甲胎蛋白、癌胚抗原时间分辨荧光法与化学发光法比较
作者：王桂莲 朱利国 黄飚 蔡刚明 谭成 金坚
单位：江苏省江原医院，无锡241063
关键词：时间分辨荧光免疫分析；化学发光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原
南通医学院学报000219 [摘 要] DTPA法制备了Eu3+标单抗，采用夹心法建立了AFP和CEA IFMA。它们的灵敏度分别为43ng/L和90ng/L；批内CV为1.599%和1.36%；批间CV为7.139%和2.89%；平均回收率为103.98%和92.78%。与CLIA进行临床应用比较显示结果高度相关(AFP r=0.9040,CEA r=0.9705)。
[中图分类号] O657.39 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0159-01
, 百拇医药
EVALUATION OF TIME-RESOLVED IMMUNOFLUOROMETRIC ASSAY AND CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAY FOR AFP AND CEA
WANG Guilian，ZHU Liguo，HUANG Biao
(Jiang Yuan Hospital,Wu Xi 241063)
[Abstract] Two time-resolved Immunofluorometric assay (IFMA)of AFP and CEA were established with the two-sites "sandwich" method, by preparing Eu3+-MocAb using the DTPA method. Their sensitivities were 43ng/L and 90ng/L,respectively.The recovery rates were 103.98% and 92.78%. The inter- and inter-assay CV were 1.36% and 2.89% for CEA IFMA,1.599% and 7.139% from AFP IFMA. Compared these methods with Chemiluminescence Immunoassay for CIBACORNING Co for patients, they were interrelated with each other, repression eoafficients was 0.9040 for measured AFP, 0.9705 for measured CEA on clinical analysis.
, 百拇医药
[Key words] time-resolved Immunofluorometric assay;chemiluminescence Immunoassay;AFP;CEA
甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)是迄今较为肯定的肿瘤标志物[1]，已广泛用于临床肿瘤诊断，两者的检测已有RIA、EIA和IRMA等方法。近来发展的时间分辨荧光和化学发光测量技术，信噪比较高，分析灵敏度超过上述方法[2]。我们在完成了AFP、CEA 和IRMA工作的基础上，采用时间分辨荧光测量技术，建立了时间分辨免疫荧光分析(Time-resolved Immunofluorometric assay ，IFMA),并与化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay， CLIA)进行比较。
1 材料与方法
1.1 试剂与设备 抗CEA单抗C17和C50，抗AFP单抗137#和47#由无锡市第二制药厂提供。Eu3+标记盒(1244-302)，Eu3+发光增强液(B118-110)、AFP和CEA参考标准，EG&G-Wellac产品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)，Sigma产品。PD-10和Sepharose CL- 6B,Pharmecia产品。CA-19-9、CA-12-5和CA-15-3参考标准，AFP和CEA CLIA药盒，CIBA-CORNING产品。牛IgG自制。去离子超纯水由本室采用Barnsteed公司超纯水器(D7033)制备。96孔微孔板，Nunc产品。BSA,上海生物制品所产品。其他试剂均为国产分析纯。全自动IFMA检测仪(Auto DELFIA1235)为EG&G- Wellac 产品。全自动CLIA检测仪(ACS180)为CIBACORNING产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 CEA IFMA (1)固相C17和Eu3+-C50制备：将C17单抗用50nmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9.6释至10mg/L。每孔加200μl ,4℃放置过夜。Eu3+-C50制备参照Eu3+标记盒进行。每个C50 IgG上连接了13个Eu3+，产率达52.6%。