登革病毒的研究进展
作者：方美玉 林立辉
单位：510507 广州军区军事医学研究所
关键词：
中华传染病杂志000232 登革病毒(DEN)属于黄病毒科，分为四个血清型，可引起登革热和登革出血热两种不同类型的急性传染病。主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。广泛流行于热带和亚热带地区，是分布最广，发病最多，危害较大的一种传染病。其临床表现主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疹、淋巴结肿和白血球减少。可引起较大规模的流行。登革出血热是以高热、出血、休克和高病死率为特征。
近年来登革热及登革出血热在亚洲，太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已造成严重的威胁。下面对登革病毒的研究进展作一简要概述。
一、登革病毒基因组结构
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登革病毒基因组为单链、正股RNA，长约11 kb，病毒RNA具感染性，其基因组RNA的5′端有Ⅰ型帽子结构。在3′末端没有发现多聚A结构，但有一个十分保守的核苷酸序列，是形成3′末端二级结构的一部分。可能对RNA的复制和核壳化是非常重要的。
目前登革病毒1～4型的基因序列均已清楚，cDNA序列分析表明，病毒RNA只含有一个长的开放读码框架，约96%的核苷酸在此框架内，登革病毒基因组分为二个区段：5′端1/4编码病毒3个结构蛋白，3′端3/4编码7个非结构蛋白。基因组的5′端和3′端均有一段非编码区。整个基因的编码顺序为：5′-Ⅰ型帽子结构-非编码序列-AUG -C蛋白(核衣壳蛋白)基因-M蛋白(膜蛋白)基因-E蛋白基因(包膜蛋白)-NS1基因-NS2a基因-NS2b基因-NS3基因-NS4a基因-NS4b基因-NS5基因-非编码序列。
二、毒粒蛋白的结构与功能
(一)E蛋白 全长494个氨基酸，相对分子质量近60 000，是毒粒的主要包膜蛋白，它有中和抗原表位，有型特异表位，又有DEN种及黄病毒属特异性表位。
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根据E基因序列分析及带二硫键的不同抗原决定簇的结构特性，国外学者提出了一种E蛋白结构模型[1]。这个模型主要由三个不重叠的抗原区A、B和C组成。A、B两区含有不连续的抗原决定簇，它的完整性有赖于通过二硫键形成的空间结构，而变异性高的C区则没有二硫键，此区的抗原决定簇不能被还原作用、羧甲基化作用、SDS变性作用而灭活。以上三个区占整个E蛋白的绝大部分，在包膜表面形成突起，是DEN参与分子识别的重要结构，在DEN的致病和免疫中起着至关重要的作用。
E蛋白在毒粒与宿主细胞之间相互作用的过程中发挥着重要的功能。E蛋白可能是某些宿主细胞表面受体的配体，E蛋白与受体的结合，可能促进DEN对细胞的感染。它可能还是一种膜融合蛋白，当毒粒与宿主细胞接触时，E蛋白可能在细胞表面诱导毒粒包膜与细胞膜的融合，从而促进毒粒进入细胞引起感染。
E蛋白的A、B两区存在有诱导中和抗体产生以及和血凝作用有关的抗体表位，它能诱导宿主产生保护性的中和抗体，又能诱导产生血凝抑制抗体。还可能会引起抗体依赖的增强感染作用(ADE)。而ADE可导致登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)[2～4]。
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(二)C蛋白和PrM及M蛋白 C蛋白是核衣壳蛋白，富含有赖氨酸和精氨酸，相对分子质量约13 500，病毒基因组的翻译起始于衣壳蛋白。在C蛋白之后的PrM蛋白，是一种糖蛋白，为M蛋白的前体，在病毒成熟过程中PrM糖蛋白经特异性酶切后形成一个相对分子质量约8 000的M蛋白，它能导致病毒感染增强，并形成毒粒的表面结构[5]。
(三) 非结构蛋白(NS)1～5 NS1、NS2、NS3、NS4和NS5等非结构蛋白在病毒复制过程中的作用，目前尚不十分清楚。但已有资料表明，NS1和NS3在病毒免疫反应中起重要作用。
NS1是一种糖蛋白，相对分子质量为48 000，较多学者报道用NS1免疫小鼠后，能诱导小鼠产生针对同型DEN致死性的攻击具有保护作用的抗体[6]。
