伤寒杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础研究
作者：肖永红 王其南
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院
关键词：沙门菌，伤寒；旋转酶A；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性、单链构象多态性分析；脱氧核糖核酸序列
中华传染病杂志000209 【摘要】 目的 研究伤寒杆菌DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)变异与其耐喹诺酮类的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)及序列测定，对伤寒杆菌S275(临床分离敏感菌株)及其自发耐药突变株RG1，DNA gyrA喹诺酮类耐药决定区进行了研究。结果 伤寒杆菌S275 gyrA第128～426位碱基与大肠杆菌KL-16高度同源，仅7.49%有差异，且大部分为静变异，最终仅使DNA旋转酶A亚单位产生Thr-45→His、Arg-49→Leu及Val-56→Gly，均位于喹诺酮耐药决定区(第67～106位氨基酸)外。RG1仅有第247位碱基T→G变异，相应Ser-83→Ala，使萘啶酸、氧氟沙星及环丙沙星对伤寒杆菌的MIC由2、0.06、<0.03 mg/L上升为512、2、1 mg/L。Ala替换与文献报道沙门杆菌该位以苯丙氨酸、酪氨酸替换为主不同。PCR-RFLP及SSCP分析结果与上述情况类似。结论 gryA第83位变异为其耐药主要原因。
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A study on the molecular basis of quinolone resistance mechanism in salmonella typhi
XIAO Yonghong, WANG Qinan.
(The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the gene mutations of DNA gyrase subunit A (gyrA) and quinolone resistance in Salmonella typhi. Methods The genes of gyrA DNA of Salmonella typhi S275 (a clinically isolated quinolone susceptible strain) and its spontaneous quinolone-resistant mutant RG1 were examined in this study with polymerase chain reaction (PCR), restrictive fragments length polymorphism (RFLP), single strand conformational polymorphism (SSCP) and nucleotide sequencing. Results Nudeotide sequencing of gyrA in Salmonella typhi S275 revealed that the bases of 128～426 kept highly conservative as compared with those of Escherichia coli KL-16, with only 7.49% difference in the gyrA nucleotides 128～426 between the two strains. Most of the mutations were silent mutations,which contributed to 3 amino acid substitutions in gyrase (including Thr-45→His,Arg-49→Leu and Val-56→Gly), and all these substitutions were located outside the quinolone resistance determining region (amino acids 67-106 of subunit A of gyrase). In comparison with Salmonella typhi S275, a single mutation was found at base 247 of gyrA of Salmonella typhi RG1, with change transferred from T to G and led to a substitution of Ser-83→Ala. The mutation might be responsible for the increase of MICs of nalidixic acid, ofloxacin and ciprofloxacin against Salmonella typhi from 2,0.06 and <0.03 to 512, 2, and 1 mg/L respectively. Ser-83→Ala was also a newly discovered substitution in gyrA of Salmonella spp. The results of PCR-RFLP and SSCP were in concordance with results of nucleotide sequencing. Conclusions The mutation of gyrase at the 83rd amino acid maybe play a principal role in the resistance of Salmonella typhi to quinolone.
