新的白血病相关基因LRP16的克隆
作者：于力 韩为东 楼方定 王全顺 赵瑜 Michael A Caligiuri
单位：于力 韩为东 楼方定 王全顺 赵瑜(解放军总医院血液科，中国北京 100853)；Michael A Caligiuri(俄亥俄大学附属医院血液科，美国哥伦布 43210)
关键词：RLGS；RACE；急性髓细胞白血病；LRP16基因
军医进修学院学报000201
【摘要】目的：发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制。方法：应用分子克隆技术RLGS及RACE技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因。结果：克隆到一个长度为2948 bp 的DNA片段，经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分，并定位于第11号染色体长臂11区，进一步克隆到这一基因的全长cDNA，其长度为980 bp，并被国际基因库以新的人类基因LRP16收录入库。结论：RLGS及RACE技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法，LRP16基因的发现对于探讨白血病发生机制具有一定意义。
, 百拇医药
中图号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0081-04
Cloning of leukemia associated gene LRP16 in acute myeloid leukemia
YU Li,HAN Wei-dong,LOU Fang-ding,WANG Quan-shun,ZHAO Yu,Michael A Caligiuri (Department of Hematology,PLAS General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:The purpose of this paper is to clone novel leukemia associated gene in acute myeloid leukemia (AML).Methods:The Restriction landmark genomic scanning (RLGS),Southern blot,Northern blot and rapid amplification of cDNA end (RACE) technique were performed on genomic DNA or RNA from AML and normal bone marrow (BM) samples.Results:An abnormal 2948bp fragment due to a distinct DNA methylation on NotI site in relapse sample from AML was cloned.The Sequence represents part of a new gene LRP16 which is located on chromosome 11q11.The full length cDNA sequence 980bp was cloned by RACE technique.Conclusion:The results indicate that RLGS and RACE technique are effective methods to find leukemia associated gene in AML.The finding of LRP16 gene is important to investigate mechanism of AML.
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Key words：RLGS;RACE;AML;LRP16 gene
目前认为基因水平的改变是导致急性白血病发生的重要原因之一，人们正在努力地发现新的白血病相关基因、探讨白血病的发生机制从而达到在基因水平治疗白血病的目的[1]。本研究采用RLGS(restriction landmark genomic scanning)及RACE(rapid amplification of cDNA end)等新的分子生物学技术克隆到一新的白血病相关基因LRP16，并已完成染色体定位及全长cDNA序列分析。
1 材料和方法
1.1 标本 来源于正常人外周血单个核细胞、正常骨髓细胞及急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞；按文献介绍方法提取DNA[2]。
1.2 RLGS技术按文献介绍方法[3，4] 用 20 U 内切酶NotI (Promega)消化基因组DNA，同位素 p32 末端标记后经 20 U EcoRV (Promega)酶切，取 1.5 μg 行 0.8% 琼脂糖凝胶管状电泳(第 1 维分离)。用 750 U Hinf I (Promega)再次酶解胶中DNA，行 5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(第 2 维分离)，将凝胶干燥后放射自显影。
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1.3 RLGS点克隆 按文献介绍方法[5]，根据异常的点在RLGS胶中所处的位置，来确定这个点中所含DNA片段大小，然后从一个特殊的NotI-EcoRV基因组文库中筛选该DNA片段。