NS3是一种相对分子质量为70 000左右的亲水蛋白，其N端区域与胰蛋白样丝氨酸蛋白酶有同肽段，而C端序列参加核酸复制的蛋白酶序列相似，因此可能同时具有两种酶活性[7]。NS3与NS1一样既具有反应原性，又具有免疫原性，用NS3免疫小鼠后同样可诱导产生具有保护作用的抗体。
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三、登革出血热的发病机制
DHF或DSS多发生在第2次感染异型DEN的患者或母亲抗DEN抗体阳性的婴儿中，病死率高。因此其发病机制一直是国内外研究的重要课题，但至今还没有完全阐明。概括许多学者研究的结果提出了以下几种发病机制[8，9]。
(一)依赖抗体增强感染(ADE)作用 ADE学说认为：当感染某一型DEN后产生的抗体能与所有四型的DEN起交叉反应。这些异型抗体或亚中和浓度的抗体，虽然能与病毒颗粒相结合，却不能起中和作用，而是形成病毒抗体复合物，并通过IgG的Fc受体(FcR)结合到单核细胞系表面，随着吞噬作用病毒进入细胞内，并在细胞内繁殖，引起单核细胞系感染。被DEN感染的单核巨噬细胞系又被机体的免疫清除反应和一些内源性刺激物所激活，释放出裂解补体3(C3)的酶、血管通透因子和凝血致活酶，进而导致弥漫性血管内凝血(DIC)、出血、休克等一系列病理过程。现已阐明，DEN颗粒和相应的IgG抗体形成的病毒抗体复合物主要是通过IgG Fc段吸附到细胞上导致感染增强作用。
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(二)细胞免疫作用 近年来人们发现细胞免疫在DHF/DSS形成中也起重要的作用。(1)CD4+、CD8-细胞：这类细胞在病毒感染中辅助B细胞产生抗体，人们推测在DEN感染所致的DHF/DSS发病机制中，宿主细胞的交叉免疫反应可能与之有关。Kurane等研究表明，CD4+、CD8-特异性T细胞具有辅助活性，在增殖反应中能产生IFN-γ,而后者可促进单核细胞FcR的表达，从而增强感染。(2)CD4-、CD8+、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：国外学者报道用DEN4型免疫人的外周血单个核细胞(PBMC)，在体外再用DEN4型刺激，可产生特异性且具有血清型交叉反应性的CD4-、CD8+表型的CTL克隆株，它们能溶解DEN感染的细胞和接触过所有四型DEN抗原的细胞。另有报道表明在DHF、DSS患者中CD8+T细胞的活化程度明显高于登革热患者，所以具有型交叉反应的CD8+毒性T细胞可能是DEN第二次感染期间导致免疫病理的主要介导物之一。
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(三)细胞因子的作用 近年来人们也发现在DHF发病机制研究中，一些DEN诱导的细胞因子也起一定的作用。Krishnamurti等研究表明用DEN感染人的单核细胞后，能使尿激酶的抑制物(PA1～2)浓度升高，从而影响纤维蛋白的溶解，促进纤维蛋白沉积，导致出血。另有学者也报道DEN感染的小鼠其淋巴细胞、巨噬细胞可分别产生抑制因子SF1和3SF2，从而抑制一系列免疫反应；DEN感染的小鼠脾T细胞能产生细胞毒因子CF1和CF2，可导致免疫系统损伤，使特异和非特异免疫功能均下降。体内研究也表明感染DEN会导致各类T细胞的激活并释放细胞因子IL-2,IFN-γ、组胺，过敏素C3a、C5a等，可引起感染加重、休克、循环衰竭和出血等表现。
上述这些机制可以解释大多数的DHF/DSS的发病机制，但对于第一次感染DEN出现的DHF/DSS患者却无法解释。总之，对于DHF/DSS的发病机制还有待进一步研究。
四、登革病毒的基因诊断
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DEN感染的诊断，过去主要依靠病毒分离和血清学检测，这些方法比较繁琐、费事，而且早期性，敏感性和特异性都较差。近年来逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交等新技术的建立，使对DEN的诊断进入到分子生物学的新阶段。应用RT-PCR检测DEN国内外均有报道，有的学者应用一对通用引物来扩增，可以同时检测DEN四个型的病毒，然后应用内引物鉴别四个型，或者应用核酸杂交和酶切分析的方法来进一步鉴定。有的学者合成了型特异的引物，每一对引物检测一个型别。Laille等[10]应用RT-PCR的方法证明了6例患者同时感染DEN1型和3型，且用特异性探针杂交法进一步证实这6例患者确为双重感染。Lanciotti等[11]设计了一对通用引物，可以同时扩增4个型的DEN，最后用型特异探针杂交或用型特异引物作套式PCR，可以鉴别4个型的DEN。
