免疫损伤对离体培养心肌细胞力学特性的影响
作者：万朝敏 俞红吉 吴泰相 高云钦 周密 邓建军 王正荣
单位：万朝敏 周密 邓建军(华西医科大学 附属第二医院儿科)；俞红吉 吴泰相(华西医科大学 第一临床医学院)；高云钦 王正荣(华西医科大学 基础医学院，四川 成都 610041)
关键词：免疫损伤；心肌细胞；收缩力
中国医学物理学杂志000212 摘要：目的：探讨病毒性心肌炎时免疫损伤对心肌细胞损害的发病机理。方法：成功建立自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 在此基础上进行心肌细胞的细胞力学特性的分析。结果：免疫损伤对心肌细胞有明显的损害, 心肌细胞收缩力下降, 其中免疫损伤的心肌细胞在24小时的心肌收缩力下降比12小时更为明显. 结论：免疫损伤使心肌细胞收缩力下降。
中图分类号：R33.1.3+1 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(2000)02-0095-02
, http://www.100md.com
Cardiac myocyte character of myocardial contractile
protein in vitro autoimmune mechanism caused by coxsackivirus B3
WAN Chao-min YU Hong-jie WU Tai-xiang
GAO Yun-qing ZHOU Mi DENG Jian-jun WANG Zheng-rong
(Department of pediatrics, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
Abstract: Objective: To determine the mechanism of cell-mediated autoimmune response caused by coxsackievirus B3 on cardiac myocyte. Methods: To set up cellular model of cell-mediated autoimmune injuring myocytes after affected by coxsackivevirus B3 ( CVB3) , then analyze cardiac myocyte mechanics. Results: Cell-mediated autoimmune response by coxsackivevirus B3 leads to cultured cardiac myocytes damage. The myocyte contractility was significantly lower in immune damaged cardiac myocytes than in normal myocytes. The decrease in contractility was more significant at 24 hours after inducing immunized white blood cells than at 12 hours. Conclusion: The cardiac myocyte contractility injured by immune response weaken.
, 百拇医药
Key words: immune damage; cardiac myocyte; contractility
病毒性心肌炎的发病机理尚不十分清楚, 目前认为细胞介导的免疫反应在病毒性心肌炎的发病中起着重要的作用[1]。本研究首先成功地建立病毒性心肌炎时自身免疫反应对心肌损伤的细胞模型, 在此基础上进行细胞力学测试, 以探讨病毒性心肌炎的免疫损伤机理, 为将来临床有效的治疗该病提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料:
(1) 病毒: 柯萨奇B3病毒, Woodruf亲心肌株。
(2) 实验动物: 6～8周的BALB/c鼠, 体重18～20克, 二级动物, 由华西医科大学实验动物中心提供。
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1.2 方法:
(1) 致敏细胞的制备: 20只BALB/c 鼠, 每只鼠腹腔内接种0.4毫升, 内含1×106 PFU(空斑形成单位)的柯萨奇B3病毒的Eagleye液, 以建立病毒性心肌炎的动物模型, 从实验开始日起每天观察记录动物生存情况, 共14天, 然后断头取血分离白细胞。同时处死的动物在无菌条件下取出心脏用20%甲醛固定送病理检查。
(2) 正常心肌细胞培养: 无菌条件下取出生2天的新生BALB/c 鼠10只 , 采用Kasten方法[2]培养心肌细胞, 并用孙红等报道的方法[3]进行体外培养心肌细胞的纯化, 然后传代接种多瓶再继续培养。