(2)测定方法：用含8mmol/L NaCl,0.1%BSA,0.2%牛IgG,50μmol/L DTPA,0.1ml/L Tween-80和0.1%NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8为反应缓冲液，以含14.5 mmol/L NaCl,0.2ml/L Tween-80和0.2%NaN3的上述缓冲液为洗涤液。采用固相二步顺序夹心法建立CEA-IFMA，即在包被有C17的96孔微孔板上，每孔依次加入25μl CEA 参考标准或待测血清及200μl反应缓冲液，37℃振荡孵育2h后，用洗涤液洗4 次。再加200μl 1∶1000稀释的Eu3+-C50，37℃孵育1h，洗涤6次，加入增强液200μl，370170反应5min，荧光检测。全部过程均在Auto DELFIA1235上自动完成。
, 百拇医药
1.2.2 AFP IFMA (1)固相C47和Eu3+-C137制备：方法同上，每个C137 IgG上连接了7.52个Eu3+,产率达53.07%。(2)测定方法：反应缓冲液和洗涤液同上。采用固相二步顺序夹心法建立AFP-IFMA，C47包被板每孔依次加入25μl AFP参考标准或待测血清及200μl反应缓冲液，37℃孵育1h后，加200μl1∶1000稀释的Eu3+-C50，孵育1h。后续方法同上。
1.2.3 CEA和AFP CLIA 参照药盒说明书，全部过程均在ACS180上自动完成。
2 结 果
2.1 CEA IFMA 以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析，CEA IFMA的灵敏度为90ng/L；AFP对本法无交叉反应，CA-19-9的交叉反应可达2.81%；方法的批内和批间CV分别为1.36%和2.89%。平均回收率为92.78%，可测范围为1.45～508.9μg/L。
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2.2 AFP IFMA 以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析，AFP IFMA的灵敏度为43ng/L；CEA、CA-12-5、CA-15-3和CA-19-9对方法无交叉反应；方法的批内和批间CV分别为1.599%和7.139%。平均回收率为103.98%；可测范围为4.22～1210μg/L。
2.3 IFMA与CLIA同步比较 137例正常人经CEA IFMA和CLIA测量，结果高度相关(r=0.9705)，图1。148例正常人经AFP IFMA和CLIA测量，结果相符(r=0.9040)，图2。
图1 CEA-IFMA与CEA-CLIA的相关关系
图2 AFP-IFMA与AFP-CLIA的相关关系
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3 讨 论
以往超微量免疫分析技术应用的普遍问题是稳定性难以满足临床工作的需要。鉴于放射性同位素示踪剂自身衰变或保存条件苛刻及自分解变性失活等原因[3]，对于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使单样品检测也必须做标准曲线作相对测量的依据。EIA本身方法学的原因，不能完全定量[4]。我们建立的AFP和CEA IFMA同批试剂连续5个月临床应用分析，标准曲线基本重合，无明显漂移。可以用同批试剂单次标准曲线作为今后分析的固定参考曲线。CIBA-CORNING的CLIA试剂盒也同样可重复且稳定。就IFMA和CLIA经临床同步比较，结果相关性好。同时我们也与我们自己的IRMA比较，结果也高度相关，说明上述两种方法可取代以往的AFP和CEA分析方法。从方法学的考核情况看，多数指标与IRMA类同，但方法学稳定性显著优于IRMA。 就IFMA与CLIA临床比较方面，后者检测速度明显优于前者，可作临床急诊诊断。而前者适合大批量的样品检测，稳定性更高，可测范围更宽，理论分析灵敏度更高。尤其是镧系元素多标记技术的研究开发，使IFMA有可能成为象生化分析仪样的一次分析多个分析结果产生的前景。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] NIH consensus Statement.Carcinoembyonic antigen：It's role as marker in the management of cancer[J]. Cancer Res,1981,41∶2017.
[2] Suonpaa MU,Lavi JT,Hemmila I.A new sensitive assay of human alpha-fetoprotein using time-resolved fluorescence and monoclonal antibodies[J].Clin Chim Acta,1985,145,341-348.
[3] Rosalyn S,Yalow.Update radioimmunoassay[J].中华核医学杂志,1989,9∶1.
[4] 黄 飚，浦洪波，朱寒珍，等.癌胚抗原试管固相免疫放射分析[J].核技术，1995，18∶699.
