恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达
作者：方建民 余新炳 罗树红 徐劲 李学荣
单位：510089 广州，中山医科大学寄生虫病研究所
关键词：疟原虫，恶性；富组蛋白Ⅱ；基因表达
中华传染病杂志000210 【摘要】 目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ, HRP Ⅱ)基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应(PCR)扩增HRP Ⅱ全编码区基因，经Hind Ⅲ和Bam HI双酶切后定向克隆入带CMV启动子的真核高效表达载体pcDNA3，构建HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体；用脂质体法将重组载体转染HepG2肝癌细胞，经G418加压筛选后，收集阳性克隆细胞培养上清，表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果 成功构建HRP Ⅱ/pcDNA3真核表达载体，SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明，HRP Ⅱ表达产物相对分子质量约35 000，呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ单克隆抗体特异识别。结论 恶性疟原虫HRP Ⅱ全编码区基因在肝癌细胞HepG2中获得成功表达。
, 百拇医药
Cloning and expression of histidine-rich protein Ⅱ gene of Plasmodium falciparum
FANG Jianmin, YU Xinbing, LUO Shuhong, et al.
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
【Abstract】 Objective Plasmodium falciparum synthesizes and secretes histidine-rich proteins Ⅱ (HRP Ⅱ) into plasma during asexual blood stage of life cycle. HRP Ⅱ is an ideal diagnostic antigen for falciparum malaria. In this report, our purpose was to investigate gene expression of HRP Ⅱ in eukaryotic cells. Methods The entire coding region of HRP Ⅱ gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). PCR products were cut by Hind Ⅲ and Bam HI, and inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3. Recombinant vectors were transfected HepG2 cells by means of liposome. Positive clones were cultured and screened under the high level of G418. The supernatants of these clones were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting assay. Results HRP Ⅱ gene was successfully cloned into pcDNA3 vector. The results of SDS-PAGE and Western blotting assay showed:(1) the molecular weight of the expressed products was about 35 000, (2) HRP Ⅱ was secreted into culture supernatant by the signal peptide, (3) the expressed products could specifically bind with anti-HRP Ⅱ McAbs. Conclusion The findings suggested that HRP Ⅱ gene of Plasmodium falciparum had been successfully expressed in pcDNA3/HepG2 eukaryotic system.
, 百拇医药
【Key words】Plasmodium falciparum; Histidine-rich protein Ⅱ; Gene expression
富组蛋白Ⅱ(HRP Ⅱ)是恶性疟原虫无性期合成并分泌至红细胞外的一种水溶性糖蛋白[1]，它富含组氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，并存在丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组胺酸-组氨酸-丙氨酸-组胺酸-天冬氨酸(AHHAAD)串接重复序列[2，3]。实验表明，早在环状体开始发育后2～8 h内，即可探测到体外同步培养虫体的培养上清中HRP Ⅱ抗原，并随着红内期发育的不断进行，尤其是当裂殖体破裂时[1]，所释放的量呈不断增长趋势。因此，以HRP Ⅱ循环抗原作为靶分子，用来检测恶性疟原虫感染是理想方法[4]。我们在以往研究基础上，通过克隆HRP Ⅱ全编码区基因，探讨其在真核细胞中的表达，并对表达产物的生物学活性进行分析。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、材料