(3) 自身免疫反应心肌损伤细胞模型的建立: 用分离出的白细胞稀释为20×106/ml,取20微升接种在培养的正常心肌细胞的培养瓶内, 共4瓶, 分别在接种后定时观察心肌细胞的变化, 其中1瓶仅用于形态学观察共观察了48小时。
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(4) 心肌细胞细胞力学测定: 首先把正常心肌细胞置于连接了图像处理系统的倒置显微镜下进行检测, 其中包括:心肌细胞最大收缩速度(Vmax)、收缩末期时心肌细胞面积缩小的最大百分率(△Smax), 其反映了心肌细胞收缩时收缩力大小, 以及心肌细胞长度缩短的最大百分率 (△Lmax), 其也反映了心肌细胞收缩时心肌细胞收缩力大小, 以此作为评价心肌细胞收缩力参数的正常对照值。并对观测视野(5个/瓶, 共4瓶), 作好标记, 然后接种白细胞, 在接种白细胞后12小时、24小时选择能收缩的心肌细胞分别观察上述的心肌细胞收缩力的参数。
(5) 统计分析: 用F-检验分析正常细胞和免疫损伤心肌细胞后12小时、24小时的心肌细胞收缩力参数差异的统计学意义。
2 实验结果
经柯萨奇B3病毒免疫后的白细胞加入正常心肌细胞内培养, 对其心肌细胞收缩力有明显的影响, 在接种后12小时和24小时, Vmax由(230.9±24.2) μm/s 下降为(171.2±171.2) μm/s和(101.6±18.5) μm/s; △Smax 由(28.3±8.2%)下降为(14.7±2.8)%和(9.1±0.8)%; △Lmax由(21.3±4.3)%下降为(9.6±3.5)%和(6.9±0.9)%。经统计分析：正常心肌细胞与病毒免疫后12小时、24小时心肌细胞的参数比较，均有统计学差异。即造成收缩力的下降, 在接种后24小时的心肌细胞收缩力下降比12小时更为明显 (表1)。
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表1 自身免疫反应对离体心肌细胞收缩力参数的影响(n=15, x±s)
Vmax(um/s)
△Smax(%)
△Lmax(%)
正常心肌细胞
230.9±24.2
28.3±8.2
21.3±4.3
接种后12小时
171.2±20.3**
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14.7±2.8**
9.6±3.5**
接种后24小时
101.6±18.5#
9.1±0.8#
6.9±0.9△
F值
27.6*
40.5*
7.9*
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* P<0.01, 正常心肌细胞与免疫损伤后的心肌细胞相比
** P<0.001, 正常心肌细胞与接种后12小时比较
# P<0.001, 接种后12小时与接种后24小时比较
△ P<0.05, 接种后12小时与接种后24小时比较
3 讨论
细胞介导的免疫在机体抗病毒感染中起着重要作用, 然而, 病毒感染引起的宿主免疫功能紊乱和病毒感染细胞抗原性质改变, 可以使这种免疫反应造成对宿主组织细胞的损伤, 随着分子免疫学的发展, 许多研究从免疫学的角度提供了越来越多的证据提示病毒性心肌炎是一种自身免疫性疾病[4-6], 我们首次在国际上成功建立起自身免疫损伤的离体心肌细胞的模型, 然后在此基础上从细胞力学和分子生物学的角度更深入地探讨了病毒性心肌炎的发病机制, 为病毒性心肌炎的治疗提供了一定的理论依据。
, 百拇医药
以往的很多研究是通过建立病毒性心肌炎的动物模型, 然后检测各种免疫学的指标, 因此它受到了多种因素的影响, 包括神经、内分泌的影响, 同时病毒在细胞内的繁殖和扩增也直接对细胞造成损伤, 本研究成功地建立了自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 排除了上述因素的影响, 进一步证实了自身免疫反应在病毒性心肌炎的发病中起着重要的作用。同时为将来更进一步研究各种免疫细胞在病毒性心肌炎的发病中所起的作用奠定了实验基础。
利用自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 我们进行了心肌细胞的细胞力学的特性分析。 心肌细胞最大收缩速度 (Vmax) , 收缩末期时心肌细胞面缩小的百分率(△Smax) 以及心肌细胞长度缩短的百分率(△Lmax), 表示了心肌细胞面积以及心肌细胞长度大小, 它反映了心肌细胞内在收缩力的大小。自身免疫损伤的离体心肌细胞收缩力的参数都发生了改变。在没有心室压力负荷的条件下, 心肌细胞的收缩速度的减慢, 表明了内在心肌细胞的功能下降和收缩力减弱。因此在我们实验中观察到正常心肌细胞的收缩力参数Vmax , △Smax 和△Lmax值大,也就是说其收缩力强。而在免疫损伤的心肌细胞, 这些收缩力参数均明显下降。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500036)；CMB资助项目(CMB9513)
作者简介：万朝敏(1959年生)，女，北京人，华西医科大学第一临床医学院副教授， 硕士，从事感染性疾病及心血管力学研究.