(1999-10-14收稿), http://www.100md.com
单位：江苏省江原医院，无锡241063
关键词：时间分辨荧光免疫分析；化学发光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原
南通医学院学报000219 [摘 要] DTPA法制备了Eu3+标单抗，采用夹心法建立了AFP和CEA IFMA。它们的灵敏度分别为43ng/L和90ng/L；批内CV为1.599%和1.36%；批间CV为7.139%和2.89%；平均回收率为103.98%和92.78%。与CLIA进行临床应用比较显示结果高度相关(AFP r=0.9040,CEA r=0.9705)。
[中图分类号] O657.39 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)02-0159-01
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EVALUATION OF TIME-RESOLVED IMMUNOFLUOROMETRIC ASSAY AND CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASSAY FOR AFP AND CEA
WANG Guilian，ZHU Liguo，HUANG Biao
(Jiang Yuan Hospital,Wu Xi 241063)
[Abstract] Two time-resolved Immunofluorometric assay (IFMA)of AFP and CEA were established with the two-sites "sandwich" method, by preparing Eu3+-MocAb using the DTPA method. Their sensitivities were 43ng/L and 90ng/L,respectively.The recovery rates were 103.98% and 92.78%. The inter- and inter-assay CV were 1.36% and 2.89% for CEA IFMA,1.599% and 7.139% from AFP IFMA. Compared these methods with Chemiluminescence Immunoassay for CIBACORNING Co for patients, they were interrelated with each other, repression eoafficients was 0.9040 for measured AFP, 0.9705 for measured CEA on clinical analysis.
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[Key words] time-resolved Immunofluorometric assay;chemiluminescence Immunoassay;AFP;CEA
甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)是迄今较为肯定的肿瘤标志物[1]，已广泛用于临床肿瘤诊断，两者的检测已有RIA、EIA和IRMA等方法。近来发展的时间分辨荧光和化学发光测量技术，信噪比较高，分析灵敏度超过上述方法[2]。我们在完成了AFP、CEA 和IRMA工作的基础上，采用时间分辨荧光测量技术，建立了时间分辨免疫荧光分析(Time-resolved Immunofluorometric assay ，IFMA),并与化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay， CLIA)进行比较。
1 材料与方法
1.1 试剂与设备 抗CEA单抗C17和C50，抗AFP单抗137#和47#由无锡市第二制药厂提供。Eu3+标记盒(1244-302)，Eu3+发光增强液(B118-110)、AFP和CEA参考标准，EG&G-Wellac产品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)，Sigma产品。PD-10和Sepharose CL- 6B,Pharmecia产品。CA-19-9、CA-12-5和CA-15-3参考标准，AFP和CEA CLIA药盒，CIBA-CORNING产品。牛IgG自制。去离子超纯水由本室采用Barnsteed公司超纯水器(D7033)制备。96孔微孔板，Nunc产品。BSA,上海生物制品所产品。其他试剂均为国产分析纯。全自动IFMA检测仪(Auto DELFIA1235)为EG&G- Wellac 产品。全自动CLIA检测仪(ACS180)为CIBACORNING产品。
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1.2 方法