1.4 Southern印记杂交 用 20 U 的限制性内切酶消化 5 μg 的基因组DNA， 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜，标记探针及杂交，放射自显影[2]。
1.5 Northern印记杂交 载有 8 种来源于不同组织mRNA的尼龙膜，购自美国Clontech公司，按试剂盒说明进行 p32 探针标记、杂交及放射自显影。
1.6 LRP16 基因的染色体定位 按文献介绍方法[6]，应用放射杂交技术(Radiation Hybrid)将基因定位于染色体上的确切位置。
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1.7 RACE技术 RACE试剂盒购于美国Gilbco.BRL公司。按试剂盒说明介绍的实验条件操作，所用的特异性引物及序列如下：
5′-RTP 5′-GGA GCT CGG CAG CCT GAC T-3′
5′-GSP1 5′-GGA GCT GTT GGC GGC GTT GA-3′
5′-GSP2 5′-CCT CCC GCT GCT TGT CAC T-3′
5′-GSP3 5′-CCA GTC GGT GGA GGT GCT CA-3′
3′-GSP1 5′-CCC TGC AGA GCT GTA AGA CTG-3′
3′-GSP2 5′-GAT CAC CGG CGG CTA TCG-3′
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1.8 PCR产物的克隆及DNA序列分析 采用Perkin Elmer公司生产的试剂盒，按说明书介绍的方法进行克隆。采用ABI PRISMTM 377XL DNA序列分析仪进行DNA序列分析。
2 结 果
应用RLGS技术对 1 例急性髓细胞白血病患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本进行分析，每一标本有 1284 个点可供分析，通过不同病期标本RLGS结果的比较发现一个异常点，这个点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失(图 1)。经点克隆技术获得一个长度为 2948 bp 的异常DNA片段，并采用放射杂交技术将其定位于 11 号染色体短臂 11 区(另文发表)。
图1 RLGS结果
箭头示异常点LRP16，此点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失用来源于该DNA片段的部分序列作为探针，EcoRV单独及EcoRV与NotI双酶解基因组DNA并进行Southern印记杂交分析，在对照组PBL(正常人外周血单个核细胞)中，单酶解标本可见一条 10 kb 的杂交带而双酶解标本此带消失，代之以 3 kb 及 1 kb 长的两条短带；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中双酶解标本仅见一条长度为 3 kb 的杂交带， 1 kb 杂交带消失(图 3)。结合DNA序列分析结果证明位于此片段中的两个NotI酶切位点中有一个位点在PBL、初治及缓解标本中部分被甲基化，而在复发标本却全部发生了甲基化(图 2)。
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图2 来源于LRP16基因的部分DNA片段(2948bp)
M-为非甲基化，M+为甲基化
图3 Southern印记杂交结果
在对照组PBL中，EcoRV单酶解标本可见一条10kb的杂交带，EcoRV+NotI双酶解标本此带消失，见3kb及1kb的杂交带各一条；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中EcoRV单酶解标本可见一条10kb的杂交带，EcoRV+NotI双酶解标本中仅见一条3kb的杂交带，1kb的杂交带消失
将克隆到的 2948 bp 长的DNA片段在人类基因库中进行同源检索未发现与其相匹配的DNA或cDNA，仅发现数条与其相配的EST(express sequence tag)片段。采用DNA STAR软件包通过电子信息杂交筛选将所获得的EST整合、连接在一起获得一长度约 800 bp 的cDNA片段，根据这一序列分别设计数条引物，应用RACE技术分别钓取 5′及 3′端的cDNA序列。经DNA序列分析获 980 bp 的全长 cDNA，包含全部氨基酸编码序列，经国际基因库审查、确认为一新发现的人类基因收录入库并被命名为LRP16。用cDNA作为探针对 8 种不同来源的组织进行Northern分析，发现一条长度约 1 kb 的杂交带。
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LRP16 基因全长cDNA序列(国际基因库Accesion Number:AF202922):
3 讨 论
急性白血病是一种多基因异常所致的恶性血液系统疾病，寻找新的白血病相关基因一直是这一领域的研究热点。RLGS是通过 2 维胶电泳进行限制性酶切基因扫描新技术，多数点内被标记的DNA片段来源于某个基因的 5′端序列，通过对异常点内所含DNA片段的克隆可能发现新的基因[7]。采用RLGS技术我们克隆到一个长度为 2948 bp 的异常DNA片段，经国际基因库同源检索证明这个DNA片段来源于一个具有表达功能的未知基因的一部分。