原位杂交技术已被作为诊断病毒性疾病及其发病机制研究的一个重要手段，它是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。Killen等[12]报道应用原位杂交技术检测了不同血清型DEN RNA；临床上，应用该方法从DHF患者的白细胞涂片以及DSS死者胸腺切片中检出DEN RNA。同时比较了长、短两种基因探针的敏感性，结果表明：长探针(260 bp)杂交实验敏感性更高，能够测出更多的受染细胞。
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总之，应用分子生物学技术检测DEN基因为该类疾病的早期快速诊断和监测流行提供了先进可靠的方法，对DEN作进一步的分子病毒学研究具有重要意义。
五、登革热的预防和控制
登革热的预防主要是防止传染源的传入、传播媒介的控制和疫苗的接种。目前主要是依靠蚊媒控制的办法来预防和控制登革热的传播。但是真正控制登革热流行的关键在于疫苗的研制成功。
国外学者研究得较早的是减毒活疫苗、DEN1～4型混合的减毒活疫苗在志愿者体内试用，已获得较好的免疫效果[13]。但减毒株的稳定性差，如果减毒不充分的话，有可能引起临床症状，且可能发生因ADE而导致的登革热和DSS的潜在危险。因此近年来，人们注意亚单位疫苗的研究。Zhao等[14]将DEN4型的结构蛋白及非结构蛋白NS1插入痘苗病毒载体成功地表达了PreM-E-NS1融合蛋白，并对动物有较好的免疫保护作用。一般认为，ADE与病毒的结构蛋白有关，因此非结构蛋白NS1产生疫苗可能不会诱导ADE。Schlesinger等[6]从感染细胞中纯化DEN2型的NS1接种小鼠后，可保护小鼠免受脑内病毒攻击，接种猴子后，再用致死剂量的病毒攻击，有4/5可获得保护。Zhang等[15]利用重组杆状病毒表达了DEN4型的NS1基因，用其免疫小鼠后，可抵抗同型病毒的致死性脑内攻击。
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近年来，国外学者对建立DEN全基因感染cDNA克隆和嵌合病毒疫苗作了报道[16～18]，DEN4型感染性全基因cDNA克隆已构建成功，并用DEN1型或DEN2型的结构蛋白取代DEN4型cDNA克隆的结构蛋白而产生两型内嵌合病毒。两个子代嵌合病毒显示出DEN1型或DEN2型的血清型特异性。DEN1/DEN4嵌合疫苗接种恒河猴实验表明，有3/4的猴产生了针对DEN1型的中和抗体，并能够抵抗DEN1型的攻击，DEN2/DEN4嵌合疫苗接种4只猴子，全部产生了中和抗体，并能够抵抗DEN2的攻击。研究结果提示：这种嵌合病毒疫苗将有可能研制成为人类DEN的减毒活疫苗。
核酸疫苗技术是近年来兴起的第三代疫苗技术，它为亚单位疫苗的研究提供了一条新的途径，它既有重组亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗诱导免疫应答的高效力。因此已有学者开始将它引入DEN疫苗的研究之中。相信不久将来，在DEN疫苗的研究中会有新的突破。
综上所述，近年来全世界每年约有2.5亿人受到登革热的威胁。由于城市化扩大，人口的快速增长，垃圾处理不当，国际旅游增多，使DEN感染具有扩大的趋势，发病率不断增高。因此国内外学者对DEN的研究非常重视，但目前，登革热的发病机制，特效治疗以及疫苗等问题尚未根本解决，其流行规律、宿主动物等尚不清楚，还有待进一步的探索研究
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参考文献
1，Mandl CW,Guirakhoo F,Holzmann H,et al.Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level,using tick-borne encephalits virus as a model.J Virol,1989,63:564-571.
