通过凝胶电泳图像测定蛋白分子量的新方法-质心法
作者：王淑珍 谢新鹏
单位：王淑珍(第一军医大学 医工系)；谢新鹏(第一军医大学 中心实验室,广东 广州 510515)
关键词：质心；凝胶电泳；蛋白质分子量；迁移率
中国医学物理学杂志000222 摘要： 本文提出了利用凝胶图像的像素灰度值及蛋白区带的质心来确定其迁移率的方法- -质心法，并用质心法和最大灰度法分别对4种标准分子量蛋白质进行测定。实验结果表明 ，利用质心法测定的蛋白分子量比最大灰度法测定的更接近于标准分子量。
中图分类号：Q615 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(200 0)02-0117-02
The new methods of quantitating protein molecular
, http://www.100md.com
weight With gel electrophresis images-centroid methods
WANG Shu-zhen XIE Xin-peng
(Dept.Of BME, First Military Medical University)
(Central Laboratory, Guangzhou 510515,China)
Abstract: In this paper, we suggest the centroid method that the mobility is determined by means of pixel level of gel image and centroid of protein band. We qu antitate molecular weight of four standard proteins with the centoid method and the maximum gray level method specifically. The experimental results show the ce ntroid method has an advantage over the maximum gray level method.
, 百拇医药
Key words: centroid； gel electrophoresis; prote in molecular weight; mobility
引言：随着生物化学、分子生物学、 细胞生物学和免疫化学等领域的不断深入发展，对蛋白 质、核酸、酶等生物大分子的分离分析越来越显得重要。凝胶电泳因其简便、快捷、价格 便宜而广泛应用于蛋白、DNA等生物活性物质的分离分析。但由于蛋白质种类繁多，结构复 杂，具有生物学活性的特点，极易受外界因素干扰，建立和制造种类繁多的蛋白质标准品系 统是不可能的也是不现实的；因而人们提出了利用不同分子量的多个蛋白参照标准品作为对 照推断目标蛋白分子量的方法。而求出电泳后蛋白质的迁移率是测量其分子量的关键，目前 最常用的方法是最大灰度法[1,2]。本文提出一种通过确定蛋白质区带的质心来确 定其 迁移率的方法-质心法，同时将其测量结果与最大灰度法的结果进行比较，从而得出结论。
1 最大灰度法的缺陷和质心法的提出
, 百拇医药
利用数字化图像技术测量蛋白分子量的方法很多[3-5]，典型的如英国UVP公 司的GDAS系列图 像分析仪，其配套的凝胶电泳分子量分析软件采用的是直接扫描，沿蛋白质迁移的方向扫描 ，将每一点的灰度描绘下来，可以得到如图1a所示的灰度值(横坐标)。取灰度值最大位置 的纵坐标为蛋白质的迁移率。也有用y=(y1+y2)/2 作为蛋白质的迁移率的，如图 1(d) 。国外也曾见过报道[6]，取区带迁移率相同点积分值最大处为蛋白质电泳的迁移 率，如图1(b)。
以上几种方法在凝胶染色均匀，脱色干净，背景淡及区带不离散的情况下具有简单、 快 捷的特点。但当区带较为离散，出现两个或者多个最大灰度的峰值时，则较难识别；并且由 于蛋白不纯的原因，经常会出现拖尾现象，灰度分布不均匀。此时取前后距离和的一半计算 不能真实地体现此蛋白的迁移率；再者，在同一区带内，同一迁移轨迹上可能出现两个甚至 多个如图1(c)，这样若以最大灰度法作为迁移率就会出现多 个迁移率，影响测量的准确性；另外，偶尔出现的多个相同最 大灰度值，也给我们确定迁移率带来一定的困难。
, 百拇医药
针对以上最大灰度法的缺陷，本文提出通过确定每条蛋白质区带的质心来确定蛋白质的 迁移率的方法-质心法。质心是物体的质量中心，当系统中每个质点都在运动时，系统质 心的位置也要发生变化，由牛顿定律可知[7]，不管物体的质量如何分布，也不管 外力作用 在物体的什么地方，质心的运动就象是物体的全部质量都集中于一点，而且所有外力也都集 中作用其上的一个质点的运动一样，所以运动物质其质心是唯一的。
图1 分子量测定方法示意图
在SDS-PAGE电泳中，SDS与蛋白形成复合物，蛋白质的迁移 距离和蛋白质的质量相关，因而可用蛋白质质心的迁移距离来表示它的迁移率，其计算公式 为：