参考文献：
[1] Seko Y, Shinka Y, Kawasaki A, et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J]. J Clin Invest. 1993;91:1327.
[2] Kasten FH. Mammalian myocardial cells. In: Kruse PF Jr, Patterson MK Jr, eds.Tissue Culture, methods and applications[M]. New York: Academic Press, 1973;72.
, 百拇医药
[3] 孙红. 体外培养心肌细胞的纯化方法及其应用[J]. 细胞生物学杂志, 1988;10:85.
[4] Seko Y, Ishiyama S, Nishikawa T et al. Restricted usage of T-cell receptor Vα-Vβ genes in infiltrating cells in the hearts of patients with acute myocarditis and dilated cardiomyopathy[J]. J Clin Invest. 1995; 96:1035.
[5] Seko Y, Enokawa Y, Yagita H, et al. Restricted usage of T-cell receptor Vαgenes in infiltrating cells in the murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J].J Pathol. 1996; 178:330.
[6] Seko Y, Takahashi N, Azuma M, et al. Effects of in vivo administration of anti-B7-1/B7-2 monoclonalantibodies on murine acute myocarditis caused by coxsackivirus B3[J].Circ Res, 1998; 82:613.
收稿日期：1999-08-31, 百拇医药
单位：万朝敏 周密 邓建军(华西医科大学 附属第二医院儿科)；俞红吉 吴泰相(华西医科大学 第一临床医学院)；高云钦 王正荣(华西医科大学 基础医学院，四川 成都 610041)
关键词：免疫损伤；心肌细胞；收缩力
中国医学物理学杂志000212 摘要：目的：探讨病毒性心肌炎时免疫损伤对心肌细胞损害的发病机理。方法：成功建立自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 在此基础上进行心肌细胞的细胞力学特性的分析。结果：免疫损伤对心肌细胞有明显的损害, 心肌细胞收缩力下降, 其中免疫损伤的心肌细胞在24小时的心肌收缩力下降比12小时更为明显. 结论：免疫损伤使心肌细胞收缩力下降。
中图分类号：R33.1.3+1 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(2000)02-0095-02
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Cardiac myocyte character of myocardial contractile
protein in vitro autoimmune mechanism caused by coxsackivirus B3
WAN Chao-min YU Hong-jie WU Tai-xiang
GAO Yun-qing ZHOU Mi DENG Jian-jun WANG Zheng-rong
(Department of pediatrics, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
Abstract: Objective: To determine the mechanism of cell-mediated autoimmune response caused by coxsackievirus B3 on cardiac myocyte. Methods: To set up cellular model of cell-mediated autoimmune injuring myocytes after affected by coxsackivevirus B3 ( CVB3) , then analyze cardiac myocyte mechanics. Results: Cell-mediated autoimmune response by coxsackivevirus B3 leads to cultured cardiac myocytes damage. The myocyte contractility was significantly lower in immune damaged cardiac myocytes than in normal myocytes. The decrease in contractility was more significant at 24 hours after inducing immunized white blood cells than at 12 hours. Conclusion: The cardiac myocyte contractility injured by immune response weaken.