2，Gollins SW,Porterfield JS.Flavivirus infection enhancement in
macrophages:an electron microscopic study of viral cellular entry.J Gen Virol,1985,66:1969-1982.
3，Gollins SW,Porterfield JS.A new mechanism for the neutralization of enveloped viruses by an antiviral antibody.Nature,1986,321:244-246.
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4，Kimura T,Ohyama A.Association between the pH-dependent conformational change of West Nile flavivirus E protein and virus-mediated membrane fusion.J Gen Virol,1988,69:1247-1254.
5，Randolph VB,Winkler G,Stollar V.Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein.Virology,1990,174:450-458.
6，Schlesinger JJ,Brandriss MW,Walsh EE.Protection of mice against dengue 2 virus encephalitis by immunization with the dengue 2 virus non-structural glycoprotein NS1.J Gen Virol,1987,68:853-857.
, 百拇医药
7，Bazan JF,Fletterick RJ.Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses.Virology,1989,171:637-639.
8，徐伟文.登革出血热致病机理研究进展.中国人兽共患病杂志，1998，14:68-70.
9，曹艳英.登革病毒感染的免疫与免疫病理的研究进展.国外医学微生物学分册，1995，18：11-13.
10，Laille M,Deubel V,Sainte FF.Demonstration of concurrent dengue 1 and dengue 3 infection in six patients by the polymerase chain reaction.J Med Virol,1991,34:51-54.
, 百拇医药
11，Lanciotti RS,Calisher CH,Gubler DJ,et al.Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction.J Clin Microbiol,1992,30:545-551.
12，Killen H,Osullivan MA.Detection of dengue virus by in situ hybridization,J Virol Methods,1993,41:135-146.
13，Bancroft WH,Scott RM,Eckels KH,et al.Dengue virus type 2 vaccine:reactogenicity and immunogenicity in soldiers.J Infect Dis,1984,149:1005-1010.
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14，Zhao BT,Prince G,Horswood R,et al.Expression of dengue virus structural protein and nonstructural protein NS1 by a recombinant vaccinia virus.J Virol,1987,61:4019-4022.
15，Zhang YM,Hayes EP,McCarty TC,et al.Immunization of mice with dengue structural proteins and nonstructural protein NS1 expressed by baculovirus recombinant induces resistance to dengue virus encephalitis.J Virol,1988,62:3027-3031.
16，Lai CJ,Zhao B,Hori H,et al.Infectious RNA transcribed from stably cloned full-length cDNA of dengue type 4 virus.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:5139-5143.
, 百拇医药
17，Bray M and Lai CJ.Construction of intertypic chimeric dengue viruses by substitution of structural protein genes.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10342-10346.
18，Bray M,Men R,Lai CJ.Monkeys immunized with intertypic chimeric dengue virus are protected against wild-type virus challenge.J Virol,1996,70:4162-4166.