1.2.1 CEA IFMA (1)固相C17和Eu3+-C50制备：将C17单抗用50nmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9.6释至10mg/L。每孔加200μl ,4℃放置过夜。Eu3+-C50制备参照Eu3+标记盒进行。每个C50 IgG上连接了13个Eu3+，产率达52.6%。(2)测定方法：用含8mmol/L NaCl,0.1%BSA,0.2%牛IgG,50μmol/L DTPA,0.1ml/L Tween-80和0.1%NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8为反应缓冲液，以含14.5 mmol/L NaCl,0.2ml/L Tween-80和0.2%NaN3的上述缓冲液为洗涤液。采用固相二步顺序夹心法建立CEA-IFMA，即在包被有C17的96孔微孔板上，每孔依次加入25μl CEA 参考标准或待测血清及200μl反应缓冲液，37℃振荡孵育2h后，用洗涤液洗4 次。再加200μl 1∶1000稀释的Eu3+-C50，37℃孵育1h，洗涤6次，加入增强液200μl，370170反应5min，荧光检测。全部过程均在Auto DELFIA1235上自动完成。
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1.2.2 AFP IFMA (1)固相C47和Eu3+-C137制备：方法同上，每个C137 IgG上连接了7.52个Eu3+,产率达53.07%。(2)测定方法：反应缓冲液和洗涤液同上。采用固相二步顺序夹心法建立AFP-IFMA，C47包被板每孔依次加入25μl AFP参考标准或待测血清及200μl反应缓冲液，37℃孵育1h后，加200μl1∶1000稀释的Eu3+-C50，孵育1h。后续方法同上。
1.2.3 CEA和AFP CLIA 参照药盒说明书，全部过程均在ACS180上自动完成。
2 结 果
2.1 CEA IFMA 以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析，CEA IFMA的灵敏度为90ng/L；AFP对本法无交叉反应，CA-19-9的交叉反应可达2.81%；方法的批内和批间CV分别为1.36%和2.89%。平均回收率为92.78%，可测范围为1.45～508.9μg/L。
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2.2 AFP IFMA 以零剂量测量结果均值加上0.2S代入标准曲线分析，AFP IFMA的灵敏度为43ng/L；CEA、CA-12-5、CA-15-3和CA-19-9对方法无交叉反应；方法的批内和批间CV分别为1.599%和7.139%。平均回收率为103.98%；可测范围为4.22～1210μg/L。
2.3 IFMA与CLIA同步比较 137例正常人经CEA IFMA和CLIA测量，结果高度相关(r=0.9705)，图1。148例正常人经AFP IFMA和CLIA测量，结果相符(r=0.9040)，图2。
图1 CEA-IFMA与CEA-CLIA的相关关系
图2 AFP-IFMA与AFP-CLIA的相关关系
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3 讨 论
以往超微量免疫分析技术应用的普遍问题是稳定性难以满足临床工作的需要。鉴于放射性同位素示踪剂自身衰变或保存条件苛刻及自分解变性失活等原因[3]，对于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使单样品检测也必须做标准曲线作相对测量的依据。EIA本身方法学的原因，不能完全定量[4]。我们建立的AFP和CEA IFMA同批试剂连续5个月临床应用分析，标准曲线基本重合，无明显漂移。可以用同批试剂单次标准曲线作为今后分析的固定参考曲线。CIBA-CORNING的CLIA试剂盒也同样可重复且稳定。就IFMA和CLIA经临床同步比较，结果相关性好。同时我们也与我们自己的IRMA比较，结果也高度相关，说明上述两种方法可取代以往的AFP和CEA分析方法。从方法学的考核情况看，多数指标与IRMA类同，但方法学稳定性显著优于IRMA。 就IFMA与CLIA临床比较方面，后者检测速度明显优于前者，可作临床急诊诊断。而前者适合大批量的样品检测，稳定性更高，可测范围更宽，理论分析灵敏度更高。尤其是镧系元素多标记技术的研究开发，使IFMA有可能成为象生化分析仪样的一次分析多个分析结果产生的前景。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] NIH consensus Statement.Carcinoembyonic antigen：It's role as marker in the management of cancer[J]. Cancer Res,1981,41∶2017.
[2] Suonpaa MU,Lavi JT,Hemmila I.A new sensitive assay of human alpha-fetoprotein using time-resolved fluorescence and monoclonal antibodies[J].Clin Chim Acta,1985,145,341-348.
[3] Rosalyn S,Yalow.Update radioimmunoassay[J].中华核医学杂志,1989,9∶1.
[4] 黄 飚，浦洪波，朱寒珍，等.癌胚抗原试管固相免疫放射分析[J].核技术，1995，18∶699.
(1999-10-14收稿), http://www.100md.com