实验性肝坏死中肿瘤坏死因子、内皮素及一氧化氮的协同作用
作者：黄以群 王崇国 周明行
单位：黄以群 王崇国(362000 福建泉州，解放军第180医院肝病研究中心)；周明行(第二军医大学附属长征医院)
关键词：
中华传染病杂志000215 肿瘤坏死因子(TNF-α)是由激活的巨噬细胞和单核细胞、淋巴细胞产生的一种多肽，在肝坏死中占有重要地位。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是目前已知的缩血管活性最强的多肽物质，参与循环、消化、呼吸等系统的生理病理功能调节。一氧化氮(Nitric oxide,NO)为L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)催化下脱去胍基末端氮原子与分子氧结合而成的无机小分子化合物，在肝坏死时肝细胞、库普弗细胞中NO含量明显增多，我们采用实验性鼠肝坏死的方法，对三者在肝坏死中的关系进行了探讨。
材料与方法
, 百拇医药
一、实验动物
雄性SD大鼠，体重140～200 g，分笼喂养，食水不限，购自上海西普尔地凯实验有限公司。
二、实验方法
(一) 实验分组 52只SD大鼠随机分成A、B、C、D、E五组。A组(阳性对照组)：大鼠12只，以D-氨基半乳糖(D-Gal N，由重庆医科大学化学教研室提供，批号：91420)1 100 mg/kg(配成10%溶液，pH值7.0)腹腔注射；B组(TNF-α拮抗组)：大鼠10只，以上述剂量D-Gal N和抗-TNF-α McAb(购于Boehringer Mannheim公司)10 μg/kg同时腹腔注射；C组(ET-1拮抗组)：以等量D-Gal N和抗ET-1抗体(Bosentan 10 mol/L，购于Sigma公司)20 ml同时腹腔注射；D组(NO拮抗组)：以等量D-Gal N和L-硝基精氨酸甲酯(L-NNA,Sigma公司)80 mg/kg同时腹腔注射；E组(阴性对照组)：仅以等量生理盐水腹腔注射。
, 百拇医药
(二) 实验检测 以上各组大鼠均于注射后48 h断头取血测丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)；ET-1、TNF-α检测采用放射免疫法，试剂均购自北京解放军总医院长城免疫技术所，按说明书操作；NO检测采用荧光法，试剂购自解放军军事医学科学院，按说明书操作。剖腹取肝脏作光镜病理检查，病理分级标准为：-或±为正常或轻度肝细胞变性；+为肝细胞呈点状坏死，门管区炎症细胞浸润；++为肝细胞呈小灶坏死；+++为肝组织亚大块出血坏死；++++为肝组织大块出血坏死。
三、统计学处理
实验数据以
±s表示，采用t检验、χ2检验及直线相关分析。
结果
一、血清ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO的检测结果
, 百拇医药
从表1中得知，经大鼠腹腔注射D-Gal N后(A组)，不仅ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO均明显高于B、C、D组，且A组中TNF-α与ET-1及NO呈正相关(r=0.939和0.990)；而B组阻断TNF-α、C组经阻断ET-1、D组经阻断NO的作用后，三组虽与E组(阴性对照组)对比肝功能仍明显升高(P<0.01)，但与A组对比肝功能已有明显恢复(P<0.05)。
二、五组肝脏组织的病变程度
见表2。
表1 5组血清中ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO的检测结果 组别
只数
ALT(U/L)
TBil(μmol/L)
, http://www.100md.com
TNF-α(μg/L)
ET-1(μg/L)
NO(μmol/L)
A
12
803±73
27.35±7.75
1.28±0.46
123.6±48.7
29.4±10.3
B
10
, 百拇医药
139±58*
19.6±8.78* *
0.53±0.34*
79.39±12.27*
16.8±12.5*
C
10
255±66*
21.68±7.67* *