收稿日期：1999-03-02, 百拇医药
单位：510507 广州军区军事医学研究所
关键词：
中华传染病杂志000232 登革病毒(DEN)属于黄病毒科，分为四个血清型，可引起登革热和登革出血热两种不同类型的急性传染病。主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。广泛流行于热带和亚热带地区，是分布最广，发病最多，危害较大的一种传染病。其临床表现主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疹、淋巴结肿和白血球减少。可引起较大规模的流行。登革出血热是以高热、出血、休克和高病死率为特征。
近年来登革热及登革出血热在亚洲，太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已造成严重的威胁。下面对登革病毒的研究进展作一简要概述。
一、登革病毒基因组结构
, 百拇医药
登革病毒基因组为单链、正股RNA，长约11 kb，病毒RNA具感染性，其基因组RNA的5′端有Ⅰ型帽子结构。在3′末端没有发现多聚A结构，但有一个十分保守的核苷酸序列，是形成3′末端二级结构的一部分。可能对RNA的复制和核壳化是非常重要的。
目前登革病毒1～4型的基因序列均已清楚，cDNA序列分析表明，病毒RNA只含有一个长的开放读码框架，约96%的核苷酸在此框架内，登革病毒基因组分为二个区段：5′端1/4编码病毒3个结构蛋白，3′端3/4编码7个非结构蛋白。基因组的5′端和3′端均有一段非编码区。整个基因的编码顺序为：5′-Ⅰ型帽子结构-非编码序列-AUG -C蛋白(核衣壳蛋白)基因-M蛋白(膜蛋白)基因-E蛋白基因(包膜蛋白)-NS1基因-NS2a基因-NS2b基因-NS3基因-NS4a基因-NS4b基因-NS5基因-非编码序列。
二、毒粒蛋白的结构与功能
(一)E蛋白 全长494个氨基酸，相对分子质量近60 000，是毒粒的主要包膜蛋白，它有中和抗原表位，有型特异表位，又有DEN种及黄病毒属特异性表位。
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根据E基因序列分析及带二硫键的不同抗原决定簇的结构特性，国外学者提出了一种E蛋白结构模型[1]。这个模型主要由三个不重叠的抗原区A、B和C组成。A、B两区含有不连续的抗原决定簇，它的完整性有赖于通过二硫键形成的空间结构，而变异性高的C区则没有二硫键，此区的抗原决定簇不能被还原作用、羧甲基化作用、SDS变性作用而灭活。以上三个区占整个E蛋白的绝大部分，在包膜表面形成突起，是DEN参与分子识别的重要结构，在DEN的致病和免疫中起着至关重要的作用。
E蛋白在毒粒与宿主细胞之间相互作用的过程中发挥着重要的功能。E蛋白可能是某些宿主细胞表面受体的配体，E蛋白与受体的结合，可能促进DEN对细胞的感染。它可能还是一种膜融合蛋白，当毒粒与宿主细胞接触时，E蛋白可能在细胞表面诱导毒粒包膜与细胞膜的融合，从而促进毒粒进入细胞引起感染。
E蛋白的A、B两区存在有诱导中和抗体产生以及和血凝作用有关的抗体表位，它能诱导宿主产生保护性的中和抗体，又能诱导产生血凝抑制抗体。还可能会引起抗体依赖的增强感染作用(ADE)。而ADE可导致登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)[2～4]。
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(二)C蛋白和PrM及M蛋白 C蛋白是核衣壳蛋白，富含有赖氨酸和精氨酸，相对分子质量约13 500，病毒基因组的翻译起始于衣壳蛋白。在C蛋白之后的PrM蛋白，是一种糖蛋白，为M蛋白的前体，在病毒成熟过程中PrM糖蛋白经特异性酶切后形成一个相对分子质量约8 000的M蛋白，它能导致病毒感染增强，并形成毒粒的表面结构[5]。
(三) 非结构蛋白(NS)1～5 NS1、NS2、NS3、NS4和NS5等非结构蛋白在病毒复制过程中的作用，目前尚不十分清楚。但已有资料表明，NS1和NS3在病毒免疫反应中起重要作用。
NS1是一种糖蛋白，相对分子质量为48 000，较多学者报道用NS1免疫小鼠后，能诱导小鼠产生针对同型DEN致死性的攻击具有保护作用的抗体[6]。
NS3是一种相对分子质量为70 000左右的亲水蛋白，其N端区域与胰蛋白样丝氨酸蛋白酶有同肽段，而C端序列参加核酸复制的蛋白酶序列相似，因此可能同时具有两种酶活性[7]。NS3与NS1一样既具有反应原性，又具有免疫原性，用NS3免疫小鼠后同样可诱导产生具有保护作用的抗体。
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三、登革出血热的发病机制
DHF或DSS多发生在第2次感染异型DEN的患者或母亲抗DEN抗体阳性的婴儿中，病死率高。因此其发病机制一直是国内外研究的重要课题，但至今还没有完全阐明。概括许多学者研究的结果提出了以下几种发病机制[8，9]。