(一) 虫株、载体与菌株 恶性疟原虫(FCC1/HN株)、大肠杆菌TG1和肝癌细胞HepG2为本室保种，pcDNA3为InVitrogen公司产品。
(二) 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Hind Ⅲ和Bam HI购自Promega公司；抗HRP Ⅱ人工合成九肽(AHHAHHAAD)单克隆抗体为中国预防医学科学院寄生虫病研究所惠赠；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为华美生物工程公司产品；Lipofectin为Gibco BRL公司产品；丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺和TEMED均为Merck公司产品，其它均为国产分析纯级试剂。
(三) 培养基 胰蛋白胨、酵母抽提物为OXOID公司产品，RPMI 1640为Gibco BRL公司产品，HEPES为ALDRICH公司产品，G418为Boehringer Mannheim公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。
, 百拇医药
二、方法
(一) HRP Ⅱ全编码区基因的扩增 根据HRP Ⅱ完整基因序列[2，5]，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(P1 5′-GGCAAGCTTATGGTTTCCTTCTCAAAA-3′和P2 5′-GCGGGATCCTTAATGGCGTAGGCAATG-3′)，并在两端分别引入Hind Ⅲ和Bam HI切点。引物由上海生工生物工程有限公司合成，使用前经15%的PAGE纯化。在0.5 ml Eppendorf管中依次加入：32.75 μl双蒸水、5 μl 10×Buffer、5 μl 2 mmol/L dNTP、1 μl 25 μmol/L P1、1 μl 25 μ mol/L P2、2 μl恶性疟原虫基因组DNA和3 μl 25 mmol/L MgCl2,混匀。95°C预变性5 min，加入0.25 μl Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，石蜡油覆盖液面。扩增条件：94°C变性40 s、63°C退火40 s，72°C延伸60 s，循环30次后，72°C保温7 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
, http://www.100md.com
(二) HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体的构建与鉴定 将酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后的上述聚合酶链反应(PCR)产物和pcDNA3空质粒分别用Hind Ⅲ和Bam HI双酶切1 h，再经二乙氨乙基(DEAE)膜(Schleicher & Schuell公司产品)电泳回收。酶切PCR产物与载体按5∶1摩尔数比混合，在16°C条件下用T4 DNA连接酶连接过夜，随后转化氯化钙法制备的大肠杆菌TG1感受态细胞。随机挑取含氨苄西林转化平板上生长菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，进行双酶切和PCR鉴定。
(三) HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞 脂质体法，按产品说明书进行。采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，G418进行加压筛选、传代培养。收集阳性克隆细胞培养上清，并用葡聚糖凝胶(Dextran Gel 25)进行浓缩[6]。
(四) 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹分析 均按常规方法进行[7]。
, 百拇医药
结果
一、HRP Ⅱ全编码区基因的扩增和HRP Ⅱ/pcDNA3重组质粒的构建
利用自行设计的引物P1和P2，成功扩增出HRP Ⅱ全编码区基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约1.0 kb，与预期片段大小相符合，且无非特异扩增现象(图1)。从氨苄西林LB琼脂平板上随机挑取菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，Hind Ⅲ和Bam HI双酶切均切出1.0 kb和5.4 kb二个片段，前者为HRP Ⅱ外源基因，后者为pcDNA3载体，用PCR方法也扩增出1.0 kb同样大小的片段(图1)。由此表明，HRP Ⅱ全编码区基因已按正确方向克隆入真核载体pc-DNA3,HRP II/pcDNA3重组质粒构建成功。
1.λDNA/Hind Ⅲ标准分子量；2.pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI双酶切；3.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ酶切；4.HRP Ⅱ/pcDNA3经Bam HI酶切；5.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI酶切；6.HRP Ⅱ/pcDNA3的PCR扩增；7.恶性疟原虫(FCC1/NH株)基因组PCR扩增；8.PCR标准分子量
, 百拇医药
图1 HRP Ⅱ全编码区基因扩增和重组子鉴定
(1%琼脂糖凝胶电泳)