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【Key words】Salmonella typhi; gyrA; Polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism; Single strand conformational polymaphism; DNA Sequence
伤寒作为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物已受到广泛认可。近年来耐氟喹诺酮类伤寒杆菌已有报道[1]，我们在实验室利用平板法，从临床分离喹诺酮敏感伤寒杆菌S275筛选出两代耐药菌RG1、RG2，经研究证明，RG1耐药以DNA旋转酶变异与药物主动外流为主，RG2则在RG1基础上有外膜蛋白改变，表明细菌耐喹诺酮类多种机制均可在伤寒杆菌发生。
我们利用分子生物学技术对RG1 DNA旋转酶A(gyrA)与拓扑异构酶IV parC基因喹诺酮类耐药决定区进行了更深入的分子生物学调查，结果如下。
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材料与方法
一、菌株
伤寒杆菌S275为我院1996年临床患者血培养分离所得对喹诺酮类敏感的菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG1。挑取单个伤寒杆菌S275菌落接种于10 ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，1 000 ml含牛肉浸膏5 g，水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4 μg/ml(2×MIC)萘啶酸的Mueller-Hinton琼脂(MHA)，37°C温育48 h后，得耐药变异株RG1，与S275共同用于下列研究。
二、抗菌药物及主要试剂
氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供，环丙沙星(CPFX)为太原制药厂提供，萘啶酸(NA)购自Sigma公司。
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扩增DNA gyrA上游引物为：5′-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3′，位于大肠杆菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCAACG-3′与大肠杆菌gyrA 435～454位碱基互补。拓扑异构酶IV亚单位C基因(parC)上游引物为5′-GTATGCGATGTCTGAACTGG-3′，位于大肠杆菌parC基因第72～92位碱基；下游引物5′-GTGGTGCCGTTAAGCAAA-3′与大肠杆菌parC基因第427～444位碱基互补。上述引物均委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶Hinf Ⅰ、Wizard聚合酶链反应(PCR)产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。
三、药敏试验
以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为104～105CFU/ml，37°C温育18 h后观察结果，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
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四、PCR扩增gyrA与parC
按参考文献[2]方法。1 ml过夜培养伤寒杆菌10 000×g，5 min收集沉淀，加入600 μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10%十二烷基硫酸钠(SDS) 30 μl， 37°C温育1 h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿抽提后作模板DNA。50 μl反应混合物含10 mmol Tris HCl (pH 9.0)、50 mmol KCl、0.1% Triton X-100、1.5 mmol MgCl2、0.2 mmol dNTP、1U Taq酶、上下游引物各50 pmol、DNA模板2 μl。初始循环94°C、1.5 min,60°C、2 min,72°C、3 min；后续94°C、1 min,60°C、1 min,72°C、3 min，30循环；最后72°C延伸15 min。产物以2%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR 322/Hinf Ⅰ片段。
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五、gyrA PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及单链构象多态性(SSCP)分析[3]
RFLP分析反应混合物(20 μl)含2.5 mmol Tris醋酸(pH7.8), 10 mmol醋酸钾、1 mmol醋酸镁、0.1 mmol二硫苏糖醇、Hinf Ⅰ 5U及PCR扩增产物5 μl 37°C温育4 h后，3%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR322/Bst NI片段。
SSCP分析用PCR产物5 μl，加DNA变性液(含95%甲酰胺、20 mmol依地酸(EDTA)、0.03%二甲苯蓝FF，及0.05%溴酚蓝)5 μl，80°C变性5 min后置冰浴，再于8%聚丙烯酰胺凝胶，15°C电泳。用银染试剂盒，按产品指南行银染色，观察结果。
六、PCR产物测序
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利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA、parC PCR产物，纯化产物以前述引物为引物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI 310型自动测序仪测序。
