphere with carboplatin
XU Wei,ZHANG Ji
(Department of Neurosurgery,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:Because of high water resoluble and short half-life,the carboplatin is much limited in the use of treatment in craniocerebral malignant tumor.We manufactured carboplatin polymer microsphere with chitoson as the carrier to improve the treatment effect of carboplatin in craniocerebral malignant tumor.Methods:After careful consideration,we use "idea function" to arrange our manufacture process.We find that the concentration of chitoson,solid time,the type of chitoson structure and mixture speed affect the diameter of microsphere,but the concentration of chitoson and drug proportion affect drug envelopment into the microsphere.Results:Finally our chitoson polymer microsphere which carried 10% carboplatin have a good appearance without drug crystal on surface,have stable structure even after drug released two weeks,have a smooth release curve without any "burst effect".Conclusion:The chitoson polymer microsphere carried with carboplatin we made have a excellent physical quality,powerful controlled release ability and promising clinical future.
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Key words:carboplatin;chitoson;polymer;microsphere;manufacture
碳铂(又名卡铂)作为第二代铂金属抗癌药物保持了第一代铂(顺铂)的抗瘤谱广，对实体瘤疗效高的优点，而其对肾、神经系统及胃肠的毒性较第一代铂制剂明显降低，使临床用药较为简便安全。卡铂的特点是水溶性较大，不易通过血脑屏障，难以在颅内达到足够的浓度，更由于卡铂在体内的半衰期短，作用于肿瘤的时间短，因而影响了疗效。针对这些问题，许多学者从不同的方面，就化疗方式，给药方法及途径等进行了许多有益的探索，以期提高化疗效果，改善患者的生存质量。近年来缓释剂型局部化疗的研究，开辟了恶性肿瘤治疗的又一新途径，尤其是对碳铂这类疗效高但半衰期短的药物，提供了扩展其疗效的可能性。我们进行了碳铂壳聚糖缓释剂的开发研究。
1 材料和方法
1.1 材料 ①壳聚糖：脱乙酰度 ≥90%，青岛百成公司提供。②卡铂：注射用，购于中国齐鲁制药厂。③橄榄油：CP，西班牙进口分装。④Tween 20:Care Roth进口上海化学试剂采购供应站试剂厂分装。
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1.2 仪器 ①DF-101B集热式恒温磁力搅拌器：浙江乐清县乐成电器厂。②Olympus光学显微镜：日本Olympus公司。③SEM 505 电子扫描显微镜：荷兰Philips公司。④5100PC型原子吸收分光光度仪：美国Perkin-Elmer公司。
1.3 微球制备方法 称取 900 mg 壳聚糖(DAC)细粉，溶于 5% 醋酸溶液中配成 3% (W/V)的壳聚糖溶液，静止除去气泡后待用。取 15 ml 3% (W/V) DAC溶液于烧杯中，加入 100 mg 注射用卡铂冻干粉，另一部分不加(制成空白的壳聚糖微球作为对照)，搅拌均匀，取 7.5 ml 逐滴加入 100 ml 含 5% (W/V) Span 85 及 0.5% (W/V) Tween 20 的橄榄油中，以 1200 r/min 搅拌乳化 15 min，滴加 2 ml 50% 的戊二醛，固化 6 h。反应结束时加 40 ml 石油醚除去油相，微球用石油醚、异丙醇洗 3～5 次，用 G5 抽滤漏斗收集，室温干燥。微球干燥后过 120 目筛 2 次除去大颗粒后为流动性良好的黄色疏松粉末。所有操作均在避光条件下进行。
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2 结 果
2.1 载体材料用量对微球粒径及形态的影响 用 5% 的醋酸溶液配置 1%、2%、3% (W/V)的壳聚糖溶液，测定溶液的粘度如表 1。
表1 壳聚糖用量对微球制备的影响 壳聚糖浓度
粘度
(CP)
平均粒径
(μm)
微球性状
1%(W/V)
10.93
10.24±1.78
, 百拇医药
小球较多，粘连成团
2%(W/V)
85.23
57.12±15.68
球形良好，无粘连
3%(W/V)
166.10
71.84±14.27
球形良好，分散性好
2.2 加药量/载体比对微球粒及形态的影响 将碳铂原料微粉化后，过 600 目筛，加入壳聚糖溶液中混合均匀，使药物/壳聚糖之比例分别为 1∶9、 1∶4、 1∶1.5 (W/W)的比例，按制备条件分别制成三种微球，结果如表 2。表2 碳铂/壳聚糖比例对微球制备的影响 碳铂/壳聚糖
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(W/W)
微球含药量
(W/W%)
平均粒径
μm
包封率
%
微球性状
0
0
71.84±14.2
0
表面光滑球形好
, 百拇医药
1∶9
2.21
76.86±19.94
45.36
表面较光滑球形好
1∶4
5.93
82.98±21.74
54.80
表面粗糙球形好
1∶1.5
16.14
, 百拇医药 85.62±20.66
75.15
表面有结晶球形好