二、HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞
用脂质体法将重组质粒转染HepG2细胞，在G418加压选择培养下，从第4周开始形成细胞克隆，随机选择细胞集落进行克隆化培养，用高浓度G418加压筛选，并不断传代培养，结果从中筛选获得K1、K2和K3等克隆细胞株。
三、表达产物的生物活性鉴定
收集K1、K2和K3等克隆细胞的培养上清，经葡聚糖凝胶浓缩后，进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，进一步Western印迹分析表明，其中K1和K2克隆细胞株约在相对分子质量35 000处分别有一特异反应条带(图3)，与HRP Ⅱ的分子量理论计算值相一致，说明HRP Ⅱ基因在HepG2细胞中呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ人工合成九肽单克隆抗体特异识别，而K3、单纯HepG2细胞和pcDNA3空载质粒转化细胞的培养上清均无特异显色条带，说明K1和K2克隆细胞株中HRP Ⅱ基因获得成功表达。
, http://www.100md.com
1.HepG2细胞；2.pcDNA3转染HepG2细胞；3.K1细胞；4.K2细胞；5.K3细胞；6.低分子量蛋白标准物
图2 不同细胞培养上清的SDS-PAGE分析
1.HepG2细胞；2.pcDNA3转染HepG2细胞；3.K1细胞；4.K2细胞；5.K3细胞；6.低分子量蛋白标准物
图3 不同细胞培养上清的Western分析
讨论
HRP Ⅱ是恶性疟原虫组氨酸富集蛋白家族成员之一，是由无性血液期虫体和早期配子体合成，其可以从形态完整的感染红细胞中分泌入患者血液或虫体的培养上清中，而且分泌量占其合成总量的近50%[1]。因此，HRP Ⅱ成为恶性疟理想的诊断用抗原。此外，最近研究表明HRP Ⅱ能高效促进疟色素形成，有利于虫体在红细胞中存活[8]。充分研究探讨HRP Ⅱ的结构与功能，对疟疾的防治有重要意义。
, 百拇医药
国外报道，恶性疟原虫Itg2株和IMTM22株的HRP Ⅱ基因均为断裂基因，即在翻译起始区和信号肽区之间存在内含子序列[2，3]。我们已对恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRP Ⅱ基因全编码区序列进行了测定，发现其只有一个开放阅读框，即编码区内无内含子序列[5]。因此，我们直接用PCR扩增我国恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)的HRP Ⅱ基因用于克隆表达，而无需逆转录PCR获得其cDNA，本实验结果也进一步证明了这一点。
我们首次将HRP Ⅱ全编码区基因克隆入含CMV启动子的真核表达载体pcDNA3，并在HepG2细胞中获得成功表达。表达产物存在于细胞的培养上清中，表明HRP Ⅱ能通过信号肽的作用而分泌入细胞的培养上清中；Western免疫印迹证明，表达产物能被抗HRP Ⅱ单克隆抗体特异识别，证实表达产物具有抗原活性。HRP Ⅱ/pcDNA3/HepG2真核表达系统的建立，对深入研究HRP Ⅱ的结构与功能有重要意义。
, 百拇医药
本课题受国家“九五”攻关项目(96-906-04-06)和广东省青年自然科学基金项目(960123)资助
参考文献
1，Howard RJ, Uni S, Aikawa M, et al. Secretion of a malaria histidine-rich protein (Pf HRP II) from Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Cell Biol, 1986, 103:1269-1277.
2，Wellems TE, Howard RJ. Homologous genes encode two distinct histidine-rich proteins in a cloned isolate of Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:6065-6069.
, 百拇医药
3，Sullivan DJ Jr, Ayala YM, Goldberg DE. An unexpected 5′untranslated intron in the P.falciparum genes for histidine-rich proteins II and III. Mol Biochem Parasitol, 1996, 83:247-251.
4，Beadle C, Long GW, Weiss WR, et al. Diagnosis of malaria by detection of Plasmodium falciparum HRP-2 antigen with a rapid dipstick antigen-capture assay. Lancet, 1994, 343:564-568.
5，方建民，余新炳，罗树红，等.恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ基因克隆及测序.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17：124-128.
6，李成文，主编.现代免疫化学技术.第1版.上海：上海科学技术出版社，1992.6-7.
7，金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆(实验指南).第2版.北京：科学出版社，1992.880-897.
8，Sullivan DJ Jr, Gluzman LY, Goldberg DE. Plasmodium hemozion formation mediated by histidine-rich proteins. Science, 1996, 271:219-222.