(一)依赖抗体增强感染(ADE)作用 ADE学说认为：当感染某一型DEN后产生的抗体能与所有四型的DEN起交叉反应。这些异型抗体或亚中和浓度的抗体，虽然能与病毒颗粒相结合，却不能起中和作用，而是形成病毒抗体复合物，并通过IgG的Fc受体(FcR)结合到单核细胞系表面，随着吞噬作用病毒进入细胞内，并在细胞内繁殖，引起单核细胞系感染。被DEN感染的单核巨噬细胞系又被机体的免疫清除反应和一些内源性刺激物所激活，释放出裂解补体3(C3)的酶、血管通透因子和凝血致活酶，进而导致弥漫性血管内凝血(DIC)、出血、休克等一系列病理过程。现已阐明，DEN颗粒和相应的IgG抗体形成的病毒抗体复合物主要是通过IgG Fc段吸附到细胞上导致感染增强作用。
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(二)细胞免疫作用 近年来人们发现细胞免疫在DHF/DSS形成中也起重要的作用。(1)CD4+、CD8-细胞：这类细胞在病毒感染中辅助B细胞产生抗体，人们推测在DEN感染所致的DHF/DSS发病机制中，宿主细胞的交叉免疫反应可能与之有关。Kurane等研究表明，CD4+、CD8-特异性T细胞具有辅助活性，在增殖反应中能产生IFN-γ,而后者可促进单核细胞FcR的表达，从而增强感染。(2)CD4-、CD8+、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：国外学者报道用DEN4型免疫人的外周血单个核细胞(PBMC)，在体外再用DEN4型刺激，可产生特异性且具有血清型交叉反应性的CD4-、CD8+表型的CTL克隆株，它们能溶解DEN感染的细胞和接触过所有四型DEN抗原的细胞。另有报道表明在DHF、DSS患者中CD8+T细胞的活化程度明显高于登革热患者，所以具有型交叉反应的CD8+毒性T细胞可能是DEN第二次感染期间导致免疫病理的主要介导物之一。
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(三)细胞因子的作用 近年来人们也发现在DHF发病机制研究中，一些DEN诱导的细胞因子也起一定的作用。Krishnamurti等研究表明用DEN感染人的单核细胞后，能使尿激酶的抑制物(PA1～2)浓度升高，从而影响纤维蛋白的溶解，促进纤维蛋白沉积，导致出血。另有学者也报道DEN感染的小鼠其淋巴细胞、巨噬细胞可分别产生抑制因子SF1和3SF2，从而抑制一系列免疫反应；DEN感染的小鼠脾T细胞能产生细胞毒因子CF1和CF2，可导致免疫系统损伤，使特异和非特异免疫功能均下降。体内研究也表明感染DEN会导致各类T细胞的激活并释放细胞因子IL-2,IFN-γ、组胺，过敏素C3a、C5a等，可引起感染加重、休克、循环衰竭和出血等表现。
上述这些机制可以解释大多数的DHF/DSS的发病机制，但对于第一次感染DEN出现的DHF/DSS患者却无法解释。总之，对于DHF/DSS的发病机制还有待进一步研究。
四、登革病毒的基因诊断
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DEN感染的诊断，过去主要依靠病毒分离和血清学检测，这些方法比较繁琐、费事，而且早期性，敏感性和特异性都较差。近年来逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交等新技术的建立，使对DEN的诊断进入到分子生物学的新阶段。应用RT-PCR检测DEN国内外均有报道，有的学者应用一对通用引物来扩增，可以同时检测DEN四个型的病毒，然后应用内引物鉴别四个型，或者应用核酸杂交和酶切分析的方法来进一步鉴定。有的学者合成了型特异的引物，每一对引物检测一个型别。Laille等[10]应用RT-PCR的方法证明了6例患者同时感染DEN1型和3型，且用特异性探针杂交法进一步证实这6例患者确为双重感染。Lanciotti等[11]设计了一对通用引物，可以同时扩增4个型的DEN，最后用型特异探针杂交或用型特异引物作套式PCR，可以鉴别4个型的DEN。
原位杂交技术已被作为诊断病毒性疾病及其发病机制研究的一个重要手段，它是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。Killen等[12]报道应用原位杂交技术检测了不同血清型DEN RNA；临床上，应用该方法从DHF患者的白细胞涂片以及DSS死者胸腺切片中检出DEN RNA。同时比较了长、短两种基因探针的敏感性，结果表明：长探针(260 bp)杂交实验敏感性更高，能够测出更多的受染细胞。
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总之，应用分子生物学技术检测DEN基因为该类疾病的早期快速诊断和监测流行提供了先进可靠的方法，对DEN作进一步的分子病毒学研究具有重要意义。
五、登革热的预防和控制
登革热的预防主要是防止传染源的传入、传播媒介的控制和疫苗的接种。目前主要是依靠蚊媒控制的办法来预防和控制登革热的传播。但是真正控制登革热流行的关键在于疫苗的研制成功。