其中，Y0代表质心的坐标， Yi代表泳道中某一区带电泳Y轴方向迁移率的 坐标值，S表示蛋白区域，WA代表相对质量，IOD代表积分光密度。根据文献[8]，积分光密度可表示为：
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因而上式可变为：
其中，G0 、GC 、GB 分别表示凝胶电泳图象中空白点的灰度值、蛋白区带 某一点的灰度值和不含蛋白的凝胶区域某一点的灰度值。
测量时，以凝胶电泳图像左上角为坐标原点，加样孔为X轴。每个蛋白从加样孔开始，在 电场中按分子量大小迁移如图2所示。根据蛋白区带的边界对其进行扫描，读取每一泳道内 各区带每点的坐标值和灰度值，代入上述的公式，就可以得到每一区带质心的坐标。
图2 凝胶电泳图
2 实际测量结果比较
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根据蛋白质分子量大小与其迁移率的关系[3,9]：
lg(MW)=-b.mR+K
MW表示蛋白质的分子量，MR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在一定条件下， b和K为常数。分别用质心法和最大灰度法给出标准分子量的拟合曲线，然后分别 用这两种拟合曲线计算出目标蛋白的分子量，其结果如表1所示。
表1 用质心法和最大灰度法分别测量各种蛋白质分子量的结果 组别
标准分子量
×1000
测量结果
(
±s)×1000
, 百拇医药
最大灰度法
质心法
乳球蛋白
18.4
18.2±5.3
18.3±2.2
胰蛋白酶原
24.0
25.1±6.8
24.5±3.1
卵清蛋白
45.0
44.1±8.6
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45.2±5.1
牛血清白蛋白
66.0
70.2±10.6
68.7±8.9
3 结论
近年来，随着计算机图象技术的发展，使得蛋白分子量的测量更快捷、更精确。最大灰度法 通过对某一泳道自上而下扫描，根据各区带的最大灰度值来确定区带的迁移率，此法有一定 的局限性：扫描线为单线，随机性较大，重复性不佳；对于凝胶本身的吸收采取忽略或简单 地用蛋白区带的灰度减去凝胶背景的灰度，没有考虑到入射光的影响，不符合比尔定律；有 时在同一区带内出现两个或多个灰度相同的扫描峰值，难以准确地确定蛋白区带的迁移率。 而质心法根据牛顿定律而来，不存在最大灰度法的局限性，其测量精度较高(参照表1)； 虽然其计算较复杂、费时，但技术的发展可弥补这些不足。
, 百拇医药
作者简介：王淑珍(1971年生)，女，湖北黄岗人，第一军 医大学助教.
参考文献：
[1] 王绩，傅丽霞.凝胶电泳DNA相对分子量测定的软件设计[J].湖北医科大 学学报，1995，16(4):4：395-397.
[2] Oakley,B.R.,Kirsch,D.P., an Morris, N. R. (1980) Asimplified alt rasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gel[J]. Anal.Biochem，10 5:361.
[3] Southern EM. Measurement of DNA length by gel electrophoresis[J ]. Anal Biochem, 1979，100:319.
, http://www.100md.com
[4] Elder J.K, Amos A,Southern EM. Aeasurement of DNA length by gel electrophore sis I: mproved accuracy of mobility measurements using a digetal microdensitomet er and computer processing[J].Anal biochem, 1983，128:223-226.
[5] Elder J.K.,Southern EM. Aeasurement of DNA length by gel electro phoresis II: comparison of methods for relating mobility to fragment length[J]. Anal bioch em, 1983，128:227-231.
[6] Julian IR, Gawthorne JM. Apple software for analysis of the rest riction fragments[J]. Nucleic Acids Research, 1984， 12(1)：689-694.
[7] 程守诛. 普通物理学[M].上海：人民教育出版社，1981.
[8] 雷国华，李俊诗，周俊岭.通过凝胶电泳数字化图像分析蛋白含量的改进 方法[J].中国医学物理学杂志,1998,15(3)：183-185.
[9] 郭尧君.SDS电泳技术的实验考虑及最新进展[J].生物化学与生物物理进 展， 1991，18(1):32-37.