新基因全长cDNA克隆的方法主要包括cDNA文库筛选法和RACE技术钓取法，虽然cDNA文库筛选法可以获得比较准确的碱基序列并可得到较长的cDNA，但此法必须有完整的cDNA文库作保证，同时筛选步骤较为复杂，费时费力，费用较为昂贵。而RACE技术包括5′-RACE和 3′-RACE，目前已成功应用于钓取全长cDNA的研究中，此项技术的主要优点是快速、灵敏，短时间内即可获得新基因的全长cDNA序列[8]。本研究采用RACE技术获得的LRP16 基因cDNA的长度为 980 bp，为进一步证实其为全长cDNA序列，我们用来源于该基因的cDNA探针进行Northern印记杂交分析，得到一长度约 1 kb 的杂交带，结果表明我们所钓取的确为全长cDNA。
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DNA超甲基化在肿瘤发生、发展中起着重要作用，某些基因 5′端启动子区CpG岛甲基化是基因表达调控的方式之一，通常情况下多数抑癌基因启动子区DNA甲基化导致基因不表达，如Rb、P15 及 P16 基因[9，10]。我们克隆的 LRP16 基因在正常外周血、白血病初治及缓解期骨髓细胞中，DNA上两个NotI酶切位点中的一个发生了部分甲基化，而白血病复发期肿瘤细胞中这个NotI酶切却全部发生了甲基化。这个基因在白血病不同病期间DNA甲基化模式的异常，可能与白血病的发生、发展及疾病的演变有一定关系，目前我们正在对更多的白血病标本进行DNA甲基化研究，并进一步探讨DNA甲基化与该基因表达、调控的关系。LRP16 基因的发现为白血病发病机制的研究及在基因水平对白血病进行治疗提供了新的依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(3997082)；“九五”军队科研基金项目(98M141)
作者简介：于力，男，1958-03-07生，吉林省白城市人，汉族，1982 年毕业于白求恩医科大学，1994年获中国协和医科大学肿瘤学博士学位，1998年在美国俄亥俄州立大学肿瘤研究所完成博士后研究，解放军总医院血液科副主任医师、副教授、硕士研究生导师，科室副主任；发表论文20余篇。电话：(010)66939481
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参考文献
1，Caligiuri MA,Strout MP,Gilliand DG.Molecular biology of acute myeloid leukemia[J].Semin Oncol,1997,24(1)32-44.
2，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual[C].Cold Spring Harbor Lab Press:Plainview NY,1989.
3，Okazaki Y.A linkage map of the mouse using an expanded production system of the restriction landmark genomic scanning (RLGS Ver 1.8)[J].Biochem Biophys Res Comm,1995,205(3):1922-1928.
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4，Costello JF,Plass C,Arap W et al.Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA[J].Cancer Res,1997,57(7):1250-1254.
5，Smiraglia DJ,Fruhwald MC,Costello JF et al.A new tool for the rapid cloning of amplified and hypermethylated human DNA sequences from restriction landmark genome scanning gels[J].Genomics,1999,58(3):254-262.
6，Newell W,Beck S,Lehrach H et al.Estimation of distances and map construction using radiation hybrids[J].Genome Res,1998,8(5):493-508.
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7，Plass C,Yu F,Yu L et al.Restriction landmark genome scanning for aberrant methylation in primary refractory and relapsed acute myeloid leukemia;invilvement of the WIT-1 gene[J].Oncogene,1999,18(20):3159-3165.
8，Schaefer BC.Revolutions in rapid amplification of cDNA ends:new strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length cDNA ends[J].Anal Biochem,1995,227(2):255-273.
9，Baylin SB,Herman JG,Graff JR.Alterations in methylation:A fundamental aspect of neoplasia[J].Adv Cancer Res,1998,72:141-196.