国外学者研究得较早的是减毒活疫苗、DEN1～4型混合的减毒活疫苗在志愿者体内试用，已获得较好的免疫效果[13]。但减毒株的稳定性差，如果减毒不充分的话，有可能引起临床症状，且可能发生因ADE而导致的登革热和DSS的潜在危险。因此近年来，人们注意亚单位疫苗的研究。Zhao等[14]将DEN4型的结构蛋白及非结构蛋白NS1插入痘苗病毒载体成功地表达了PreM-E-NS1融合蛋白，并对动物有较好的免疫保护作用。一般认为，ADE与病毒的结构蛋白有关，因此非结构蛋白NS1产生疫苗可能不会诱导ADE。Schlesinger等[6]从感染细胞中纯化DEN2型的NS1接种小鼠后，可保护小鼠免受脑内病毒攻击，接种猴子后，再用致死剂量的病毒攻击，有4/5可获得保护。Zhang等[15]利用重组杆状病毒表达了DEN4型的NS1基因，用其免疫小鼠后，可抵抗同型病毒的致死性脑内攻击。
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近年来，国外学者对建立DEN全基因感染cDNA克隆和嵌合病毒疫苗作了报道[16～18]，DEN4型感染性全基因cDNA克隆已构建成功，并用DEN1型或DEN2型的结构蛋白取代DEN4型cDNA克隆的结构蛋白而产生两型内嵌合病毒。两个子代嵌合病毒显示出DEN1型或DEN2型的血清型特异性。DEN1/DEN4嵌合疫苗接种恒河猴实验表明，有3/4的猴产生了针对DEN1型的中和抗体，并能够抵抗DEN1型的攻击，DEN2/DEN4嵌合疫苗接种4只猴子，全部产生了中和抗体，并能够抵抗DEN2的攻击。研究结果提示：这种嵌合病毒疫苗将有可能研制成为人类DEN的减毒活疫苗。
核酸疫苗技术是近年来兴起的第三代疫苗技术，它为亚单位疫苗的研究提供了一条新的途径，它既有重组亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗诱导免疫应答的高效力。因此已有学者开始将它引入DEN疫苗的研究之中。相信不久将来，在DEN疫苗的研究中会有新的突破。
综上所述，近年来全世界每年约有2.5亿人受到登革热的威胁。由于城市化扩大，人口的快速增长，垃圾处理不当，国际旅游增多，使DEN感染具有扩大的趋势，发病率不断增高。因此国内外学者对DEN的研究非常重视，但目前，登革热的发病机制，特效治疗以及疫苗等问题尚未根本解决，其流行规律、宿主动物等尚不清楚，还有待进一步的探索研究
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参考文献
1，Mandl CW,Guirakhoo F,Holzmann H,et al.Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level,using tick-borne encephalits virus as a model.J Virol,1989,63:564-571.
2，Gollins SW,Porterfield JS.Flavivirus infection enhancement in
macrophages:an electron microscopic study of viral cellular entry.J Gen Virol,1985,66:1969-1982.
3，Gollins SW,Porterfield JS.A new mechanism for the neutralization of enveloped viruses by an antiviral antibody.Nature,1986,321:244-246.
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4，Kimura T,Ohyama A.Association between the pH-dependent conformational change of West Nile flavivirus E protein and virus-mediated membrane fusion.J Gen Virol,1988,69:1247-1254.
5，Randolph VB,Winkler G,Stollar V.Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein.Virology,1990,174:450-458.
6，Schlesinger JJ,Brandriss MW,Walsh EE.Protection of mice against dengue 2 virus encephalitis by immunization with the dengue 2 virus non-structural glycoprotein NS1.J Gen Virol,1987,68:853-857.
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收稿日期：1999-03-02, 百拇医药