收稿日期：1999-06-16, 百拇医药
单位：510089 广州，中山医科大学寄生虫病研究所
关键词：疟原虫，恶性；富组蛋白Ⅱ；基因表达
中华传染病杂志000210 【摘要】 目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ, HRP Ⅱ)基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应(PCR)扩增HRP Ⅱ全编码区基因，经Hind Ⅲ和Bam HI双酶切后定向克隆入带CMV启动子的真核高效表达载体pcDNA3，构建HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体；用脂质体法将重组载体转染HepG2肝癌细胞，经G418加压筛选后，收集阳性克隆细胞培养上清，表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果 成功构建HRP Ⅱ/pcDNA3真核表达载体，SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明，HRP Ⅱ表达产物相对分子质量约35 000，呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ单克隆抗体特异识别。结论 恶性疟原虫HRP Ⅱ全编码区基因在肝癌细胞HepG2中获得成功表达。
, 百拇医药
Cloning and expression of histidine-rich protein Ⅱ gene of Plasmodium falciparum
FANG Jianmin, YU Xinbing, LUO Shuhong, et al.
(Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
【Abstract】 Objective Plasmodium falciparum synthesizes and secretes histidine-rich proteins Ⅱ (HRP Ⅱ) into plasma during asexual blood stage of life cycle. HRP Ⅱ is an ideal diagnostic antigen for falciparum malaria. In this report, our purpose was to investigate gene expression of HRP Ⅱ in eukaryotic cells. Methods The entire coding region of HRP Ⅱ gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). PCR products were cut by Hind Ⅲ and Bam HI, and inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3. Recombinant vectors were transfected HepG2 cells by means of liposome. Positive clones were cultured and screened under the high level of G418. The supernatants of these clones were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting assay. Results HRP Ⅱ gene was successfully cloned into pcDNA3 vector. The results of SDS-PAGE and Western blotting assay showed:(1) the molecular weight of the expressed products was about 35 000, (2) HRP Ⅱ was secreted into culture supernatant by the signal peptide, (3) the expressed products could specifically bind with anti-HRP Ⅱ McAbs. Conclusion The findings suggested that HRP Ⅱ gene of Plasmodium falciparum had been successfully expressed in pcDNA3/HepG2 eukaryotic system.
, 百拇医药
【Key words】Plasmodium falciparum; Histidine-rich protein Ⅱ; Gene expression
富组蛋白Ⅱ(HRP Ⅱ)是恶性疟原虫无性期合成并分泌至红细胞外的一种水溶性糖蛋白[1]，它富含组氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，并存在丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组胺酸-组氨酸-丙氨酸-组胺酸-天冬氨酸(AHHAAD)串接重复序列[2，3]。实验表明，早在环状体开始发育后2～8 h内，即可探测到体外同步培养虫体的培养上清中HRP Ⅱ抗原，并随着红内期发育的不断进行，尤其是当裂殖体破裂时[1]，所释放的量呈不断增长趋势。因此，以HRP Ⅱ循环抗原作为靶分子，用来检测恶性疟原虫感染是理想方法[4]。我们在以往研究基础上，通过克隆HRP Ⅱ全编码区基因，探讨其在真核细胞中的表达，并对表达产物的生物学活性进行分析。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、材料