10，Issa JPJ,Baylin S B,Herman JG.DNA methylation changes in hematologic malignancies:biologic and clinical implication[J].Leukemia,1997,11(Suppl):S7-S11.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：2000-02-01, 百拇医药
单位：于力 韩为东 楼方定 王全顺 赵瑜(解放军总医院血液科，中国北京 100853)；Michael A Caligiuri(俄亥俄大学附属医院血液科，美国哥伦布 43210)
关键词：RLGS；RACE；急性髓细胞白血病；LRP16基因
军医进修学院学报000201
【摘要】目的：发现新的白血病相关基因及探讨白血病的发生机制。方法：应用分子克隆技术RLGS及RACE技术自急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆新的白血病相关基因。结果：克隆到一个长度为2948 bp 的DNA片段，经国际基因库同源检索证明为一未知基因的一部分，并定位于第11号染色体长臂11区，进一步克隆到这一基因的全长cDNA，其长度为980 bp，并被国际基因库以新的人类基因LRP16收录入库。结论：RLGS及RACE技术对于发现白血病相关基因是一种有效的方法，LRP16基因的发现对于探讨白血病发生机制具有一定意义。
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中图号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)02-0081-04
Cloning of leukemia associated gene LRP16 in acute myeloid leukemia
YU Li,HAN Wei-dong,LOU Fang-ding,WANG Quan-shun,ZHAO Yu,Michael A Caligiuri (Department of Hematology,PLAS General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:The purpose of this paper is to clone novel leukemia associated gene in acute myeloid leukemia (AML).Methods:The Restriction landmark genomic scanning (RLGS),Southern blot,Northern blot and rapid amplification of cDNA end (RACE) technique were performed on genomic DNA or RNA from AML and normal bone marrow (BM) samples.Results:An abnormal 2948bp fragment due to a distinct DNA methylation on NotI site in relapse sample from AML was cloned.The Sequence represents part of a new gene LRP16 which is located on chromosome 11q11.The full length cDNA sequence 980bp was cloned by RACE technique.Conclusion:The results indicate that RLGS and RACE technique are effective methods to find leukemia associated gene in AML.The finding of LRP16 gene is important to investigate mechanism of AML.
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Key words：RLGS;RACE;AML;LRP16 gene
目前认为基因水平的改变是导致急性白血病发生的重要原因之一，人们正在努力地发现新的白血病相关基因、探讨白血病的发生机制从而达到在基因水平治疗白血病的目的[1]。本研究采用RLGS(restriction landmark genomic scanning)及RACE(rapid amplification of cDNA end)等新的分子生物学技术克隆到一新的白血病相关基因LRP16，并已完成染色体定位及全长cDNA序列分析。
1 材料和方法
1.1 标本 来源于正常人外周血单个核细胞、正常骨髓细胞及急性非淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞；按文献介绍方法提取DNA[2]。
1.2 RLGS技术按文献介绍方法[3，4] 用 20 U 内切酶NotI (Promega)消化基因组DNA，同位素 p32 末端标记后经 20 U EcoRV (Promega)酶切，取 1.5 μg 行 0.8% 琼脂糖凝胶管状电泳(第 1 维分离)。用 750 U Hinf I (Promega)再次酶解胶中DNA，行 5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(第 2 维分离)，将凝胶干燥后放射自显影。
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1.3 RLGS点克隆 按文献介绍方法[5]，根据异常的点在RLGS胶中所处的位置，来确定这个点中所含DNA片段大小，然后从一个特殊的NotI-EcoRV基因组文库中筛选该DNA片段。