结果
一、药敏试验
NA、OFLX、CPFX对S275与RG1的MIC值分别为2、0.06、<0.03与512、2、1 mg/L。
二、gryA与parC PCR扩增结果
gyrA为347 bp DNA片段，parC为372 bpDNA片段。
三、gryA PCR-RFLP与SSCP结果
Hinf Ⅰ酶切伤寒杆菌S275 gyrA为138、110、99 bp三个片段，RG1仅有237、110 bp二个片段。伤寒杆菌S275 gyrA SSCP分析可见两条核酸带，而RG1仅有一条核酸带。示RG1 gyrA有碱基变异。
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四、DNA测序结果及推定氨基酸序列
见图1。伤寒杆菌S275 gyrA序列与大肠杆菌KL-16高度同源，仅有23个碱基差异，占7.49%。伤寒杆菌RG1仅于247位由T变异为G。图2示伤寒杆菌gyrA推定氨基酸序列，与大肠杆菌KL-16比较仅有3个氨基酸差异，第45、49、56位氨基酸分别为Thr→His、Arg→Leu、Val→Gly变异，伤寒杆菌RG1第83位氨基酸为Ser→Ala变异[4]。
伤寒杆菌S275与RG1 parC序列两者相同。
图1 伤寒杆菌gyrA耐喹诺酮类决定区核苷酸序列
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图2 伤寒杆菌GyrA推定氨基酸序列
讨论
DNA旋转酶为喹诺酮类抗革兰阴性菌的第一靶位，通过DNA旋转酶、DNA、喹诺酮药物三者形成复合物，阻止DNA超旋型的转化，产生杀菌作用。DNA旋转酶A亚单位变异是细菌产生耐药的主要原因，据A亚单位基因(gyrA)序列分析，耐药菌变异常位于旋转酶A亚单位67～106位氨基酸，即所谓耐喹诺酮类决定区，其中尤以83、87位氨基酸变异最为频繁。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌83位均为丝氨酸，耐药大肠杆菌、金黄色葡萄球菌多被亮氨酸所替代，该位点因亲水性降低而耐药[3，5，6]。
本研究表明，在所测定gyrA序列范围内，伤寒杆菌与大肠杆菌KL-16有高度同源性，其碱基仅有23个差异，占7.49%，其中18个碱基改变为保守变异，不伴有氨基酸替换。推定氨基酸序列比较，两者同源性达97.03%，仅第45、49、56位氨基酸不同，均位于喹诺酮类耐药决定区外，耐药菌RG1与S275相比，gyrA第247位碱基由T→G，导致旋转酶A亚单位第83位氨基酸由丝氨酸为丙氨酸所替代，该位点极性降低及空间构象改变，使萘啶酸、氧氟沙星、环丙沙星MIC由2、0.06、<0.03上升为512、2、1 mg/L。Griggs等[6]报道耐药沙门杆菌、伤寒杆菌第83位变异多以苯丙氨酸、酪氨酸为主，无丙氨酸替换，不同氨基酸替换在耐药水平有何差异尚待研究。
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利用PCR-RFLP分析检测gyrA 83位密码子变异，在其它细菌已有报道[3]。多数细菌gyrA该位点周围有GANTC的碱基顺序，因此，利用Hinf Ⅰ能特异识别该序列并将之切断的特性，较易检测变异。从序列分析来看，伤寒杆菌S275 gyrA 244～248与343～347位碱基含有该序列，经Hinf Ⅰ酶水解为138、110、99 bp三片段，RG1则因247位T→G变化，酶切点消失，则只有237、110 bp两片段。利用PCR-RFLP分析对检测83位氨基酸变异具有快速、简便、准确等优点。
PCR-SSCP分析利用DNA变性剂，使双链DNA成为单链，并能对仅有一个碱基差异的DNA片段加以区分[7]。本研究利用该办法，显示在伤寒杆菌S275与RG1间，因gryA第247位碱基差异，PCR-SSCP分析结果有明显不同。且文献报道在gyrA不同碱基变异有不同电泳结果，表明该方法可用于快速检测gyrA点突变。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(39400170)
参考文献
1，Wain J, Hoa NT, Chinh NT, et al. Quinolone-resistant Salmonella typhi in Viet Nam:molecular basis of resistance and clinical response to treatment. Clin Infect Dis, 1997, 25:1401-1410.
2，Sambrook J, Fritsch EF, Maniativ T. Molecular cloning:a laboratory manual, 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
3，Wang T, Tanaka M, Sato K. Detection of grlA and gyrA mutations in 344 Staphylococcus aureus strains. Antimicrob Agent Chemother, 1998, 42:236-240.
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4，Yoshida H, Kojima T, Yamagishi J, et al. Quinolone-resistant mutations of the gyrA gene of Escherichia coli. Mol Gen Genet, 1988, 211:1-7.
5，Everett MJ, Jin YF, Ricci V, et al. Contributions of individual mechanisms to fluoroquinolone resistance in 36 Escherichia coli strains isolated from humans and animals. Antimicrob Agents Chemother, 1996, 40:2380-2386.