0.92±0.45△
, http://www.100md.com
65.38±14.56*
21.2±13.8△
D
10
273±81*
21.43±6.43* *
0.95±0.47△
91.33±21.56△
12.3±9.2*
E
, http://www.100md.com
10
26±11
8.44±2.46
0.68±0.22
68.21±11.37
14.2±7.8
与A组对比*P<0.01,* *P<0.05,△P>0.05
表2 5组肝脏组织的病变程度
组别
只数
肝脏病变程度
, http://www.100md.com
-或±
+
++
+++
++++
A
12
0
3
7
1
1
B
10
, http://www.100md.com
0
6
4
0
0
C
10
0
6
3
1
0
D
10
, 百拇医药
0
5
4
1
0
E
10
10
0
0
0
0
B、C、D组与A组比较P<0.05讨论
, 百拇医药 本研究结果表明，在D-Gal N造成肝脏损伤坏死后，血清中TNF-α、ET-1及NO均较阴性对照组明显升高，且三者含量变化呈显著正相关。推测肝坏死中TNF-α、ET-1及NO三者间有协同作用。在B、C、D组中经拮抗TNF-α(B组)的作用后，TNF-α、ET-1及NO的含量均明显低于A组(P<0.01或0.05)，肝脏病理损伤也比A组显著减轻，经拮抗ET-1(C组)及NO(D组)作用后，除相应被拮抗的指标明显低于A组(P<0.01)外，其他二项指标与A组比较差异无显著性。但肝脏损伤程度均比A组明显减轻(P<0.05)，证明在D-Gal N造成的肝损伤后经分别选择性抑制TNF-α、ET-1及NO的作用后，肝损伤有明显减轻，提示：TNF-α、ET-1及iNOS和其合成的NO对肝细胞的损伤既有独立又有协同的作用。文献报道TNF-α、ET-1及NO各自在肝坏死中的作用，我们的研究结果不仅支持这一观点，而且进一步揭示它们之间在肝坏死中的密切关系。TNF-α不仅是肝坏死的重要介质，而且可通过增加肝脏贮脂细胞及巨噬细胞上的iNOS的表达，增加NO的合成。Rockey等[1]在实验细胞因子如IL-1、TNF-α等单一与肝脏贮脂细胞(Ito细胞)培育时，均不能或很少刺激Ito细胞激活iNOS mRNA生成； 但NO在与IL-1、TNF-α一起刺激Ito细胞后，iNOS则明显增高，并且NO对贮脂细胞的收缩作用可以检测到，当Ito细胞与TNF-α培育时，所发生的细胞收缩作用(被NO所引起)又可以为血清或ET-1所阻断。他们认为NO是Ito细胞收缩的强力调节因子，在肝损伤中起重要作用，而ET-1是通过肝细胞上的ET受体发挥血管收缩作用，从而加重肝细胞缺氧、水肿等使肝细胞发生损害。Ohuchi等[2]在以D-Gal N-内毒素(LPS)诱导的大鼠肝坏死中证明D-Gal N-LPS只是早期引起肝脏血管收缩，但肝脏损伤的发展是通过ET-1引起微血管紊乱所介导的。
, 百拇医药
本研究显示，在D-Gal N造成肝坏死中TNF-α、ET-1及NO含量均明显升高的同时，肝功能及肝脏病理损伤严重，而经拮抗TNF-α、ET-1及NO的作用后，TNF-α、ET-1及NO的含量明显下降的同时，肝功能及肝脏损伤明显减轻，揭示TNF-α、ET-1及NO在肝坏死机制中的重要作用，为临床寻找有效的预防及治疗手段提供了重要的实验依据。
参考文献
1，Rockey DC,Chung JJ.Inducible nitric oxide synthase in rat hepatic lipocytes and the effect of nitric oxide on lipocytes contractility.J Clin Invest,1995,95:1199-1206.
2，Ohuchi T,Tada K,Akamatsu K.Endogenous ET-1 contributes to liver injury induced by galactosamine and endotoxin in isolated perfused rat liver.Am J Physiol,1995,268(6Pt+1):C997-1003.