1.4 Southern印记杂交 用 20 U 的限制性内切酶消化 5 μg 的基因组DNA， 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，转移DNA至尼龙膜，标记探针及杂交，放射自显影[2]。
1.5 Northern印记杂交 载有 8 种来源于不同组织mRNA的尼龙膜，购自美国Clontech公司，按试剂盒说明进行 p32 探针标记、杂交及放射自显影。
1.6 LRP16 基因的染色体定位 按文献介绍方法[6]，应用放射杂交技术(Radiation Hybrid)将基因定位于染色体上的确切位置。
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1.7 RACE技术 RACE试剂盒购于美国Gilbco.BRL公司。按试剂盒说明介绍的实验条件操作，所用的特异性引物及序列如下：
5′-RTP 5′-GGA GCT CGG CAG CCT GAC T-3′
5′-GSP1 5′-GGA GCT GTT GGC GGC GTT GA-3′
5′-GSP2 5′-CCT CCC GCT GCT TGT CAC T-3′
5′-GSP3 5′-CCA GTC GGT GGA GGT GCT CA-3′
3′-GSP1 5′-CCC TGC AGA GCT GTA AGA CTG-3′
3′-GSP2 5′-GAT CAC CGG CGG CTA TCG-3′
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1.8 PCR产物的克隆及DNA序列分析 采用Perkin Elmer公司生产的试剂盒，按说明书介绍的方法进行克隆。采用ABI PRISMTM 377XL DNA序列分析仪进行DNA序列分析。
2 结 果
应用RLGS技术对 1 例急性髓细胞白血病患者不同病期(初治、缓解、复发)的骨髓标本进行分析，每一标本有 1284 个点可供分析，通过不同病期标本RLGS结果的比较发现一个异常点，这个点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失(图 1)。经点克隆技术获得一个长度为 2948 bp 的异常DNA片段，并采用放射杂交技术将其定位于 11 号染色体短臂 11 区(另文发表)。
图1 RLGS结果
箭头示异常点LRP16，此点在初治和缓解标本中存在而复发标本中消失用来源于该DNA片段的部分序列作为探针，EcoRV单独及EcoRV与NotI双酶解基因组DNA并进行Southern印记杂交分析，在对照组PBL(正常人外周血单个核细胞)中，单酶解标本可见一条 10 kb 的杂交带而双酶解标本此带消失，代之以 3 kb 及 1 kb 长的两条短带；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中双酶解标本仅见一条长度为 3 kb 的杂交带， 1 kb 杂交带消失(图 3)。结合DNA序列分析结果证明位于此片段中的两个NotI酶切位点中有一个位点在PBL、初治及缓解标本中部分被甲基化，而在复发标本却全部发生了甲基化(图 2)。
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图2 来源于LRP16基因的部分DNA片段(2948bp)
M-为非甲基化，M+为甲基化
图3 Southern印记杂交结果
在对照组PBL中，EcoRV单酶解标本可见一条10kb的杂交带，EcoRV+NotI双酶解标本此带消失，见3kb及1kb的杂交带各一条；在初治和缓解组中，可见与对照组类似结果；而在复发组中EcoRV单酶解标本可见一条10kb的杂交带，EcoRV+NotI双酶解标本中仅见一条3kb的杂交带，1kb的杂交带消失
将克隆到的 2948 bp 长的DNA片段在人类基因库中进行同源检索未发现与其相匹配的DNA或cDNA，仅发现数条与其相配的EST(express sequence tag)片段。采用DNA STAR软件包通过电子信息杂交筛选将所获得的EST整合、连接在一起获得一长度约 800 bp 的cDNA片段，根据这一序列分别设计数条引物，应用RACE技术分别钓取 5′及 3′端的cDNA序列。经DNA序列分析获 980 bp 的全长 cDNA，包含全部氨基酸编码序列，经国际基因库审查、确认为一新发现的人类基因收录入库并被命名为LRP16。用cDNA作为探针对 8 种不同来源的组织进行Northern分析，发现一条长度约 1 kb 的杂交带。
, http://www.100md.com
LRP16 基因全长cDNA序列(国际基因库Accesion Number:AF202922):
3 讨 论
急性白血病是一种多基因异常所致的恶性血液系统疾病，寻找新的白血病相关基因一直是这一领域的研究热点。RLGS是通过 2 维胶电泳进行限制性酶切基因扫描新技术，多数点内被标记的DNA片段来源于某个基因的 5′端序列，通过对异常点内所含DNA片段的克隆可能发现新的基因[7]。采用RLGS技术我们克隆到一个长度为 2948 bp 的异常DNA片段，经国际基因库同源检索证明这个DNA片段来源于一个具有表达功能的未知基因的一部分。
新基因全长cDNA克隆的方法主要包括cDNA文库筛选法和RACE技术钓取法，虽然cDNA文库筛选法可以获得比较准确的碱基序列并可得到较长的cDNA，但此法必须有完整的cDNA文库作保证，同时筛选步骤较为复杂，费时费力，费用较为昂贵。而RACE技术包括5′-RACE和 3′-RACE，目前已成功应用于钓取全长cDNA的研究中，此项技术的主要优点是快速、灵敏，短时间内即可获得新基因的全长cDNA序列[8]。本研究采用RACE技术获得的LRP16 基因cDNA的长度为 980 bp，为进一步证实其为全长cDNA序列，我们用来源于该基因的cDNA探针进行Northern印记杂交分析，得到一长度约 1 kb 的杂交带，结果表明我们所钓取的确为全长cDNA。