6，Griggs DJ, Gensberg K, Piddock LJ. Mutations in gyrA gene of quinolone-resistant Salmonella serotypes isolated from humans and animals. Antimicrob Agent Chemother, 1996, 40:1009-1013.
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7，Ouabdesselam S, Hooper DC, Tankovic J, et al. Detection of gyrA and gyrB mutations in quinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli by single strand conformational polymorphism analysis and determination of levels of resistance conferred by two different single gyrA mutations. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39:1667-1670.
收稿日期：1999-12-02, http://www.100md.com
单位：400016 重庆医科大学附属第一医院
关键词：沙门菌，伤寒；旋转酶A；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性、单链构象多态性分析；脱氧核糖核酸序列
中华传染病杂志000209 【摘要】 目的 研究伤寒杆菌DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)变异与其耐喹诺酮类的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)检测、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)及序列测定，对伤寒杆菌S275(临床分离敏感菌株)及其自发耐药突变株RG1，DNA gyrA喹诺酮类耐药决定区进行了研究。结果 伤寒杆菌S275 gyrA第128～426位碱基与大肠杆菌KL-16高度同源，仅7.49%有差异，且大部分为静变异，最终仅使DNA旋转酶A亚单位产生Thr-45→His、Arg-49→Leu及Val-56→Gly，均位于喹诺酮耐药决定区(第67～106位氨基酸)外。RG1仅有第247位碱基T→G变异，相应Ser-83→Ala，使萘啶酸、氧氟沙星及环丙沙星对伤寒杆菌的MIC由2、0.06、<0.03 mg/L上升为512、2、1 mg/L。Ala替换与文献报道沙门杆菌该位以苯丙氨酸、酪氨酸替换为主不同。PCR-RFLP及SSCP分析结果与上述情况类似。结论 gryA第83位变异为其耐药主要原因。
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A study on the molecular basis of quinolone resistance mechanism in salmonella typhi
XIAO Yonghong, WANG Qinan.
(The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between the gene mutations of DNA gyrase subunit A (gyrA) and quinolone resistance in Salmonella typhi. Methods The genes of gyrA DNA of Salmonella typhi S275 (a clinically isolated quinolone susceptible strain) and its spontaneous quinolone-resistant mutant RG1 were examined in this study with polymerase chain reaction (PCR), restrictive fragments length polymorphism (RFLP), single strand conformational polymorphism (SSCP) and nucleotide sequencing. Results Nudeotide sequencing of gyrA in Salmonella typhi S275 revealed that the bases of 128～426 kept highly conservative as compared with those of Escherichia coli KL-16, with only 7.49% difference in the gyrA nucleotides 128～426 between the two strains. Most of the mutations were silent mutations,which contributed to 3 amino acid substitutions in gyrase (including Thr-45→His,Arg-49→Leu and Val-56→Gly), and all these substitutions were located outside the quinolone resistance determining region (amino acids 67-106 of subunit A of gyrase). In comparison with Salmonella typhi S275, a single mutation was found at base 247 of gyrA of Salmonella typhi RG1, with change transferred from T to G and led to a substitution of Ser-83→Ala. The mutation might be responsible for the increase of MICs of nalidixic acid, ofloxacin and ciprofloxacin against Salmonella typhi from 2,0.06 and <0.03 to 512, 2, and 1 mg/L respectively. Ser-83→Ala was also a newly discovered substitution in gyrA of Salmonella spp. The results of PCR-RFLP and SSCP were in concordance with results of nucleotide sequencing. Conclusions The mutation of gyrase at the 83rd amino acid maybe play a principal role in the resistance of Salmonella typhi to quinolone.