收稿日期：1999-09-25, 百拇医药
单位：黄以群 王崇国(362000 福建泉州，解放军第180医院肝病研究中心)；周明行(第二军医大学附属长征医院)
关键词：
中华传染病杂志000215 肿瘤坏死因子(TNF-α)是由激活的巨噬细胞和单核细胞、淋巴细胞产生的一种多肽，在肝坏死中占有重要地位。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是目前已知的缩血管活性最强的多肽物质，参与循环、消化、呼吸等系统的生理病理功能调节。一氧化氮(Nitric oxide,NO)为L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)催化下脱去胍基末端氮原子与分子氧结合而成的无机小分子化合物，在肝坏死时肝细胞、库普弗细胞中NO含量明显增多，我们采用实验性鼠肝坏死的方法，对三者在肝坏死中的关系进行了探讨。
材料与方法
, 百拇医药
一、实验动物
雄性SD大鼠，体重140～200 g，分笼喂养，食水不限，购自上海西普尔地凯实验有限公司。
二、实验方法
(一) 实验分组 52只SD大鼠随机分成A、B、C、D、E五组。A组(阳性对照组)：大鼠12只，以D-氨基半乳糖(D-Gal N，由重庆医科大学化学教研室提供，批号：91420)1 100 mg/kg(配成10%溶液，pH值7.0)腹腔注射；B组(TNF-α拮抗组)：大鼠10只，以上述剂量D-Gal N和抗-TNF-α McAb(购于Boehringer Mannheim公司)10 μg/kg同时腹腔注射；C组(ET-1拮抗组)：以等量D-Gal N和抗ET-1抗体(Bosentan 10 mol/L，购于Sigma公司)20 ml同时腹腔注射；D组(NO拮抗组)：以等量D-Gal N和L-硝基精氨酸甲酯(L-NNA,Sigma公司)80 mg/kg同时腹腔注射；E组(阴性对照组)：仅以等量生理盐水腹腔注射。
, 百拇医药
(二) 实验检测 以上各组大鼠均于注射后48 h断头取血测丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)；ET-1、TNF-α检测采用放射免疫法，试剂均购自北京解放军总医院长城免疫技术所，按说明书操作；NO检测采用荧光法，试剂购自解放军军事医学科学院，按说明书操作。剖腹取肝脏作光镜病理检查，病理分级标准为：-或±为正常或轻度肝细胞变性；+为肝细胞呈点状坏死，门管区炎症细胞浸润；++为肝细胞呈小灶坏死；+++为肝组织亚大块出血坏死；++++为肝组织大块出血坏死。
三、统计学处理
实验数据以
±s表示，采用t检验、χ2检验及直线相关分析。结果
一、血清ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO的检测结果
, 百拇医药
从表1中得知，经大鼠腹腔注射D-Gal N后(A组)，不仅ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO均明显高于B、C、D组，且A组中TNF-α与ET-1及NO呈正相关(r=0.939和0.990)；而B组阻断TNF-α、C组经阻断ET-1、D组经阻断NO的作用后，三组虽与E组(阴性对照组)对比肝功能仍明显升高(P<0.01)，但与A组对比肝功能已有明显恢复(P<0.05)。
二、五组肝脏组织的病变程度
见表2。
表1 5组血清中ALT、TBil、TNF-α、ET-1及NO的检测结果 组别
只数
ALT(U/L)
TBil(μmol/L)
, http://www.100md.com
TNF-α(μg/L)
ET-1(μg/L)
NO(μmol/L)
A
12
803±73
27.35±7.75
1.28±0.46
123.6±48.7
29.4±10.3
B
10
, 百拇医药
139±58*
19.6±8.78* *
0.53±0.34*
79.39±12.27*
16.8±12.5*
C
10
255±66*
21.68±7.67* *
0.92±0.45△
, http://www.100md.com
65.38±14.56*
21.2±13.8△
D
10
273±81*
21.43±6.43* *
0.95±0.47△
91.33±21.56△
12.3±9.2*
E
, http://www.100md.com
10
26±11
8.44±2.46
0.68±0.22
68.21±11.37
14.2±7.8
与A组对比*P<0.01,* *P<0.05,△P>0.05
表2 5组肝脏组织的病变程度