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DNA超甲基化在肿瘤发生、发展中起着重要作用，某些基因 5′端启动子区CpG岛甲基化是基因表达调控的方式之一，通常情况下多数抑癌基因启动子区DNA甲基化导致基因不表达，如Rb、P15 及 P16 基因[9，10]。我们克隆的 LRP16 基因在正常外周血、白血病初治及缓解期骨髓细胞中，DNA上两个NotI酶切位点中的一个发生了部分甲基化，而白血病复发期肿瘤细胞中这个NotI酶切却全部发生了甲基化。这个基因在白血病不同病期间DNA甲基化模式的异常，可能与白血病的发生、发展及疾病的演变有一定关系，目前我们正在对更多的白血病标本进行DNA甲基化研究，并进一步探讨DNA甲基化与该基因表达、调控的关系。LRP16 基因的发现为白血病发病机制的研究及在基因水平对白血病进行治疗提供了新的依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(3997082)；“九五”军队科研基金项目(98M141)
作者简介：于力，男，1958-03-07生，吉林省白城市人，汉族，1982 年毕业于白求恩医科大学，1994年获中国协和医科大学肿瘤学博士学位，1998年在美国俄亥俄州立大学肿瘤研究所完成博士后研究，解放军总医院血液科副主任医师、副教授、硕士研究生导师，科室副主任；发表论文20余篇。电话：(010)66939481
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参考文献
1，Caligiuri MA,Strout MP,Gilliand DG.Molecular biology of acute myeloid leukemia[J].Semin Oncol,1997,24(1)32-44.
2，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual[C].Cold Spring Harbor Lab Press:Plainview NY,1989.
3，Okazaki Y.A linkage map of the mouse using an expanded production system of the restriction landmark genomic scanning (RLGS Ver 1.8)[J].Biochem Biophys Res Comm,1995,205(3):1922-1928.
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4，Costello JF,Plass C,Arap W et al.Cyclin dependent kinase 6 (CDK6) amplification in human glioblastomas identified using two-dimensional separation of genomic DNA[J].Cancer Res,1997,57(7):1250-1254.
5，Smiraglia DJ,Fruhwald MC,Costello JF et al.A new tool for the rapid cloning of amplified and hypermethylated human DNA sequences from restriction landmark genome scanning gels[J].Genomics,1999,58(3):254-262.
6，Newell W,Beck S,Lehrach H et al.Estimation of distances and map construction using radiation hybrids[J].Genome Res,1998,8(5):493-508.
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7，Plass C,Yu F,Yu L et al.Restriction landmark genome scanning for aberrant methylation in primary refractory and relapsed acute myeloid leukemia;invilvement of the WIT-1 gene[J].Oncogene,1999,18(20):3159-3165.
8，Schaefer BC.Revolutions in rapid amplification of cDNA ends:new strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length cDNA ends[J].Anal Biochem,1995,227(2):255-273.
9，Baylin SB,Herman JG,Graff JR.Alterations in methylation:A fundamental aspect of neoplasia[J].Adv Cancer Res,1998,72:141-196.
10，Issa JPJ,Baylin S B,Herman JG.DNA methylation changes in hematologic malignancies:biologic and clinical implication[J].Leukemia,1997,11(Suppl):S7-S11.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：2000-02-01, 百拇医药