(一) 虫株、载体与菌株 恶性疟原虫(FCC1/HN株)、大肠杆菌TG1和肝癌细胞HepG2为本室保种，pcDNA3为InVitrogen公司产品。
(二) 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Hind Ⅲ和Bam HI购自Promega公司；抗HRP Ⅱ人工合成九肽(AHHAHHAAD)单克隆抗体为中国预防医学科学院寄生虫病研究所惠赠；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为华美生物工程公司产品；Lipofectin为Gibco BRL公司产品；丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺和TEMED均为Merck公司产品，其它均为国产分析纯级试剂。
(三) 培养基 胰蛋白胨、酵母抽提物为OXOID公司产品，RPMI 1640为Gibco BRL公司产品，HEPES为ALDRICH公司产品，G418为Boehringer Mannheim公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。
, 百拇医药
二、方法
(一) HRP Ⅱ全编码区基因的扩增 根据HRP Ⅱ完整基因序列[2，5]，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(P1 5′-GGCAAGCTTATGGTTTCCTTCTCAAAA-3′和P2 5′-GCGGGATCCTTAATGGCGTAGGCAATG-3′)，并在两端分别引入Hind Ⅲ和Bam HI切点。引物由上海生工生物工程有限公司合成，使用前经15%的PAGE纯化。在0.5 ml Eppendorf管中依次加入：32.75 μl双蒸水、5 μl 10×Buffer、5 μl 2 mmol/L dNTP、1 μl 25 μmol/L P1、1 μl 25 μ mol/L P2、2 μl恶性疟原虫基因组DNA和3 μl 25 mmol/L MgCl2,混匀。95°C预变性5 min，加入0.25 μl Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，石蜡油覆盖液面。扩增条件：94°C变性40 s、63°C退火40 s，72°C延伸60 s，循环30次后，72°C保温7 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
, http://www.100md.com
(二) HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体的构建与鉴定 将酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后的上述聚合酶链反应(PCR)产物和pcDNA3空质粒分别用Hind Ⅲ和Bam HI双酶切1 h，再经二乙氨乙基(DEAE)膜(Schleicher & Schuell公司产品)电泳回收。酶切PCR产物与载体按5∶1摩尔数比混合，在16°C条件下用T4 DNA连接酶连接过夜，随后转化氯化钙法制备的大肠杆菌TG1感受态细胞。随机挑取含氨苄西林转化平板上生长菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，进行双酶切和PCR鉴定。
(三) HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞 脂质体法，按产品说明书进行。采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，G418进行加压筛选、传代培养。收集阳性克隆细胞培养上清，并用葡聚糖凝胶(Dextran Gel 25)进行浓缩[6]。
(四) 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹分析 均按常规方法进行[7]。
, 百拇医药
结果
一、HRP Ⅱ全编码区基因的扩增和HRP Ⅱ/pcDNA3重组质粒的构建
利用自行设计的引物P1和P2，成功扩增出HRP Ⅱ全编码区基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约1.0 kb，与预期片段大小相符合，且无非特异扩增现象(图1)。从氨苄西林LB琼脂平板上随机挑取菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，Hind Ⅲ和Bam HI双酶切均切出1.0 kb和5.4 kb二个片段，前者为HRP Ⅱ外源基因，后者为pcDNA3载体，用PCR方法也扩增出1.0 kb同样大小的片段(图1)。由此表明，HRP Ⅱ全编码区基因已按正确方向克隆入真核载体pc-DNA3,HRP II/pcDNA3重组质粒构建成功。
1.λDNA/Hind Ⅲ标准分子量；2.pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI双酶切；3.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ酶切；4.HRP Ⅱ/pcDNA3经Bam HI酶切；5.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI酶切；6.HRP Ⅱ/pcDNA3的PCR扩增；7.恶性疟原虫(FCC1/NH株)基因组PCR扩增；8.PCR标准分子量
, 百拇医药
图1 HRP Ⅱ全编码区基因扩增和重组子鉴定
(1%琼脂糖凝胶电泳)
二、HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞
用脂质体法将重组质粒转染HepG2细胞，在G418加压选择培养下，从第4周开始形成细胞克隆，随机选择细胞集落进行克隆化培养，用高浓度G418加压筛选，并不断传代培养，结果从中筛选获得K1、K2和K3等克隆细胞株。
三、表达产物的生物活性鉴定
收集K1、K2和K3等克隆细胞的培养上清，经葡聚糖凝胶浓缩后，进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，进一步Western印迹分析表明，其中K1和K2克隆细胞株约在相对分子质量35 000处分别有一特异反应条带(图3)，与HRP Ⅱ的分子量理论计算值相一致，说明HRP Ⅱ基因在HepG2细胞中呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ人工合成九肽单克隆抗体特异识别，而K3、单纯HepG2细胞和pcDNA3空载质粒转化细胞的培养上清均无特异显色条带，说明K1和K2克隆细胞株中HRP Ⅱ基因获得成功表达。
, http://www.100md.com
1.HepG2细胞；2.pcDNA3转染HepG2细胞；3.K1细胞；4.K2细胞；5.K3细胞；6.低分子量蛋白标准物
图2 不同细胞培养上清的SDS-PAGE分析
1.HepG2细胞；2.pcDNA3转染HepG2细胞；3.K1细胞；4.K2细胞；5.K3细胞；6.低分子量蛋白标准物
图3 不同细胞培养上清的Western分析
讨论
HRP Ⅱ是恶性疟原虫组氨酸富集蛋白家族成员之一，是由无性血液期虫体和早期配子体合成，其可以从形态完整的感染红细胞中分泌入患者血液或虫体的培养上清中，而且分泌量占其合成总量的近50%[1]。因此，HRP Ⅱ成为恶性疟理想的诊断用抗原。此外，最近研究表明HRP Ⅱ能高效促进疟色素形成，有利于虫体在红细胞中存活[8]。充分研究探讨HRP Ⅱ的结构与功能，对疟疾的防治有重要意义。
, 百拇医药
国外报道，恶性疟原虫Itg2株和IMTM22株的HRP Ⅱ基因均为断裂基因，即在翻译起始区和信号肽区之间存在内含子序列[2，3]。我们已对恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)和越南株(VN)的HRP Ⅱ基因全编码区序列进行了测定，发现其只有一个开放阅读框，即编码区内无内含子序列[5]。因此，我们直接用PCR扩增我国恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)的HRP Ⅱ基因用于克隆表达，而无需逆转录PCR获得其cDNA，本实验结果也进一步证明了这一点。
我们首次将HRP Ⅱ全编码区基因克隆入含CMV启动子的真核表达载体pcDNA3，并在HepG2细胞中获得成功表达。表达产物存在于细胞的培养上清中，表明HRP Ⅱ能通过信号肽的作用而分泌入细胞的培养上清中；Western免疫印迹证明，表达产物能被抗HRP Ⅱ单克隆抗体特异识别，证实表达产物具有抗原活性。HRP Ⅱ/pcDNA3/HepG2真核表达系统的建立，对深入研究HRP Ⅱ的结构与功能有重要意义。
, 百拇医药
本课题受国家“九五”攻关项目(96-906-04-06)和广东省青年自然科学基金项目(960123)资助
参考文献
1，Howard RJ, Uni S, Aikawa M, et al. Secretion of a malaria histidine-rich protein (Pf HRP II) from Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Cell Biol, 1986, 103:1269-1277.
2，Wellems TE, Howard RJ. Homologous genes encode two distinct histidine-rich proteins in a cloned isolate of Plasmodium falciparum. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:6065-6069.
, 百拇医药
3，Sullivan DJ Jr, Ayala YM, Goldberg DE. An unexpected 5′untranslated intron in the P.falciparum genes for histidine-rich proteins II and III. Mol Biochem Parasitol, 1996, 83:247-251.
4，Beadle C, Long GW, Weiss WR, et al. Diagnosis of malaria by detection of Plasmodium falciparum HRP-2 antigen with a rapid dipstick antigen-capture assay. Lancet, 1994, 343:564-568.
5，方建民，余新炳，罗树红，等.恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ基因克隆及测序.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1999，17：124-128.
6，李成文，主编.现代免疫化学技术.第1版.上海：上海科学技术出版社，1992.6-7.
7，金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆(实验指南).第2版.北京：科学出版社，1992.880-897.
8，Sullivan DJ Jr, Gluzman LY, Goldberg DE. Plasmodium hemozion formation mediated by histidine-rich proteins. Science, 1996, 271:219-222.
收稿日期：1999-06-16, 百拇医药