组别
只数
肝脏病变程度
, http://www.100md.com
-或±
+
++
+++
++++
A
12
0
3
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1
B
10
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0
6
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C
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6
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D
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5
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1
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E
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B、C、D组与A组比较P<0.05讨论
, 百拇医药 本研究结果表明，在D-Gal N造成肝脏损伤坏死后，血清中TNF-α、ET-1及NO均较阴性对照组明显升高，且三者含量变化呈显著正相关。推测肝坏死中TNF-α、ET-1及NO三者间有协同作用。在B、C、D组中经拮抗TNF-α(B组)的作用后，TNF-α、ET-1及NO的含量均明显低于A组(P<0.01或0.05)，肝脏病理损伤也比A组显著减轻，经拮抗ET-1(C组)及NO(D组)作用后，除相应被拮抗的指标明显低于A组(P<0.01)外，其他二项指标与A组比较差异无显著性。但肝脏损伤程度均比A组明显减轻(P<0.05)，证明在D-Gal N造成的肝损伤后经分别选择性抑制TNF-α、ET-1及NO的作用后，肝损伤有明显减轻，提示：TNF-α、ET-1及iNOS和其合成的NO对肝细胞的损伤既有独立又有协同的作用。文献报道TNF-α、ET-1及NO各自在肝坏死中的作用，我们的研究结果不仅支持这一观点，而且进一步揭示它们之间在肝坏死中的密切关系。TNF-α不仅是肝坏死的重要介质，而且可通过增加肝脏贮脂细胞及巨噬细胞上的iNOS的表达，增加NO的合成。Rockey等[1]在实验细胞因子如IL-1、TNF-α等单一与肝脏贮脂细胞(Ito细胞)培育时，均不能或很少刺激Ito细胞激活iNOS mRNA生成； 但NO在与IL-1、TNF-α一起刺激Ito细胞后，iNOS则明显增高，并且NO对贮脂细胞的收缩作用可以检测到，当Ito细胞与TNF-α培育时，所发生的细胞收缩作用(被NO所引起)又可以为血清或ET-1所阻断。他们认为NO是Ito细胞收缩的强力调节因子，在肝损伤中起重要作用，而ET-1是通过肝细胞上的ET受体发挥血管收缩作用，从而加重肝细胞缺氧、水肿等使肝细胞发生损害。Ohuchi等[2]在以D-Gal N-内毒素(LPS)诱导的大鼠肝坏死中证明D-Gal N-LPS只是早期引起肝脏血管收缩，但肝脏损伤的发展是通过ET-1引起微血管紊乱所介导的。
, 百拇医药
本研究显示，在D-Gal N造成肝坏死中TNF-α、ET-1及NO含量均明显升高的同时，肝功能及肝脏病理损伤严重，而经拮抗TNF-α、ET-1及NO的作用后，TNF-α、ET-1及NO的含量明显下降的同时，肝功能及肝脏损伤明显减轻，揭示TNF-α、ET-1及NO在肝坏死机制中的重要作用，为临床寻找有效的预防及治疗手段提供了重要的实验依据。
参考文献
1，Rockey DC,Chung JJ.Inducible nitric oxide synthase in rat hepatic lipocytes and the effect of nitric oxide on lipocytes contractility.J Clin Invest,1995,95:1199-1206.
2，Ohuchi T,Tada K,Akamatsu K.Endogenous ET-1 contributes to liver injury induced by galactosamine and endotoxin in isolated perfused rat liver.Am J Physiol,1995,268(6Pt+1):C997-1003.
收稿日期：1999-09-25, 百拇医药