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Key words: immune damage; cardiac myocyte; contractility
病毒性心肌炎的发病机理尚不十分清楚, 目前认为细胞介导的免疫反应在病毒性心肌炎的发病中起着重要的作用[1]。本研究首先成功地建立病毒性心肌炎时自身免疫反应对心肌损伤的细胞模型, 在此基础上进行细胞力学测试, 以探讨病毒性心肌炎的免疫损伤机理, 为将来临床有效的治疗该病提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料:
(1) 病毒: 柯萨奇B3病毒, Woodruf亲心肌株。
(2) 实验动物: 6～8周的BALB/c鼠, 体重18～20克, 二级动物, 由华西医科大学实验动物中心提供。
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1.2 方法:
(1) 致敏细胞的制备: 20只BALB/c 鼠, 每只鼠腹腔内接种0.4毫升, 内含1×106 PFU(空斑形成单位)的柯萨奇B3病毒的Eagleye液, 以建立病毒性心肌炎的动物模型, 从实验开始日起每天观察记录动物生存情况, 共14天, 然后断头取血分离白细胞。同时处死的动物在无菌条件下取出心脏用20%甲醛固定送病理检查。
(2) 正常心肌细胞培养: 无菌条件下取出生2天的新生BALB/c 鼠10只 , 采用Kasten方法[2]培养心肌细胞, 并用孙红等报道的方法[3]进行体外培养心肌细胞的纯化, 然后传代接种多瓶再继续培养。
(3) 自身免疫反应心肌损伤细胞模型的建立: 用分离出的白细胞稀释为20×106/ml,取20微升接种在培养的正常心肌细胞的培养瓶内, 共4瓶, 分别在接种后定时观察心肌细胞的变化, 其中1瓶仅用于形态学观察共观察了48小时。
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(4) 心肌细胞细胞力学测定: 首先把正常心肌细胞置于连接了图像处理系统的倒置显微镜下进行检测, 其中包括:心肌细胞最大收缩速度(Vmax)、收缩末期时心肌细胞面积缩小的最大百分率(△Smax), 其反映了心肌细胞收缩时收缩力大小, 以及心肌细胞长度缩短的最大百分率 (△Lmax), 其也反映了心肌细胞收缩时心肌细胞收缩力大小, 以此作为评价心肌细胞收缩力参数的正常对照值。并对观测视野(5个/瓶, 共4瓶), 作好标记, 然后接种白细胞, 在接种白细胞后12小时、24小时选择能收缩的心肌细胞分别观察上述的心肌细胞收缩力的参数。
(5) 统计分析: 用F-检验分析正常细胞和免疫损伤心肌细胞后12小时、24小时的心肌细胞收缩力参数差异的统计学意义。
2 实验结果
经柯萨奇B3病毒免疫后的白细胞加入正常心肌细胞内培养, 对其心肌细胞收缩力有明显的影响, 在接种后12小时和24小时, Vmax由(230.9±24.2) μm/s 下降为(171.2±171.2) μm/s和(101.6±18.5) μm/s; △Smax 由(28.3±8.2%)下降为(14.7±2.8)%和(9.1±0.8)%; △Lmax由(21.3±4.3)%下降为(9.6±3.5)%和(6.9±0.9)%。经统计分析：正常心肌细胞与病毒免疫后12小时、24小时心肌细胞的参数比较，均有统计学差异。即造成收缩力的下降, 在接种后24小时的心肌细胞收缩力下降比12小时更为明显 (表1)。
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表1 自身免疫反应对离体心肌细胞收缩力参数的影响(n=15, x±s)
Vmax(um/s)
△Smax(%)
△Lmax(%)
正常心肌细胞
230.9±24.2
28.3±8.2
21.3±4.3
接种后12小时
171.2±20.3**
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14.7±2.8**
9.6±3.5**
接种后24小时
101.6±18.5#
9.1±0.8#
6.9±0.9△
F值
27.6*
40.5*
7.9*
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* P<0.01, 正常心肌细胞与免疫损伤后的心肌细胞相比
** P<0.001, 正常心肌细胞与接种后12小时比较
# P<0.001, 接种后12小时与接种后24小时比较
△ P<0.05, 接种后12小时与接种后24小时比较
3 讨论