收稿日期：1999-07-23, 百拇医药
单位：王淑珍(第一军医大学 医工系)；谢新鹏(第一军医大学 中心实验室,广东 广州 510515)
关键词：质心；凝胶电泳；蛋白质分子量；迁移率
中国医学物理学杂志000222 摘要： 本文提出了利用凝胶图像的像素灰度值及蛋白区带的质心来确定其迁移率的方法- -质心法，并用质心法和最大灰度法分别对4种标准分子量蛋白质进行测定。实验结果表明 ，利用质心法测定的蛋白分子量比最大灰度法测定的更接近于标准分子量。
中图分类号：Q615 文献标识码：A 文章编号：1005-202X(200 0)02-0117-02
The new methods of quantitating protein molecular
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weight With gel electrophresis images-centroid methods
WANG Shu-zhen XIE Xin-peng
(Dept.Of BME, First Military Medical University)
(Central Laboratory, Guangzhou 510515,China)
Abstract: In this paper, we suggest the centroid method that the mobility is determined by means of pixel level of gel image and centroid of protein band. We qu antitate molecular weight of four standard proteins with the centoid method and the maximum gray level method specifically. The experimental results show the ce ntroid method has an advantage over the maximum gray level method.
, 百拇医药
Key words: centroid； gel electrophoresis; prote in molecular weight; mobility
引言：随着生物化学、分子生物学、 细胞生物学和免疫化学等领域的不断深入发展，对蛋白 质、核酸、酶等生物大分子的分离分析越来越显得重要。凝胶电泳因其简便、快捷、价格 便宜而广泛应用于蛋白、DNA等生物活性物质的分离分析。但由于蛋白质种类繁多，结构复 杂，具有生物学活性的特点，极易受外界因素干扰，建立和制造种类繁多的蛋白质标准品系 统是不可能的也是不现实的；因而人们提出了利用不同分子量的多个蛋白参照标准品作为对 照推断目标蛋白分子量的方法。而求出电泳后蛋白质的迁移率是测量其分子量的关键，目前 最常用的方法是最大灰度法[1,2]。本文提出一种通过确定蛋白质区带的质心来确 定其 迁移率的方法-质心法，同时将其测量结果与最大灰度法的结果进行比较，从而得出结论。
1 最大灰度法的缺陷和质心法的提出
, 百拇医药
利用数字化图像技术测量蛋白分子量的方法很多[3-5]，典型的如英国UVP公 司的GDAS系列图 像分析仪，其配套的凝胶电泳分子量分析软件采用的是直接扫描，沿蛋白质迁移的方向扫描 ，将每一点的灰度描绘下来，可以得到如图1a所示的灰度值(横坐标)。取灰度值最大位置 的纵坐标为蛋白质的迁移率。也有用y=(y1+y2)/2 作为蛋白质的迁移率的，如图 1(d) 。国外也曾见过报道[6]，取区带迁移率相同点积分值最大处为蛋白质电泳的迁移 率，如图1(b)。
以上几种方法在凝胶染色均匀，脱色干净，背景淡及区带不离散的情况下具有简单、 快 捷的特点。但当区带较为离散，出现两个或者多个最大灰度的峰值时，则较难识别；并且由 于蛋白不纯的原因，经常会出现拖尾现象，灰度分布不均匀。此时取前后距离和的一半计算 不能真实地体现此蛋白的迁移率；再者，在同一区带内，同一迁移轨迹上可能出现两个甚至 多个如图1(c)，这样若以最大灰度法作为迁移率就会出现多 个迁移率，影响测量的准确性；另外，偶尔出现的多个相同最 大灰度值，也给我们确定迁移率带来一定的困难。
, 百拇医药
针对以上最大灰度法的缺陷，本文提出通过确定每条蛋白质区带的质心来确定蛋白质的 迁移率的方法-质心法。质心是物体的质量中心，当系统中每个质点都在运动时，系统质 心的位置也要发生变化，由牛顿定律可知[7]，不管物体的质量如何分布，也不管 外力作用 在物体的什么地方，质心的运动就象是物体的全部质量都集中于一点，而且所有外力也都集 中作用其上的一个质点的运动一样，所以运动物质其质心是唯一的。
图1 分子量测定方法示意图
在SDS-PAGE电泳中，SDS与蛋白形成复合物，蛋白质的迁移 距离和蛋白质的质量相关，因而可用蛋白质质心的迁移距离来表示它的迁移率，其计算公式 为：