结果表明，随着药物在微球中比例的增高，微球的粒径增大，药物的包封率增高，但微球的性状变差。表 2 以 1∶9 的比例最佳。
2.3 微球形态及表面性状 在光镜下观察照射后的微球样品表面形态无显著变化，微球的流动性及分散性无显著改变。电子显微镜扫描显示，空白壳聚糖微球表面光滑、致密，无裂隙及孔洞，球形圆整。包载碳铂后对微球表面没有显著的影响，微球表面致密，球形良好，表面无药物结晶的存在。
2.4 微球粒径大小及分布 取适量的碳铂壳聚糖微球，在光镜下选择有代表性的区域计数 400 个粒子，按下式计算微球容积平均径：
, 百拇医药
d v为平均粒径，Δni为一定范围内粒子数目，d i为该范围内粒子等价径的中点值，也称粒子平均大小范围。结果表明，微球粒径呈偏正态分布，20～50 μm 范围内粒子占 83.5%，微球平均粒径为 41.08 μm。
2.5 碳铂壳聚糖微球的体外释放实验 微球的体外释放实验采用石墨炉原子吸收分光度法测定，实测结果见附图。
附图 药物的体外释放曲线
碳铂溶液在 24 h 内基本释放完毕，而碳铂壳聚糖微球在 24 h 内释放最为迅速，达到 45% 左右，以后释放速度逐渐减慢，到 2 周后仍有 15% 左右未释放，表现出碳铂壳聚糖微球良好的控释性能。
3 讨 论
, 百拇医药
改善恶性肿瘤的预后，提高化疗的效果一直是临床及基础科研的重点，改变投药的途径、变换药物的剂型及新的药物的研制，各种各样的尝试从未有过间断。微球是近年来新剂型研究的热点，它以天然、合成、半合成高分子材料为基质，将药物均匀分散或包埋在骨架中而制成球形载体给药系统。微球制剂具有对特定器官、组织的靶向性，药物在靶区缓慢释放，增强了抗癌效果。因而，微球技术正广泛用于临床的各种恶性肿瘤的治疗[1,2]。
药物在靶器官浓集并缓慢释放，维持较长时间的有效浓度是靶向给药的目的，药备的微球表面光洁无药物结晶，释放时间达 2 周，2 周后的微球形态大部保持不变，随机计数 400 个微球，微球的溶解坍塌率低于 2%。所以我们微球主要是以溶解扩散的方式释药[5]，具有较好的控释性。
细胞凋亡(apoptosis)又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)，抗肿瘤药物就是通过使肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗的目的[6,7]。我们Gimesa染色的结果从形态学上显示了大量凋亡细胞群的存在，凋亡系的特征也非常明显：细胞浆和细胞核都固缩，染色质也固缩，边缘化，着色加深，有些细胞可见到胞膜外突出而着色较深的大泡。同时我们也观察到药物的作用的时间对肿瘤生长的抑制有明显的影响，药物微球着陆期，周围的肿瘤细胞不出现任何变化，1 h 后细胞分裂停止，随着药物作用的时间延长，药物微球周边的肿瘤细胞逐渐出现细胞失去梭形形态，变为圆形，并出现明显的凋亡细胞特征。释药早期，最接近药物微球的瘤细胞首先是发生凋亡，随后出现凋亡细胞群，晚期凋亡细胞群脱落，再晚期由于大量的凋亡细胞脱落而出现镜下大片空白区。碳铂壳聚糖微球为橘黄色半透明的均匀圆球，药物的作用总是从微球或微球浓集中心有内而外地产生，且由强变弱，药物弥散距离的影响十分明显，但对于药物弥散距离、速度及时间就我们目前的技术水平及仪器设备还不能进行精确的测量。
, 百拇医药
碘化丙啶(propidiumiodide,PI)常用于固定细胞法检测DNA含量。我们即采用了固定细胞法以PI染色进行流式细胞仪的检测，观察到明显的凋亡细胞峰，凋亡细胞达 35%，确定了凋亡细胞群的大量存在。
作者简介：徐蔚，男，1962-05-12生，江苏南通人，汉族，1999年解放军总医院神经外科博士毕业，研究方向：颅脑肿瘤；发表论文2篇。电话：(010)66937811
参考文献
1，Alesssandro Olivi,MG Ewend,Duncan KL et al.Interstitial delivery of carboplatin via Biodegradable polymers is effective against experimental glioma in rat[J].Can Chemother Pharmacol,1996,39:90-96.
, 百拇医药
2，Weller M,Frei K,Groscurth P et al.Anti-Fas/Apo-1 antibody mediates apoptosis of cultured human glioma cells[J].J Clin Invest,1994,94:954.
3，Eric P,Sipos EP,Tyler B et al.Optimizing Interstitial delivery of BCNU from controlled release polymers for the treatment of brain tumors[J].Cancer Chemother Pharmacol,1997,39:383-389.
4，Sipos EP,Tyler B,Piantadosi S et al.Optimizing interstitial delivery of BCNU from controlled release polymers for the treatment of brain tumors.Cancer Chemother Pharmacol,1997,39:383-389.
, http://www.100md.com
5，Wenbin Dang,Todd Daviau,Henry Brem.Morphological characterization of polyanhydride biodegradable implant Gliadel during in vitro and in vivo erosion using scanning electron microscopy[J].Pharmaceutical Research,1996,13(5):683-691.
6，Spaule Hauer G,Vert M,Brem H et al.Biodegradable cisplatin microspheres prepare by the solvent evaporation method:Morphology and release characteristics[J].J Controlled Rese，1988,7:217-229.
7，Wylie AH.Glucocorcoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation[J].Nature,1980,284:555.
收稿日期：1999-12-08
修回日期：2000-01-06, http://www.100md.com