细胞介导的免疫在机体抗病毒感染中起着重要作用, 然而, 病毒感染引起的宿主免疫功能紊乱和病毒感染细胞抗原性质改变, 可以使这种免疫反应造成对宿主组织细胞的损伤, 随着分子免疫学的发展, 许多研究从免疫学的角度提供了越来越多的证据提示病毒性心肌炎是一种自身免疫性疾病[4-6], 我们首次在国际上成功建立起自身免疫损伤的离体心肌细胞的模型, 然后在此基础上从细胞力学和分子生物学的角度更深入地探讨了病毒性心肌炎的发病机制, 为病毒性心肌炎的治疗提供了一定的理论依据。
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以往的很多研究是通过建立病毒性心肌炎的动物模型, 然后检测各种免疫学的指标, 因此它受到了多种因素的影响, 包括神经、内分泌的影响, 同时病毒在细胞内的繁殖和扩增也直接对细胞造成损伤, 本研究成功地建立了自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 排除了上述因素的影响, 进一步证实了自身免疫反应在病毒性心肌炎的发病中起着重要的作用。同时为将来更进一步研究各种免疫细胞在病毒性心肌炎的发病中所起的作用奠定了实验基础。
利用自身免疫损伤的离体心肌细胞模型, 我们进行了心肌细胞的细胞力学的特性分析。 心肌细胞最大收缩速度 (Vmax) , 收缩末期时心肌细胞面缩小的百分率(△Smax) 以及心肌细胞长度缩短的百分率(△Lmax), 表示了心肌细胞面积以及心肌细胞长度大小, 它反映了心肌细胞内在收缩力的大小。自身免疫损伤的离体心肌细胞收缩力的参数都发生了改变。在没有心室压力负荷的条件下, 心肌细胞的收缩速度的减慢, 表明了内在心肌细胞的功能下降和收缩力减弱。因此在我们实验中观察到正常心肌细胞的收缩力参数Vmax , △Smax 和△Lmax值大,也就是说其收缩力强。而在免疫损伤的心肌细胞, 这些收缩力参数均明显下降。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500036)；CMB资助项目(CMB9513)
作者简介：万朝敏(1959年生)，女，北京人，华西医科大学第一临床医学院副教授， 硕士，从事感染性疾病及心血管力学研究.
参考文献：
[1] Seko Y, Shinka Y, Kawasaki A, et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J]. J Clin Invest. 1993;91:1327.
[2] Kasten FH. Mammalian myocardial cells. In: Kruse PF Jr, Patterson MK Jr, eds.Tissue Culture, methods and applications[M]. New York: Academic Press, 1973;72.
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[3] 孙红. 体外培养心肌细胞的纯化方法及其应用[J]. 细胞生物学杂志, 1988;10:85.
[4] Seko Y, Ishiyama S, Nishikawa T et al. Restricted usage of T-cell receptor Vα-Vβ genes in infiltrating cells in the hearts of patients with acute myocarditis and dilated cardiomyopathy[J]. J Clin Invest. 1995; 96:1035.
[5] Seko Y, Enokawa Y, Yagita H, et al. Restricted usage of T-cell receptor Vαgenes in infiltrating cells in the murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J].J Pathol. 1996; 178:330.
[6] Seko Y, Takahashi N, Azuma M, et al. Effects of in vivo administration of anti-B7-1/B7-2 monoclonalantibodies on murine acute myocarditis caused by coxsackivirus B3[J].Circ Res, 1998; 82:613.
收稿日期：1999-08-31, 百拇医药