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【Key words】Salmonella typhi; gyrA; Polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism; Single strand conformational polymaphism; DNA Sequence
伤寒作为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物已受到广泛认可。近年来耐氟喹诺酮类伤寒杆菌已有报道[1]，我们在实验室利用平板法，从临床分离喹诺酮敏感伤寒杆菌S275筛选出两代耐药菌RG1、RG2，经研究证明，RG1耐药以DNA旋转酶变异与药物主动外流为主，RG2则在RG1基础上有外膜蛋白改变，表明细菌耐喹诺酮类多种机制均可在伤寒杆菌发生。
我们利用分子生物学技术对RG1 DNA旋转酶A(gyrA)与拓扑异构酶IV parC基因喹诺酮类耐药决定区进行了更深入的分子生物学调查，结果如下。
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材料与方法
一、菌株
伤寒杆菌S275为我院1996年临床患者血培养分离所得对喹诺酮类敏感的菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG1。挑取单个伤寒杆菌S275菌落接种于10 ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，1 000 ml含牛肉浸膏5 g，水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4 μg/ml(2×MIC)萘啶酸的Mueller-Hinton琼脂(MHA)，37°C温育48 h后，得耐药变异株RG1，与S275共同用于下列研究。
二、抗菌药物及主要试剂
氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供，环丙沙星(CPFX)为太原制药厂提供，萘啶酸(NA)购自Sigma公司。
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扩增DNA gyrA上游引物为：5′-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3′，位于大肠杆菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCAACG-3′与大肠杆菌gyrA 435～454位碱基互补。拓扑异构酶IV亚单位C基因(parC)上游引物为5′-GTATGCGATGTCTGAACTGG-3′，位于大肠杆菌parC基因第72～92位碱基；下游引物5′-GTGGTGCCGTTAAGCAAA-3′与大肠杆菌parC基因第427～444位碱基互补。上述引物均委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶Hinf Ⅰ、Wizard聚合酶链反应(PCR)产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。
三、药敏试验
以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为104～105CFU/ml，37°C温育18 h后观察结果，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
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四、PCR扩增gyrA与parC
按参考文献[2]方法。1 ml过夜培养伤寒杆菌10 000×g，5 min收集沉淀，加入600 μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10%十二烷基硫酸钠(SDS) 30 μl， 37°C温育1 h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿抽提后作模板DNA。50 μl反应混合物含10 mmol Tris HCl (pH 9.0)、50 mmol KCl、0.1% Triton X-100、1.5 mmol MgCl2、0.2 mmol dNTP、1U Taq酶、上下游引物各50 pmol、DNA模板2 μl。初始循环94°C、1.5 min,60°C、2 min,72°C、3 min；后续94°C、1 min,60°C、1 min,72°C、3 min，30循环；最后72°C延伸15 min。产物以2%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR 322/Hinf Ⅰ片段。
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五、gyrA PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及单链构象多态性(SSCP)分析[3]
RFLP分析反应混合物(20 μl)含2.5 mmol Tris醋酸(pH7.8), 10 mmol醋酸钾、1 mmol醋酸镁、0.1 mmol二硫苏糖醇、Hinf Ⅰ 5U及PCR扩增产物5 μl 37°C温育4 h后，3%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR322/Bst NI片段。