其中，Y0代表质心的坐标， Yi代表泳道中某一区带电泳Y轴方向迁移率的 坐标值，S表示蛋白区域，WA代表相对质量，IOD代表积分光密度。根据文献[8]，积分光密度可表示为：
, http://www.100md.com
因而上式可变为：
其中，G0 、GC 、GB 分别表示凝胶电泳图象中空白点的灰度值、蛋白区带 某一点的灰度值和不含蛋白的凝胶区域某一点的灰度值。
测量时，以凝胶电泳图像左上角为坐标原点，加样孔为X轴。每个蛋白从加样孔开始，在 电场中按分子量大小迁移如图2所示。根据蛋白区带的边界对其进行扫描，读取每一泳道内 各区带每点的坐标值和灰度值，代入上述的公式，就可以得到每一区带质心的坐标。
图2 凝胶电泳图
2 实际测量结果比较
, http://www.100md.com
根据蛋白质分子量大小与其迁移率的关系[3,9]：
lg(MW)=-b.mR+K
MW表示蛋白质的分子量，MR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在一定条件下， b和K为常数。分别用质心法和最大灰度法给出标准分子量的拟合曲线，然后分别 用这两种拟合曲线计算出目标蛋白的分子量，其结果如表1所示。
表1 用质心法和最大灰度法分别测量各种蛋白质分子量的结果 组别
标准分子量
×1000
测量结果
(
±s)×1000, 百拇医药
最大灰度法
质心法
乳球蛋白
18.4
18.2±5.3
18.3±2.2
胰蛋白酶原
24.0
25.1±6.8
24.5±3.1
卵清蛋白
45.0
44.1±8.6
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45.2±5.1
牛血清白蛋白
66.0
70.2±10.6
68.7±8.9
3 结论
近年来，随着计算机图象技术的发展，使得蛋白分子量的测量更快捷、更精确。最大灰度法 通过对某一泳道自上而下扫描，根据各区带的最大灰度值来确定区带的迁移率，此法有一定 的局限性：扫描线为单线，随机性较大，重复性不佳；对于凝胶本身的吸收采取忽略或简单 地用蛋白区带的灰度减去凝胶背景的灰度，没有考虑到入射光的影响，不符合比尔定律；有 时在同一区带内出现两个或多个灰度相同的扫描峰值，难以准确地确定蛋白区带的迁移率。 而质心法根据牛顿定律而来，不存在最大灰度法的局限性，其测量精度较高(参照表1)； 虽然其计算较复杂、费时，但技术的发展可弥补这些不足。
, 百拇医药
作者简介：王淑珍(1971年生)，女，湖北黄岗人，第一军 医大学助教.
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[1] 王绩，傅丽霞.凝胶电泳DNA相对分子量测定的软件设计[J].湖北医科大 学学报，1995，16(4):4：395-397.
[2] Oakley,B.R.,Kirsch,D.P., an Morris, N. R. (1980) Asimplified alt rasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gel[J]. Anal.Biochem，10 5:361.
[3] Southern EM. Measurement of DNA length by gel electrophoresis[J ]. Anal Biochem, 1979，100:319.
, http://www.100md.com
[4] Elder J.K, Amos A,Southern EM. Aeasurement of DNA length by gel electrophore sis I: mproved accuracy of mobility measurements using a digetal microdensitomet er and computer processing[J].Anal biochem, 1983，128:223-226.
[5] Elder J.K.,Southern EM. Aeasurement of DNA length by gel electro phoresis II: comparison of methods for relating mobility to fragment length[J]. Anal bioch em, 1983，128:227-231.
[6] Julian IR, Gawthorne JM. Apple software for analysis of the rest riction fragments[J]. Nucleic Acids Research, 1984， 12(1)：689-694.
[7] 程守诛. 普通物理学[M].上海：人民教育出版社，1981.
[8] 雷国华，李俊诗，周俊岭.通过凝胶电泳数字化图像分析蛋白含量的改进 方法[J].中国医学物理学杂志,1998,15(3)：183-185.
[9] 郭尧君.SDS电泳技术的实验考虑及最新进展[J].生物化学与生物物理进 展， 1991，18(1):32-37.
收稿日期：1999-07-23, 百拇医药