SSCP分析用PCR产物5 μl，加DNA变性液(含95%甲酰胺、20 mmol依地酸(EDTA)、0.03%二甲苯蓝FF，及0.05%溴酚蓝)5 μl，80°C变性5 min后置冰浴，再于8%聚丙烯酰胺凝胶，15°C电泳。用银染试剂盒，按产品指南行银染色，观察结果。
六、PCR产物测序
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利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA、parC PCR产物，纯化产物以前述引物为引物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI 310型自动测序仪测序。
结果
一、药敏试验
NA、OFLX、CPFX对S275与RG1的MIC值分别为2、0.06、<0.03与512、2、1 mg/L。
二、gryA与parC PCR扩增结果
gyrA为347 bp DNA片段，parC为372 bpDNA片段。
三、gryA PCR-RFLP与SSCP结果
Hinf Ⅰ酶切伤寒杆菌S275 gyrA为138、110、99 bp三个片段，RG1仅有237、110 bp二个片段。伤寒杆菌S275 gyrA SSCP分析可见两条核酸带，而RG1仅有一条核酸带。示RG1 gyrA有碱基变异。
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四、DNA测序结果及推定氨基酸序列
见图1。伤寒杆菌S275 gyrA序列与大肠杆菌KL-16高度同源，仅有23个碱基差异，占7.49%。伤寒杆菌RG1仅于247位由T变异为G。图2示伤寒杆菌gyrA推定氨基酸序列，与大肠杆菌KL-16比较仅有3个氨基酸差异，第45、49、56位氨基酸分别为Thr→His、Arg→Leu、Val→Gly变异，伤寒杆菌RG1第83位氨基酸为Ser→Ala变异[4]。
伤寒杆菌S275与RG1 parC序列两者相同。
图1 伤寒杆菌gyrA耐喹诺酮类决定区核苷酸序列
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图2 伤寒杆菌GyrA推定氨基酸序列
讨论
DNA旋转酶为喹诺酮类抗革兰阴性菌的第一靶位，通过DNA旋转酶、DNA、喹诺酮药物三者形成复合物，阻止DNA超旋型的转化，产生杀菌作用。DNA旋转酶A亚单位变异是细菌产生耐药的主要原因，据A亚单位基因(gyrA)序列分析，耐药菌变异常位于旋转酶A亚单位67～106位氨基酸，即所谓耐喹诺酮类决定区，其中尤以83、87位氨基酸变异最为频繁。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌83位均为丝氨酸，耐药大肠杆菌、金黄色葡萄球菌多被亮氨酸所替代，该位点因亲水性降低而耐药[3，5，6]。
本研究表明，在所测定gyrA序列范围内，伤寒杆菌与大肠杆菌KL-16有高度同源性，其碱基仅有23个差异，占7.49%，其中18个碱基改变为保守变异，不伴有氨基酸替换。推定氨基酸序列比较，两者同源性达97.03%，仅第45、49、56位氨基酸不同，均位于喹诺酮类耐药决定区外，耐药菌RG1与S275相比，gyrA第247位碱基由T→G，导致旋转酶A亚单位第83位氨基酸由丝氨酸为丙氨酸所替代，该位点极性降低及空间构象改变，使萘啶酸、氧氟沙星、环丙沙星MIC由2、0.06、<0.03上升为512、2、1 mg/L。Griggs等[6]报道耐药沙门杆菌、伤寒杆菌第83位变异多以苯丙氨酸、酪氨酸为主，无丙氨酸替换，不同氨基酸替换在耐药水平有何差异尚待研究。
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利用PCR-RFLP分析检测gyrA 83位密码子变异，在其它细菌已有报道[3]。多数细菌gyrA该位点周围有GANTC的碱基顺序，因此，利用Hinf Ⅰ能特异识别该序列并将之切断的特性，较易检测变异。从序列分析来看，伤寒杆菌S275 gyrA 244～248与343～347位碱基含有该序列，经Hinf Ⅰ酶水解为138、110、99 bp三片段，RG1则因247位T→G变化，酶切点消失，则只有237、110 bp两片段。利用PCR-RFLP分析对检测83位氨基酸变异具有快速、简便、准确等优点。
PCR-SSCP分析利用DNA变性剂，使双链DNA成为单链，并能对仅有一个碱基差异的DNA片段加以区分[7]。本研究利用该办法，显示在伤寒杆菌S275与RG1间，因gryA第247位碱基差异，PCR-SSCP分析结果有明显不同。且文献报道在gyrA不同碱基变异有不同电泳结果，表明该方法可用于快速检测gyrA点突变。
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本课题受国家自然科学基金资助(39400170)
参考文献
1，Wain J, Hoa NT, Chinh NT, et al. Quinolone-resistant Salmonella typhi in Viet Nam:molecular basis of resistance and clinical response to treatment. Clin Infect Dis, 1997, 25:1401-1410.
2，Sambrook J, Fritsch EF, Maniativ T. Molecular cloning:a laboratory manual, 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.
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收稿日期：1999-12-02, http://www.100md.com